黃霽月，王 聰，王應(yīng)祥,

(1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/ 嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實驗室,廣東 廣州 510642； 2 復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 上海 200438)

減數(shù)分裂是生殖細(xì)胞中產(chǎn)生單倍體配子的一種特殊細(xì)胞分裂方式，產(chǎn)生的雌雄配子通過受精融合后恢復(fù)至二倍體狀態(tài)，對基因組的穩(wěn)定性至關(guān)重要。同源染色體重組和染色單體的自由組合顯著促進(jìn)了后代的遺傳變異。然而，減數(shù)分裂重組在染色體上的分布和數(shù)量限制了育種進(jìn)程中的等位基因變異或整合。因此，改變減數(shù)分裂重組事件的數(shù)量和分布對改善和加快植物育種具有很大的應(yīng)用潛力。近年來，對植物減數(shù)分裂過程和重組的研究取得了很大進(jìn)展。在模式生物擬南芥Arabidopsis thaliana中，許多參與調(diào)控減數(shù)分裂染色體重組的因子被發(fā)現(xiàn)。模式植物擬南芥的研究顯著帶動了其他物種(包括水稻、大麥、玉米、小麥和蕓苔屬植物等)減數(shù)分裂的重組機(jī)制研究。因此，充分認(rèn)識植物減數(shù)分裂重組的分子遺傳基礎(chǔ)，并比較不同物種間的共性和特性，再結(jié)合現(xiàn)代分子育種技術(shù)，可以顯著拓展現(xiàn)代生物育種的方法。

1 減數(shù)分裂重組模型

1.1 染色質(zhì)上的重組骨架-牽回環(huán)-軸復(fù)合物的形成

基于電子顯微鏡、超分辨率顯微鏡和免疫熒光技術(shù)的應(yīng)用，主流的觀點接受減數(shù)分裂染色體重組的起始依賴于一種稱為牽回環(huán)-軸復(fù)合物(Tethered loop-axis complex)的染色質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型[1]。首先，在減數(shù)分裂前DNA復(fù)制完成后形成的姐妹染色單體通過減數(shù)分裂特異的黏連蛋白REC8(Cohesin)聯(lián)系成一體；從細(xì)線早期開始，REC8、ASY1和ASY3[2-3]等蛋白質(zhì)與綁定在其上的DNA 環(huán)(DNA-loop)一起形成一個線性的軸，使得結(jié)合了REC8的DNA沿著軸的方向排列形成了一個個染色質(zhì)環(huán)(Chromatin loop)，統(tǒng)稱為牽回環(huán)-軸復(fù)合物結(jié)構(gòu)(圖1)。

1.2 雙鏈斷裂形成

在形成的牽回環(huán)-軸復(fù)合物結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，細(xì)胞程序性誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂(Double-strand breaks,DSBs)由包含SPO11[4]和MTOPVIB[5]的類DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶VI復(fù)合物介導(dǎo)產(chǎn)生。植物具有3個編碼SPO11的同源基因，其中只有SPO11-3不參與減數(shù)分裂[6]；而SPO11-1和SPO11-2以異源二聚體構(gòu)成減數(shù)分裂拓?fù)洚悩?gòu)酶復(fù)合物的一部分，為誘導(dǎo)減數(shù)分裂DSBs所必需[7](圖2)。除了SPO11復(fù)合物，在釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae中還有至少9種包含Spo11在內(nèi)的DSB相關(guān)蛋白，其中Mre11、Rad50、Xrs2、Ski8、Rec102、Rec104、Rec114、Mei4和Mer2能夠形成不同的亞復(fù)合物，為Spo11產(chǎn)生DSB所必需[8]；它們在植物中對應(yīng)的同源蛋白是AtPRD1、AtPRD2、AtPRD 3、At DFO、OsCR C1、OsSDS和OsP31comet(OsBVF1)[9-12]。釀酒酵母中的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞核內(nèi)的Spo11蛋白存在2種狀態(tài)：與染色質(zhì)不重合的游離態(tài)和與軸重合的結(jié)合態(tài)；DSB主要發(fā)生在染色質(zhì)環(huán)內(nèi)，而大多數(shù)對DSB形成至關(guān)重要的Spo11輔助蛋白則位于軸上[13]，這呼應(yīng)了牽回環(huán)-軸復(fù)合物中“牽回”的含義-釀酒酵母中含PHD結(jié)構(gòu)域的Set1復(fù)合物成員Spp1能夠與染色質(zhì)環(huán)中基因啟動子區(qū)附近的H3K4me2/3結(jié)合，并通過與染色體軸上的Spo11輔助蛋白Mer2互作[13]，將染色質(zhì)環(huán)牽回染色體軸上。這是第1次以牽回環(huán)-軸復(fù)合物結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，解釋DSB形成的分子機(jī)制的嘗試(圖1)。植物中鮮見類似的作用機(jī)制，但是已有的一些結(jié)果也印證了該模型在植物中也可能成立：ChIP-seq結(jié)果顯示，定位于軸向元件的REC8和DSB結(jié)合的染色質(zhì)區(qū)域不同[14]；在重組富集的基因區(qū)，標(biāo)記DSB位點的SPO11-1-oligos與ASY1和REC8在全基因組水平無顯著的正相關(guān)性[14-15]。

圖1 植物減數(shù)分裂染色體的牽回環(huán)-軸模型Fig. 1 The model of tethered loop-axis of meiotic chromosomes in plant

1.3 雙鏈斷裂末端加工

酵母中的工作表明，Spo11在切割DNA雙鏈產(chǎn)生DSB后，通過其酪氨酸殘基共價連接在斷裂的5′末端DNA上[4,16]，如不及時移除將會對后續(xù)的修復(fù)造成直接阻礙[8]。MRX/N復(fù)合物[Mre11-Rad50-Xrs2(Nbs1)]和Com1(Sae2)共同完成DSB處Spo11結(jié)合的5′單鏈末端的移除，從而產(chǎn)生單鏈的3′末端[8](圖2)。在擬南芥中也有這4個基因的同源基因。其中At MRE11、At RAD50和AtCOM1為減數(shù)分裂修復(fù)所必需[17-18]；而AtNBS1突變只顯示了輕微的DNA損傷表型，其突變能夠加劇DNA損傷相應(yīng)激酶ATM突變體的表型[19]。此外，水稻中也報道了OsCOM1和OsMRE11具有與擬南芥同源基因相似的功能[20-21]。這表明MRX/N復(fù)合物和相關(guān)蛋白在DSB末端加工中的功能在真核生物中保守。最后，釀酒酵母中的研究報道了DSB的5′末端被Exo1進(jìn)一步切除以產(chǎn)生更長的3′單鏈DNA[22]。并且這一過程也受到DNA末端切除輔助因子9-1-1復(fù)合物的作用[23-24]。

1.4 單鏈入侵

游離裸露的單鏈DNA很容易成為生物細(xì)胞內(nèi)四處游弋的核酸酶攻擊的對象。復(fù)制蛋白A(Replication protein A, RPA)是一種保守的單鏈DNA結(jié)合蛋白，可與3'末端單鏈結(jié)合以保護(hù)它們免于降解[25]。小鼠中的研究表明，RPA1介導(dǎo)重組酶的招募并參與重組[26]。酵母中的Rpa1蛋白通過消耗ATP招募重組酶Rad51和Dmc1，并替換自己與單鏈DNA形成核絲，從而入侵同源染色體雙鏈進(jìn)行同源搜索，形成置換環(huán)(Displacement loop，Dloop)結(jié)構(gòu)[27](圖1、圖2)。與小鼠和酵母不同，植物中的RPA1基因存在多個拷貝，擬南芥中有RPA1a～ RPA1e共5個拷貝[28]、水稻中則有RPA1a、RPA1b和RPA1c共3個拷貝[29]，暗示其功能可能發(fā)生了分化?，F(xiàn)有的研究證實了這種可能，表明PRA1在植物中很可能不參與重組酶招募這一早期重組環(huán)節(jié)，而是作用于第2末端捕獲(Second end capture)這一更晚的過程[30]。

圖2 植物減數(shù)分裂重組修復(fù)途徑模型Fig. 2 The model for meiotic recombination in plant

大多數(shù)真核生物都具有與細(xì)菌DNA修復(fù)重組酶RecA同源的2個同源基因RAD51和DMC1[31]。RAD51和DMC1這2個重組酶的功能既有重疊又有差異。前者在有絲分裂和減數(shù)分裂中都有參與，而后者只在減數(shù)分裂中發(fā)揮作用。近年來在擬南芥中的研究工作表明，AtDMC1是同源著絲粒配對所必需的，而AtRAD51為染色體臂配對所必需[32]。喪失了催化活性而保留了RAD51 DNA結(jié)合能力的RAD51::GFP融合蛋白能夠恢復(fù)rad51突變體中的染色體碎片，但卻恢復(fù)不了dmc1 rad51雙突中的染色體碎片，證明了DMC1在正常減數(shù)分裂染色體重組中的核心作用；而RAD51起到了DMC1的重要輔助因子的作用[33]，這一結(jié)果與酵母中的發(fā)現(xiàn)一致[34]。BRCA2也是RAD51和DMC1的輔助因子[35]。除了DMC1基因，在脊椎動物和植物中，RAD51基因家族還有高度保守的其他5個成員-RAD51B、RAD51C、RAD51D、XRCC2和XRCC3[36]。小鼠中除DMC1外，其他同源基因的突變都會導(dǎo)致胚胎致死[27]。相反，擬南芥中這7個基因都不影響營養(yǎng)生長[11,37]，這為研究該基因家族的功能提供了契機(jī)。研究發(fā)現(xiàn)RAD51C和XRCC3是RAD51在染色體上定位所必需[38]；AtRAD51B、AtRAD51D和AtXRCC2不是減數(shù)分裂DSB修復(fù)所必需[39]；有研究發(fā)現(xiàn)AtRAD51B和AtXRCC2在抑制減數(shù)分裂重組形成方面有作用[40]。

1.5 雙鏈斷裂修復(fù)中的DNA合成

廣義上講減數(shù)分裂過程中總共發(fā)生了2次DNA合成：第1次是在減數(shù)分裂前的全局性的DNA復(fù)制，使得每條染色體加倍并形成1對姐妹染色單體；第2次是只發(fā)生在染色體局部范圍對減數(shù)分裂重組進(jìn)程中斷裂的DNA進(jìn)行修復(fù)。已有的工作支持前者與有絲分裂的DNA復(fù)制類似[41]；而后者的具體分子機(jī)制在1983年由Szostak等[42]提出重組的雙鏈斷裂修復(fù)模型，認(rèn)為斷裂的DNA修復(fù)是一個利用現(xiàn)成的單鏈3′末端作為引物進(jìn)行DNA合成的相對簡單的過程，之后30多年來未得到深入探究。盡管期間陸續(xù)有研究表明減數(shù)分裂重組相關(guān)的DNA合成可能會對減數(shù)分裂重組或非重組的產(chǎn)生有影響[43-44]。

本研究團(tuán)隊近些年的工作主要通過植物遺傳學(xué)的手段對該環(huán)節(jié)進(jìn)行了一些研究。首先，對擬南芥雄性減數(shù)分裂細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序后發(fā)現(xiàn)，許多DNA復(fù)制基因，如復(fù)制中的前導(dǎo)鏈和后隨鏈合成因子都有很高的表達(dá)量[45]，暗示了減數(shù)分裂染色體重組相關(guān)的DNA合成可能沒有模型中想象的那么簡單，其可能與有絲分裂DNA復(fù)制共享了某些重要的DNA復(fù)制因子。這個發(fā)現(xiàn)解釋了為什么重組修復(fù)DNA合成這一環(huán)節(jié)的研究較為困難的原因，同時也給我們提供了通過創(chuàng)建弱表型突變體或條件型突變體開展研究的一個思路。于是借助擬南芥這個高效的遺傳學(xué)研究工具，通過獲得DNA復(fù)制因子營養(yǎng)生長正常的弱突變體或使用DMC1啟動子的減數(shù)分裂特異性RNA干擾策略，我們發(fā)現(xiàn)了DNA復(fù)制因子C1(RFC1)，DNA復(fù)制聚合酶α、δ和ε(Pol α、Pol δ和Pol ε)的突變都顯示了重組依賴的染色體碎片，證實了它們都參與了減數(shù)分裂重組修復(fù)中的DNA合成[46-49](圖2)。在DNA復(fù)制的模型中，Pol ε是主要的前導(dǎo)鏈合成酶；Pol α和Pol δ則主要負(fù)責(zé)后隨鏈(或稱為岡崎片段)的合成；RFC1對于增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen, PCNA)在復(fù)制叉處的加載中具有重要作用[50]，且對于后隨鏈合成中Pol α的活性和Pol δ替換Pol α完成岡崎片段的合成不可或缺[51]。這一系列的分子遺傳證據(jù)支持我們提出了一個修訂的雙鏈斷裂修復(fù)模型：減數(shù)分裂重組中的雙鏈斷裂以類似DNA復(fù)制中的前導(dǎo)鏈和后隨鏈協(xié)同合成的形式完成修復(fù)。與此同時，我們發(fā)現(xiàn)RFC1、Pol α和Pol δ的突變體中重組頻率降低[8,39,52]；前導(dǎo)鏈合成聚合酶Pol ε中的突變并沒有降低重組率，但其分布發(fā)生了改變，暗示了重組干涉發(fā)生變化[47]。這些結(jié)果與釀酒酵母中后隨鏈合成突變體pol3-ct顯示出重組減少與基因轉(zhuǎn)換(Gene conversion)區(qū)域變短[53]的結(jié)果一致，表明減數(shù)分裂重組雙鏈斷裂修復(fù)中的DNA合成為重組形成所必需，且這一功能是保守的(圖2)。

1.6 非交換與交換

DNA合成推動了由DMC1/RAD51入侵同源染色體形成的D-loop結(jié)構(gòu)的拓展，并完成了雙鏈斷裂的修復(fù)。D-loop這一類重組中間體后續(xù)可產(chǎn)生非交換(Non-crossover，NCO)與交換(Crossover，CO)2種類型[54]。雖然在植物減數(shù)分裂開始時引入了數(shù)百甚至上千個DSB-擬南芥中約200個[55]、水稻中約400個[56]以及小麥中750～1500個[57]，但其中只有很小一部分最終發(fā)生重組形成交換，其他絕大部分都是以非交換的形式完成修復(fù)。非交換與交換由2個相互拮抗的機(jī)制決定：一方面，解旋酶FANCM[58]及其輔助蛋白MHF1和MHF2[59]通過一個稱為“合成依賴的鏈退火”過程(Synthesis dependent strand annealing, SDSA)將已經(jīng)完成了雙鏈斷裂區(qū)域修復(fù)工作的重組中間體解開，從而抑制交換、促進(jìn)形成非交換[60](圖2)；同時，另一部分重組中間體進(jìn)入一個在植物中占85%～90%的被稱為干涉敏感型(I型)或者ZMM蛋白依賴的重組途徑[61](圖2)。顧名思義，該途徑依賴于一類統(tǒng)稱為Z M M的蛋白[62]，在擬南芥中Z M M蛋白由SHOC1[63]、HEI10[64]、ZIP4(SPO22在擬南芥中的同源蛋白)[65]、PTD[63]、MER3[61]、MSH4[66]和MSH5[67]構(gòu)成。在酵母中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，這些蛋白的同源蛋白主要的作用是結(jié)合在同源染色體之間形成的重組中間體上，并穩(wěn)定后者的結(jié)構(gòu)，比如識別和擴(kuò)展D-loop的Mer3[68]、穩(wěn)定雙Holliday交叉[42](Double Holliday junction, dHJ)結(jié)構(gòu)的Msh4-Msh5異源二聚體[69]和既結(jié)合D-loop又結(jié)合dHJ的Zip2(AtSHOC1在釀酒酵母中的同源蛋白)和Spo16(AtPTD在釀酒酵母中的同源蛋白)[70]。ZMM蛋白Zip4是酵母中一種含有四肽重復(fù)序列的支架蛋白，可分別與重組中間體中的Msh5、Zip2和Spo16，染色質(zhì)軸結(jié)構(gòu)中的Red1(AtASY3在釀酒酵母中的同源蛋白)，聯(lián)會復(fù)合體中的Emc11和Gcm2[70]以及E3連接酶Zip3(HEI10在釀酒酵母中的同源蛋白)[70]互作，串聯(lián)起了重組中間體的穩(wěn)定、聯(lián)會復(fù)合體的組裝和交換形成的一系列核心事件[71]。HEI10所在的E3連接酶具有2個主要的亞家族：HEI10/CCNB1IP1和Zip3/RNF212。植物僅編碼HEI10家族成員[64]，釀酒酵母僅保留Zip3家族成員，而哺乳動物基因組兩者都有[72-73]?，F(xiàn)有的報道顯示，HEI10蛋白量的多少與重組數(shù)量呈正相關(guān)性[74]。免疫熒光試驗顯示，在重組早期，HEI10蛋白在聯(lián)會的染色體上形成很多很小的信號，但到重組晚期則僅存在若干個干涉敏感型重組位點的大信號[75](圖1)。此時，HEI10與標(biāo)記干涉敏感型重組位點的MutL同源蛋白MLH1和MLH3共定位[75]。HEI10信號數(shù)量和大小的變化可能暗示其具有2方面的功能：在重組早期拮抗、降解SDSA或其他非重組途徑因子[69]；在重組晚期起到了解除dHJ的功能。除了ZMM蛋白依賴的重組途徑外，還有10%～30%的重組通過非ZMM途徑發(fā)生[61]。這一小部分重組由于不受重組干涉影響，因此被稱為干涉不敏感型(II型)重組。在擬南芥中，這些重組依賴于重組酶MUS81(圖2)和FANCD2的2個不完全獨立的途徑[76]。

2 減數(shù)分裂重組的特征

在20世紀(jì)初，重組在果蠅中被發(fā)現(xiàn)[77]，之后不久，一系列重組的特征被陸續(xù)報道，如重組干涉的存在可能導(dǎo)致每個細(xì)胞的重組頻率穩(wěn)定在一個遠(yuǎn)低于DSB數(shù)量的數(shù)字上；重組在染色體上分布不均勻-存在熱區(qū)和冷區(qū)；染色體雜合性與重組位置的相關(guān)性；一些組蛋白變體和修飾等染色質(zhì)特征以及轉(zhuǎn)座子與重組的關(guān)系等特征。對這些特征以及背后的分子機(jī)制的研究進(jìn)展詳述如下。

2.1 重組干涉與重組頻率

通過對動物、植物、真菌等多個物種的研究發(fā)現(xiàn)，無論染色體的長度多長，平均每條染色體的重組數(shù)量很少會超過3個，釀酒酵母和裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe除外[37]。例如：小麥的巨型染色體3B，物理大小約為1 Gb；擬南芥最長的染色體有31 Mb。雖然它們長短懸殊，但是每對同源染色體上平均每次減數(shù)分裂都只發(fā)生1～3個重組事件。從前文“1.6”可知，這并不是由于DSB數(shù)量少造成的。部分原因可以用前文“1.6”中詳細(xì)介紹的重組和非重組途徑的相互拮抗作用來解釋；另一部分原因是減數(shù)分裂研究中發(fā)現(xiàn)的一種古老卻未曾解答的現(xiàn)象-重組干涉的結(jié)果。重組干涉是一種使染色體上連續(xù)的重組(交換)相距的距離比隨機(jī)預(yù)期更遠(yuǎn)的現(xiàn)象，即一個交換的發(fā)生會抑制距離其較近的交換的發(fā)生。

近些年，超分辨率顯微鏡的應(yīng)用幫助我們能夠直接觀察到促重組因子如HEI10和MLH1定位于聯(lián)會復(fù)合體的2個軸之間[78](圖1)；而早前的遺傳結(jié)果也表明，聯(lián)會復(fù)合體結(jié)構(gòu)蛋白如ASY1/PAIR2和ASY3/PAIR3的突變體會降低重組頻率[2-3,79-80]，表明聯(lián)會復(fù)合體在重組形成中具有重要的功能(圖1)。那么重組干涉是否也和聯(lián)會復(fù)合體結(jié)構(gòu)有關(guān)呢？最近，擬南芥中2個獨立的針對聯(lián)會復(fù)合體的中央元件-zyp1突變體的研究發(fā)現(xiàn)，干涉敏感型重組不僅增加了近60%，而且在染色體上隨機(jī)分布[78,81]。這一結(jié)果表明，重組干涉隨著聯(lián)會復(fù)合體中央元件的消失而消失了。有意思的是，雖然總體重組頻率增加了，但是仍然能在中期I發(fā)現(xiàn)染色體單體[78,81]，表明由ZYP1代表的聯(lián)會復(fù)合體不僅與重組干涉的成因有聯(lián)系，也和每對同源染色體間必需的至少一個重組事件-重組保證(CO assurance)這一現(xiàn)象密切相關(guān)。最近的一項在預(yù)印本公布的工作更是證明了不僅僅是ZYP1代表的中央元件，軸向元件ASY1同樣在重組干涉和重組保證中起作用[82]，加強(qiáng)了聯(lián)會復(fù)合體與重組形成之間的緊密聯(lián)系。

盡管擬南芥zyp1突變體完全喪失了重組干涉，但重組頻率只增加了60%左右[78,81]，并沒有達(dá)到DSB數(shù)目的水平。表明除了重組干涉，還有其他更關(guān)鍵的因素限制著重組數(shù)量。最近的一些證據(jù)表明，在沒有重組干涉的情況下，限制重組數(shù)量的關(guān)鍵因素是HEI10[74,83]-一個屬于ZMM蛋白的E3連接酶。擬南芥中，HEI10蛋白的量與重組數(shù)目正相關(guān)-在HEI10過表達(dá)材料中重組數(shù)目增加1倍多；在HEI10雜合材料中重組頻率降低[74]。更有價值的是，不同HEI10的等位基因可以用來解釋擬南芥不同生態(tài)型中存在的重組頻率的自然變異度[74]。細(xì)胞學(xué)研究表明，HEI10蛋白在聯(lián)會的染色體上形成很多很小的信號，但到重組晚期則僅存在于若干個干涉敏感型重組位點，形成大的點信號[64,75]。此時，HEI10與標(biāo)記干涉敏感型重組位點的MutL同源蛋白MLH1和MLH3共定位[64,75]。上述的這些新發(fā)現(xiàn)推動研究人員提出了一種新的重組形成的“粗化”(Coarsening)模型[75]：聯(lián)會復(fù)合體是一種介于固體和液體之間的液晶態(tài)結(jié)構(gòu)[84]，HEI10蛋白可以通過非耗能的自由擴(kuò)散形式沿著聯(lián)會復(fù)合體移動；在重組早期，除了在聯(lián)會復(fù)合體上的重組中間體上分布了高密度的HEI10位點外，低濃度的HEI10均勻分布在聯(lián)會復(fù)合體上的其余區(qū)域；大HEI10位點(可能是早期聯(lián)會的區(qū)域)的HEI10向外擴(kuò)散的速度較慢；小HEI10位點的HEI10向外擴(kuò)散的速度更快；最終導(dǎo)致聯(lián)會復(fù)合體上所有HEI10小位點消失，只保留幾個大位點，達(dá)到HEI10蛋白運動相對穩(wěn)定的狀態(tài)[75](圖1)。該模型能夠?qū)χ亟M干涉、重組保證、細(xì)胞的總體重組頻率和聯(lián)會復(fù)合體與重組頻率的正相關(guān)關(guān)系這些特征給予解釋，并得到來自線蟲的數(shù)據(jù)支持[85]。其準(zhǔn)確性和適用性尚需深入研究，然而其無疑是當(dāng)前結(jié)合了分子細(xì)胞遺傳學(xué)和數(shù)學(xué)建模繪制的包容性最強(qiáng)的重組模型。

雖然HEI10過度表達(dá)會大大提高重組率，但對重組分布無影響[74]。這就涉及到基因組和表觀組特征對重組分布的決定作用，詳述如下。

2.2 重組熱區(qū)和冷區(qū)

大多數(shù)植物都具有重組在染色體上分布不均的特點，構(gòu)成了染色體上所謂的重組熱區(qū)和冷區(qū)，例如在大麥[86]、小麥[87]、玉米[88]、番茄[89]和大豆[90]等具有大基因組、大重復(fù)序列的物種中尤為明顯。這些作物在染色體尺度上都有著近端粒端重組率高、近著絲粒端重組率低甚至幾乎不發(fā)生重組的現(xiàn)象，與基因的分布類似。然而在大多數(shù)物種中，重組率降低的速率遠(yuǎn)大于基因密度下降的速率，導(dǎo)致相當(dāng)一部分基因位于重組冷區(qū)。例如，在大麥和玉米中，大約20%的基因位于重組頻率很低的著絲粒周圍區(qū)域[86]；約30%的大豆基因在異染色質(zhì)區(qū)[91]，對作物育種產(chǎn)生了相當(dāng)大的負(fù)面影響[92]。

綜合相關(guān)的研究可以認(rèn)為，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、復(fù)制時序、基因密度等基因組和表觀組特征都可能是決定重組分布的因素[93-97]。擬南芥、馬鈴薯、小麥和玉米中的研究已經(jīng)證明重組位點與開放的染色質(zhì)狀態(tài)、基因的轉(zhuǎn)錄起始位點/終止位點和低水平的DNA甲基化區(qū)域正相關(guān)[98-102]。然而這些因素的影響不分主次，因為本身這些特征之間就存在一定的正相關(guān)性。如，高基因密度與開放的染色質(zhì)密切相關(guān)[103]。盡管如此，最近的一項工作仍然表明基因組特征可以相當(dāng)準(zhǔn)確的方式預(yù)測重組分布。該工作使用機(jī)器學(xué)習(xí)方法預(yù)測基于17個基因組特征的重組分布，最終發(fā)現(xiàn)結(jié)合開放染色質(zhì)(ATAC-seq)、基因密度和CHH DNA甲基化3類數(shù)據(jù)可以對85%的重組進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)測[97]。這3類是在減數(shù)分裂發(fā)生之前就確定了的基因組特征，暗示了可能在比DSB形成甚至更早的時期，重組在染色體上的分布就已經(jīng)確定了。

2.3 多態(tài)性與重組的關(guān)系

多態(tài)性與重組的關(guān)系目前似乎尚未有確定的結(jié)論。擬南芥和小麥中的報道顯示，高單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism, SNP)區(qū)域往往擁有較高的重組率[104-105]。然而在小麥與黑麥的雜交種以及不同品種的大麥和番茄的雜種中卻相反-高SNP區(qū)域擁有較低的重組頻率[106-108]。在擬南芥中，更細(xì)致的研究表明，重組率隨著SNP密度從0到0.5%先增加，然后在SNP密度高于0.5%后降低[109]。最近的一項通過高通量測序檢測甲基磺酸乙酯(EMS)誘變造成自交系材料SNP對重組分布的研究發(fā)現(xiàn)，多態(tài)性位點并非影響重組分布的主要決定因素[97]。

此外，由于大多數(shù)植物減數(shù)分裂研究主要是在擬南芥和谷類作物等自交或高度近交的材料中開展的，導(dǎo)致現(xiàn)有的重組形成的理論存在一定局限性-對占植物大多數(shù)(約 70%)的異交物種的適用性尚需時間觀察[110]。例如，在異交的沙地擬南芥A. arenosa種群中，編碼序列區(qū)在核苷酸水平上的差異約為1.5%[111]，在非編碼序列區(qū)可能差異更大?？梢韵胂裨谶@些高雜合度的物種中，對DSB修復(fù)模板序列匹配度的過高要求會使重組失敗并最終導(dǎo)致配子不育。因此，減數(shù)分裂重組對序列差異性存在較大的容忍度是合理但是仍需深入研究以辨析其作用細(xì)節(jié)的假說。最后，盡管減數(shù)分裂重組可以適應(yīng)雜合度，但很有可能干涉敏感型與不敏感型2類重組途徑對雜合度如SNP的影響存在差異。擬南芥fancm、recq4和figl1單突變體在自交種中增加了干涉不敏感型重組；但在雜交種中沒有增加(fancm)，或增加幅度很小(recq4，figl1)[60]，暗示SNP可能起了抑制干涉不敏感型重組的作用。

2.4 染色質(zhì)特征和基因組結(jié)構(gòu)與重組的關(guān)系

重組與轉(zhuǎn)錄基因在基因組染色體上具有相似的分布特征，表現(xiàn)為在常染色質(zhì)上多、異染色質(zhì)上少。由于兩者結(jié)構(gòu)差異顯著，這里將分開討論。在常染色質(zhì)區(qū)，前文已經(jīng)介紹了開放染色質(zhì)、基因密度和CHH DNA甲基化3類數(shù)據(jù)可以準(zhǔn)確預(yù)測85%的重組事件，重組事件主要發(fā)生在常染色質(zhì)區(qū)[97]。擬南芥中，DSB在具有低核小體占有率且含有開放染色質(zhì)標(biāo)記(如H3K4me3的基因5'和3'末端)的區(qū)域富集[96]。人類和小鼠中，PRDM9是一種鋅指DNA結(jié)合蛋白，能夠識別人類重組熱點中的13 bp DNA基序，起催化H3K4的三甲基化、促進(jìn)非轉(zhuǎn)錄起始位點的DSB形成的作用[112-113]。植物中沒有PRDM9蛋白，然而對擬南芥重組熱點序列分析發(fā)現(xiàn)，CTT、CCN和poly-A這3個基序與重組熱點顯著關(guān)聯(lián)[99,114](圖3)，此外還發(fā)現(xiàn)組蛋白變體H2A.Z也在重組熱區(qū)富集[99]。同樣的基序后續(xù)也在玉米[115]、小麥[116]和番茄[117]中被發(fā)現(xiàn)，表明該機(jī)制在植物中是保守的。

在異染色質(zhì)區(qū)，已有證據(jù)表明，著絲粒和近著絲粒區(qū)高度富集的組成型異染色質(zhì)起了抑制重組的作用[118]。例如，在擬南芥常染色質(zhì)區(qū)的重組熱點位置，通過RdDM途徑定向引入CHH DNA甲基化后，能將這些區(qū)域轉(zhuǎn)化為具有組成型異染色質(zhì)特征-高DNA甲基化、H3K9me2和低核小體占有率的區(qū)域，從而顯著降低重組率[98](圖3)。DSB發(fā)生頻率的降低(異染色質(zhì)區(qū)DSB產(chǎn)生率只有常染色質(zhì)區(qū)的約40%)是植物著絲粒和轉(zhuǎn)座子(Transposable element，TE)密集的近著絲粒區(qū)成為重組冷區(qū)的直接原因。此外也有其他因素起到了關(guān)鍵的作用：有報道顯示，擬南芥中H3K9me2和non-CG(CHG和CHH，H代表G、A或T)甲基化缺失的突變體在著絲粒區(qū)顯示了DSB和重組率的增加[14,95]；而CG甲基化轉(zhuǎn)移酶met1突變體中H3K9me2水平不變、CG甲基化丟失導(dǎo)致DSB增加，但在異染色質(zhì)區(qū)重組率降低[95]。由此可知，H3K9me2甲基化可能作用于DSB形成之后的重組環(huán)節(jié)，在抑制著絲粒和近著絲粒區(qū)重組中也扮演了關(guān)鍵的角色 (圖3)。

圖3 擬南芥減數(shù)分裂重組(CO)熱點的基因組/染色質(zhì)特征和調(diào)控模型Fig. 3 The model for regulation of Arabidopsis meiotic crossover hotspots by genomic and chromatin features

3 減數(shù)分裂重組操縱和應(yīng)用

近十多年來，我們對植物減數(shù)分裂重組和基因組多樣性的認(rèn)知有了很大的進(jìn)展。DNA測序技術(shù)的創(chuàng)新極大地促進(jìn)了植物基因組遺傳和表觀遺傳信息的探索，使得通過高通量基因分型、連鎖和關(guān)聯(lián)分析設(shè)計育種方案并加速植物育種成為現(xiàn)實。同一時期，對減數(shù)分裂重組的遺傳和表觀遺傳調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識取得了巨大進(jìn)展，多個層面的重組調(diào)控網(wǎng)絡(luò)被認(rèn)識，使得育種可行方案得以擴(kuò)展。并且研究者們已經(jīng)在理論或?qū)嵺`中通過操控重組優(yōu)化作物育種，實現(xiàn)改良作物和雜種優(yōu)勢的固定，這些應(yīng)用包括重組的遺傳操控、無融合生殖、靶向重組等[119-120]。

3.1 提高重組頻率

植物雜交育種依賴于減數(shù)分裂期同源染色體間遺傳物質(zhì)的相互交換，從而產(chǎn)生新的等位基因組合。雜交可以使優(yōu)良作物的有利性狀組合起來，并消除不利性狀。然而，由于自然過程中的重組頻率和分布受到限制，具有不可控性，染色體的大部分是不參與遺傳交換的，如擬南芥中80%的重組事件只發(fā)生在約25%的基因組上[99]。并且在大部分植物中，由于存在重組干涉、重組抑制和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)等多種調(diào)控機(jī)制，最終重組形成的數(shù)目遠(yuǎn)少于DSB數(shù)目[11,37]，在育種中的直接后果便是造成連鎖拖拽(Linkage drag)現(xiàn)象，延長育種周期并增加獲得集合優(yōu)勢性狀品種的難度。連鎖拖拽是育種中的一種普遍現(xiàn)象，指的是由于某一區(qū)域重組頻率過低，造成引入一個有利等位基因往往會連鎖著另一個不利等位基因。解決該問題的一種方法是增加重組頻率。

3.1.1 操縱重組抑制子 減數(shù)分裂主要依賴2條重組通路形成交換(圖2)[11]。其中1條干涉敏感型(I型)重組主要由ZMM(ZIP1、MSH4、MSH5和MER3)通路介導(dǎo)，并貢獻(xiàn)了大部分(85%～90%)重組[65-66]；另一條干涉不敏感型(II型)重組通路主要依賴于MUS81[121]和FANCD2[76]。擬南芥中，zmm突變體通常表現(xiàn)為重組數(shù)目大量降低而導(dǎo)致的育性大幅降低，但仍然保有一部分育性。因此研究者便可利用這類材料進(jìn)行正向遺傳篩選zmm抑制子，研究抑制重組的機(jī)制。通過對zmm抑制子的基因定位和分析，發(fā)現(xiàn)存在3條獨立的抑制重組形成途徑，分別是：DNA解旋酶FANCM和其輔助因子MHF1/2途徑[58-59]，解旋酶RECQ4A/B、Topoisomerase 3 alpha(TOP3α)和RMI1途徑[122-124]，以及AAA-ATPase FIGL1(FIDGETIN-LIKE1)和其互作蛋白FLIP途徑[31,125]，且這3條途徑的任何基因突變導(dǎo)致的都是依賴于MUS81的干涉不敏感型重組數(shù)量的增加。FANCM是一個DNA解旋酶，作為植物中發(fā)現(xiàn)的第1個重組抑制子，其功能在蕓苔屬、豌豆、水稻和小麥中都保守[126-128]。其突變會導(dǎo)致重組頻率在擬南芥中增加3倍[58]、六倍體小麥中增加31%[127]，但是在番茄Solanum lycopersicum和生菜Lactuca Sativa中未發(fā)現(xiàn)類似重組增加的現(xiàn)象[128-129]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ANCM在擬南芥和生菜中都參與影響重組的分布，突變會導(dǎo)致染色單體的產(chǎn)生，降低育性[130]。最近在小麥中的研究支持了這一結(jié)果，并證明了FANCM在2個重組途徑中都有功能：在干涉敏感型重組通路的第2鏈捕獲中起了促進(jìn)HEI10定位的促重組因子作用；在干涉不敏感型重組通路中起了解除重組中間體的抑重組因子作用[127]。第2條途徑中，敲除RECQ4使水稻、豌豆和番茄等作物在育性正常的前提下重組率增加了3～4倍[128]，并且在番茄和大麥中也得到了驗證[52,131]。在多個物種中功能穩(wěn)定并且提高全基因組減數(shù)分裂重組頻率的一致表現(xiàn)，使得DNA解旋酶RECQ4可以作為通用的加速育種進(jìn)程的工具。更進(jìn)一步，擬南芥中的遺傳分析表明，集合了RECQ4和FIGL1這2個途徑的突變體recq4a recq4b figl1重組率升到最高(約為野生型的9倍)，而三重途徑都有缺陷的recq4a recq4b figl1 fancm突變體的交叉頻率并沒有進(jìn)一步升高，甚至出現(xiàn)減少[60]。因此RECQ4和FLGL1的突變可以作為提高重組頻率加快作物育種的最優(yōu)組合(圖3)。

3.1.2 HEI10的劑量效應(yīng) HEI10編碼一個RINGfinger E3泛素連接酶[64,132]，是ZMM蛋白成員，在干涉敏感型重組中發(fā)揮重要作用。HEI10的缺失突變會導(dǎo)致重組數(shù)目大量減少并伴隨育性的降低[64]。前文提到，研究者發(fā)現(xiàn)HEI10對于重組的調(diào)控有明顯的劑量敏感性，即重組的數(shù)目和表達(dá)量呈正相關(guān)關(guān)系；表現(xiàn)在hei10雜合突變體中重組數(shù)目下降了約25%，而當(dāng)在野生型背景下表達(dá)額外的HEI10會顯著提高重組頻率(大于2倍)[74]。值得注意的是，HEI10突變對重組分布沒有影響-過表達(dá)HEI10只會增加常染色質(zhì)區(qū)的重組，而著絲粒附近的重組仍然被抑制[74]。另外，當(dāng)HEI10過表達(dá)和recq4a recq4b突變體組合會發(fā)生加性效應(yīng)，重組頻率進(jìn)一步提升，并且近著絲粒的異染色質(zhì)區(qū)重組頻率也提高1.5倍[133]。在突變體recq4a recq4b figl1的背景下，增加HEI10是否仍然會將重組頻率提升到一個新的高度？目前不太清楚，但是HEI10的劑量效應(yīng)可以作為一個有效的育種策略(圖3)。

3.1.3 異染色質(zhì)區(qū)重組的激活 異染色質(zhì)區(qū)因富含DNA甲基化、H3K9me2、H2A.W和轉(zhuǎn)座子等特征和結(jié)構(gòu)，抑制了減數(shù)分裂重組的發(fā)生，是重組冷區(qū)(圖3)[11]。但是異染色質(zhì)區(qū)也存在很多基因，例如在大麥和玉米中，大約20%的基因位于重組頻率很低的著絲粒周圍區(qū)域[86]；約30%的大豆基因在異染色質(zhì)區(qū)[91]，該區(qū)域等位基因的高度連鎖對作物育種產(chǎn)生了相當(dāng)大的負(fù)面影響[92]。同時，低重組頻率也會導(dǎo)致有害突變在這些區(qū)域累積[134]。

分析維持CG甲基化(DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶MET1和染色質(zhì)重塑因子DDM1)、non-CG甲基化(編碼CHG甲基化轉(zhuǎn)移酶CMT3)或催化H3K9me2(H3K9甲基轉(zhuǎn)移酶KYP/ SUVH4、SUVH5、SUVH6)的基因突變體內(nèi)的DSB和重組位點發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳因子影響了重組的頻率和分布[95,98,103,135]。在擬南芥中敲除MET1或DDM1基因會引起CG甲基化的丟失。在met1中，重組位點重新分布：增加染色體臂和著絲粒區(qū)等重組頻率，降低近著絲粒區(qū)重組頻率[95,103]；而在ddm1中，同樣會造成染色體臂重組頻率增加，但是異染色質(zhì)區(qū)變化不大[135](圖3)。研究者還發(fā)現(xiàn)，在met1突變體的近著絲粒區(qū)和轉(zhuǎn)座子存在的重組冷區(qū)中，DSB數(shù)量比野生型增加，但重組水平并未提高[95]；相比之下，SUVH4/5/6和CMT3突變后都會導(dǎo)致近著絲粒異染色質(zhì)區(qū)重組頻率和DSBs水平升高 (圖3)。這些結(jié)果表明，可以通過敲除催化non-CG甲基化或H3K9me2的表觀遺傳因子加快作物育種進(jìn)程，將新的遺傳等位基因組合引入到近著絲粒異染色質(zhì)區(qū)(圖3)。

3.1.4 其他潛在的調(diào)控因子 在水稻中，擬南芥聯(lián)會復(fù)合體橫向元件ZYP1在水稻內(nèi)的同源基因ZEP1的部分失活可使干涉敏感型重組增加1.8倍。然而，ZEP1完全缺失可導(dǎo)致完全雄性不育，但保持雌性育性[136-137]。在擬南芥中，最近的研究發(fā)現(xiàn)ZYP1的缺失消除了同源染色體的聯(lián)會，重組干涉也消失了，突變體中重組數(shù)量不僅沒有減少反而增加了54%，而且對于育性沒有影響[78]。Replication protein A(RPA1a)作為一個單鏈末端結(jié)合蛋白參與到重組過程，保護(hù)DSB修復(fù)過程中暴露的單鏈。在水稻中其被發(fā)現(xiàn)對限制重組形成至關(guān)重要，研究表明RPA1在重組中間體的加工過程中通過與FANCM-BTR復(fù)合物的相互作用抑制干涉不敏感型重組[30]。近期，研究者們還在擬南芥中鑒定到了一個新的抑制重組因子：蛋白磷酸酶X1(HCR1/PPX1)，其主要抑制干涉敏感型重組，并對干涉不敏感型重組也有影響，其突變后會導(dǎo)致重組頻率的升高。其中ZMM途徑蛋白HEI10、MSH5和MLH1等可能作為HCR1的直接靶標(biāo)被調(diào)控[138]。但是目前該磷酸酶具體的調(diào)控機(jī)制和其在其他作物中的作用還不清楚。以上這些基因都可能成為在作物中激活重組、加快育種進(jìn)程的新靶點。

3.2 降低重組頻率/無融合生殖(Apomixis)

雜交產(chǎn)生的后代植物往往比它們的親本更有活力，這種現(xiàn)象稱為雜種優(yōu)勢。在作物應(yīng)用中，雜交品種通常會因為雜種優(yōu)勢而具有高產(chǎn)的特點，比如水稻、玉米等[139]。然而雜交作物的后代在第2遺傳定律的支配下存在遺傳和表型的可變性和多樣性，無法在后代中穩(wěn)定保留其優(yōu)勢表型。而新的具有雜種優(yōu)勢的種子需要重新生產(chǎn)獲得，這一過程費時費力。因此如何能夠高效地固定雜種優(yōu)勢是雜交育種的關(guān)鍵問題。減少重組頻率可以作為固定雜種優(yōu)勢的一個途徑。但是通常調(diào)控重組的基因(如ZMM途徑)不僅僅會導(dǎo)致CO數(shù)目的大量減少，同時由于CO缺失造成同源染色體之間無法捆綁，還會造成減數(shù)第1次分裂過程中同源染色體不等分離，從而導(dǎo)致不育[11,37]。因此單純的降低重組頻率很難應(yīng)用于農(nóng)業(yè)育種。

無融合生殖，是一種在沒有減數(shù)分裂和受精作用的情況下，產(chǎn)生與母體基因完全相同的后代，種子或后代可以實現(xiàn)克隆母系的繁殖方式[120]。無融合生殖可以固定和繁殖任何基因型的種子，從而實現(xiàn)F1代雜交優(yōu)勢基因組的迅速固定，因而是一種具有革命性潛力的農(nóng)業(yè)育種方式。自然條件下，無融合生殖多發(fā)于多倍體情況下，已經(jīng)在不同科、屬的數(shù)百種植物中發(fā)生，然而在主要的農(nóng)作物中并未發(fā)現(xiàn)[140]。無融合生殖是有性生殖逃逸的結(jié)果，主要依賴于3個方面的操作：1)有絲分裂形式的減數(shù)分裂過程；2)跳過受精作用并激活未受精的配子體進(jìn)行孤性繁殖；3)無受精前提下胚乳功能的激活[120,140](圖4)。通過基因工程目前已經(jīng)在實驗室初步實現(xiàn)了擬南芥和水稻中的無融合生殖[141-142]。

減數(shù)分裂過程中同源染色體重組以及非同源染色體自由組合，會打亂從親代繼承來的遺傳信息，產(chǎn)生單倍且重組的配子。由于每個配子的遺傳信息都是獨一無二的，因此有性生殖產(chǎn)生的后代存在無限的遺傳變異。因此，無融合生殖的基礎(chǔ)是對于減數(shù)分裂和受精作用的回避。因為有絲分裂DNA只復(fù)制一次，并伴隨姐妹染色單體的分離，而產(chǎn)生遺傳信息完全相同的細(xì)胞。所以規(guī)避減數(shù)分裂的一個重要途徑就是利用有絲分裂代替減數(shù)分裂(Mitosis instead of meiosis，MiMe)，從而阻止同源重組和染色體倍性減少。目前MiMe體系已經(jīng)在模式植物擬南芥中建立[143]并初步成功應(yīng)用于水稻[144]，其主要策略就是打破減數(shù)分裂的3個關(guān)鍵步驟。1)抑制減數(shù)分裂重組，防止配子體遺傳信息重組。通常這一目標(biāo)是通過突變關(guān)鍵基因阻止減數(shù)分裂DSB的產(chǎn)生而實現(xiàn)的，而DSB形成是重組的開端。在擬南芥中，初始的MiMe體系是通過突變介導(dǎo)DSB形成的SPO11-1基因?qū)崿F(xiàn)[143]。此外突變其他參與DSB形成的重組酶PRD1、PRD 2和PRD3基因也都成功地在水稻中建立起來MiMe體系[144]。因此，敲除在減數(shù)分裂DSB形成中保守的功能基因應(yīng)該都能在不同作物中實現(xiàn)該目的，例如SPO11-2和MTOPVIB等[11,37]。2)允許姐妹染色單體提前分離。有絲分裂只有1次染色體分離，就是復(fù)制產(chǎn)生的姐妹染色單體分離。而減數(shù)第1次分裂是同源染色體的分離，而姐妹染色單體由黏連蛋白(Cohesin)捆綁向同側(cè)分離，因此通過敲除減數(shù)分裂特異性黏連蛋白REC8可以造成姐妹染色單體的提前分離。在缺失DSB的spo11-1突變體背景下，同時突變REC8基因，就會造成減數(shù)第1次分裂的同源染色體分離變成姐妹染色單體的分離。但是由于減數(shù)分裂第2次分裂的存在，這些染色單體之后仍然會隨機(jī)分離1次，最終造成不育[143]。3)不發(fā)生第2次減數(shù)分裂，允許產(chǎn)生二倍體配子。這一步是通過敲除OSD1(OMISSION OF SECOND DIVISION 1)基因?qū)崿F(xiàn)的。OSD1是后期促進(jìn)復(fù)合物APC/C的調(diào)節(jié)因子[145]，其通過抑制APC/C的活性影響減數(shù)分裂進(jìn)程。當(dāng)OSD1缺失后，減數(shù)分裂會在減數(shù)第1次分裂后終止，并產(chǎn)生二倍體的孢子，最終會導(dǎo)致多倍體后代的產(chǎn)生[143]。但是OSD1基因突變不影響減數(shù)分裂重組的發(fā)生，因此其產(chǎn)生的仍是同源染色體重組后的二倍體配子[143]。另外，在擬南芥中還鑒定到了osd1突變的替代方案，如敲除細(xì)胞周期蛋白CYCA1;2/TAM1或轉(zhuǎn)基因表達(dá)一個磷酸化(第16位蘇氨酸)位點突變的TDM1(THREE DIVISION MUTANT1)，同樣可以實現(xiàn)抑制第2次分裂和減數(shù)分裂提前退出的效果[120]。綜合以上研究，通過把3種調(diào)控不同步驟的突變體結(jié)合起來，spo11-1抑制重組，rec8解放姐妹染色單體，osd1促使第1次分裂后退出減數(shù)分裂，最終把減數(shù)分裂轉(zhuǎn)變?yōu)橛薪z分裂，從而產(chǎn)生相同遺傳信息的克隆細(xì)胞，并且其可以正常發(fā)育成為配子體[143-144](圖4)。

圖4 操縱減數(shù)分裂創(chuàng)新作物種質(zhì)Fig. 4 Manipulating meiosis for crop improvement

除了多基因組合以外，還存在一些單基因突變導(dǎo)致MiMe發(fā)生的例子，比如：擬南芥的DYAD/SWITCH1(SWI1)基因，是一個減數(shù)分裂染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)因子，并參與保護(hù)黏連蛋白，而且影響減數(shù)分裂的進(jìn)入[146]。而SWI1單突變后足以產(chǎn)生雌性的無融合生殖，產(chǎn)生二倍體的雌配子[146]。但是其發(fā)生率僅有約50%，此外還會導(dǎo)致嚴(yán)重不育，所以應(yīng)用價值大大降低。另外，玉米中還發(fā)現(xiàn)了雌性無融合生殖突變體nonreduction in female 4(nrf4)，但也只有5%的雙倍體配子可以無性生殖[120]。因此單基因突變引發(fā)的MiMe的直接應(yīng)用還存在很大局限。

由于通過MiMe會產(chǎn)生二倍體配子，如果通過受精作用將造成后代染色體加倍 (圖4)，所以為了實現(xiàn)無融合生殖，需要進(jìn)一步繞過受精過程，通?？梢酝ㄟ^在卵細(xì)胞中誘導(dǎo)雄性表達(dá)基因BABY BOOM 1(BBM1)誘導(dǎo)孤雌生殖，或通過操縱如著絲粒特異組蛋白CENH3變體實現(xiàn)單倍體誘導(dǎo)，從而實現(xiàn)種子克隆[120]。此外還需要實現(xiàn)胚乳的自主生成[120](圖4)。由于這些部分不直接涉及減數(shù)分裂過程，所以在此不做詳述。

3.3 靶向重組

前文所介紹的改變重組頻率的方式多是在整個基因組層面進(jìn)行增加或減少，對于特定目標(biāo)區(qū)域的重組貢獻(xiàn)并不明顯，缺乏針對性和靈活性。靶向重組可能是一個潛在的首選策略，其可以用于精確調(diào)節(jié)特定位置的重組事件的發(fā)生，主要目的是打破不利的連鎖，增加遺傳收益。在原則上，定向重組可以使用2種不同的方法實現(xiàn)靶向重組這一目標(biāo)：1)使用可編程的DNA核酸酶誘導(dǎo)DSB在特定位置發(fā)生，或通過具有與靶標(biāo)位點DNA/染色體結(jié)合能力的系統(tǒng)引導(dǎo)自然的DSB誘導(dǎo)機(jī)制定位到特定位點；2)改變靶標(biāo)位置的染色體特征，從而促進(jìn)或抑制靶位點重組的發(fā)生，比如前文所介紹的DSB熱區(qū)和冷區(qū)的特征(圖3)。

CRISPR/Cas系統(tǒng)作為一種精確的基因組編輯工具[147]，其包含DNA內(nèi)切酶，能夠在基因組的幾乎任何位置誘導(dǎo)DSBs，并可以被合成的gRNA引導(dǎo)到所需的剪切位點。隨著CRISPR技術(shù)的發(fā)展，操縱高等真核生物的基因組和控制減數(shù)分裂重組將引領(lǐng)作物改良的新時代[148]。因此，一個可行的策略是在減數(shù)分裂過程中直接通過CRISPR/Cas系統(tǒng)定位目標(biāo)區(qū)域，引入DSB形成機(jī)制并誘導(dǎo)同源重組。在釀酒酵母的研究中，基因組編輯工具操縱減數(shù)分裂重組的適應(yīng)性首次被證明，使用鋅指蛋白(ZF)、轉(zhuǎn)錄激活因子(Transcription activator-like effector，TALE)或CRISPR-Cas系統(tǒng)作為DNA結(jié)合模塊，并融合SPO11，可以在特定位點誘導(dǎo)減數(shù)分裂DSB，顯著增加交叉頻率[149]。近期在植物中，研究者將參與DSB形成的MTOPVIB與dCas9蛋白融合，從而靶向誘導(dǎo)了減數(shù)分裂DSB發(fā)生于3號染色體的亞端粒區(qū)域，但該位置DSB的增加并沒有造成重組的頻率升高[150]?？赡艿闹饕蚴窃卺劸平湍钢?，約40%的DSB可以被轉(zhuǎn)化為COs[151]。而在擬南芥和其他作物中，DSB轉(zhuǎn)化為CO的概率只有2%～5%[11,152]。因此，即使在靶位點有大量DSB形成，但CO低轉(zhuǎn)化率限制了該技術(shù)在農(nóng)作物中的進(jìn)一步應(yīng)用。有意思的是，研究者直接利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在番茄體細(xì)胞中在一個調(diào)節(jié)果色的位點定向誘導(dǎo)DSB的發(fā)生，并成功誘導(dǎo)了同源重組，其中一小部分遺傳給了后代[153]。最近在玉米體細(xì)胞中，研究者通過引入CRISPR/Cas12a系統(tǒng)，在3號染色體相距約180 kb處選擇2個gRNA靶位，可以顯著提高F1代體細(xì)胞中CO的頻率，而這種靶向CO的發(fā)生可能是通過體細(xì)胞的非同源端連接(NHEJ)或同源定向修復(fù)(HDR)途徑介導(dǎo)的[154]。這些成果預(yù)示著RNA介導(dǎo)的核酸酶技術(shù)在誘導(dǎo)靶向重組和加速育種中的巨大潛力。

除了定點誘導(dǎo)重組，研究者還利用CRISPR/Cas9對擬南芥特定染色體區(qū)域進(jìn)行重排，通過Cas9核酸酶的卵細(xì)胞特異性表達(dá)系統(tǒng)實現(xiàn)靶向和可遺傳的方式重新排列植物染色體的結(jié)構(gòu)[155-156]。值得注意的是，在擬南芥4號染色體上的1.17 Mb異染色質(zhì)鈕(Heterochromatic knob)的反轉(zhuǎn)恢復(fù)了該區(qū)域CO的形成，而自然條件下該區(qū)域CO是被完全抑制的[156]。隨后，有研究者在玉米中也獲得了染色體大片段交叉和倒位的株系[157]。因為許多作物都經(jīng)歷了大量的染色體重排，影響CO的形成，這一方法通過物理分離打破了一些區(qū)域的遺傳連鎖，對于作物改良有著巨大的應(yīng)用潛力。

通過改變目標(biāo)區(qū)域染色質(zhì)修飾也可以改變DSB或CO形成的頻率。如缺失DNA甲基化會增加DSB和重組[95-97]。研究者將人源去甲基化酶TET1與人工的鋅指結(jié)構(gòu)或CRISPR/dCas9融合，有效地將擬南芥中靶位點的DNA去甲基化[158]。該方法在理論上可以與前面提到的定點重組系統(tǒng)(如Cas9-SPO11的融合蛋白)結(jié)合使用，促進(jìn)DSB在一些高甲基化區(qū)域形成，并誘導(dǎo)CO發(fā)生[119]。還有研究者利用人工鋅指蛋白融合non-CG甲基化的催化蛋白實現(xiàn)定點升高DNA甲基化，進(jìn)而實現(xiàn)目標(biāo)基因沉默[159]。由于DNA甲基化對DSB和重組的發(fā)生有抑制作用[95,103]，同樣該方法也可以運用于增加某些重組熱點的甲基化水平，實現(xiàn)重組抑制，進(jìn)而實現(xiàn)優(yōu)良性狀基因的整合和固定。

3.4 反向育種

前文提到的無融合生殖是固定雜種優(yōu)勢的有效策略，而反向育種是另一種替代方法。反向育種和雜交育種相反，其通過阻止同源染色體交換和重組，獲取具有非重組的親代染色體組合的雄性或雌性的配子體，而后單倍體配子進(jìn)一步通過培養(yǎng)獲得純合的雙單倍體植物(Doubled haploid plants，DHs)，最終可以從不同染色體組合的DHs中選擇染色體互補(bǔ)的株系重新雜交，最終大量獲得和初始雜交種基因型一樣的雜交系，從而實現(xiàn)固定雜種優(yōu)勢[160-162]。目前在擬南芥中已經(jīng)建立了比較成熟的反向育種流程[161]：1)構(gòu)建和轉(zhuǎn)化減數(shù)分裂特異重組酶DMC1的RNAi株系，獲取無重組的親本；2)通過野生型(父本)和DMCRNAi轉(zhuǎn)基因株系(母本)的雜交獲得無重組的雜交后代；3)用雜交后代給GFP-tailswap(CENH3的一個嵌合突變體，其表達(dá)了一個融合GFP標(biāo)簽、H3 氮端和CENH3 碳端尾巴的嵌合蛋白，從而導(dǎo)致染色體選擇性消除，最終產(chǎn)生單倍體的胚)植株授粉獲得單倍體植株；4)單倍體植株自交成為D H s；5)選擇染色體互補(bǔ)的DHs雜交獲得初始的雜交種，固定雜種優(yōu)勢。這種策略存在很大限制，是由于通過抑制DMC1表達(dá)會禁止重組發(fā)生，導(dǎo)致減數(shù)分裂時期染色體隨機(jī)分離，因此無交換的配子體是否可育完全依賴于概率很低的偶然事件，因此該方法對于作物上的進(jìn)一步應(yīng)用很有局限。另一個解決方案是通過減少而不是完全抑制CO的產(chǎn)生，提高配子體成活率。最近，研究者在擬南芥中通過病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)(VIGS)降低減數(shù)分裂重組酶MSH5基因 的表達(dá)，從而瞬時降低CO形成[163]，為這一理論提供了支持。而且VIGS技術(shù)支持瞬時下調(diào)目的基因，避免了影響整個基因組的穩(wěn)定性，更有利于育種。然而，目前反向育種技術(shù)還沒有在作物中實踐。

4 結(jié)論與展望

近年來，對擬南芥和各種作物的減數(shù)分裂的機(jī)制研究增加了人們對植物減數(shù)分裂進(jìn)程和重組的認(rèn)識，并明確了多個參與調(diào)控減數(shù)分裂過程的基因和因子。雖然目前開發(fā)了一些加快育種的創(chuàng)新策略，但很多策略都是基于對模式植物擬南芥的研究，這些策略能否順利轉(zhuǎn)移到作物育種中，在實際操作和未來應(yīng)用中仍值得探索。其原因是，盡管物種間減數(shù)分裂進(jìn)程和重組的機(jī)制相對保守，但由于不同植物間基因組(組成和倍性)的不同，導(dǎo)致物種間減數(shù)分裂進(jìn)程和重組模式存在一定差異，這為制定作物育種策略帶來了一定阻礙。因此，我們需要更好地了解植物間減數(shù)分裂進(jìn)程和重組的異同，研究包括作物和非模式物種在內(nèi)的多種植物減數(shù)分裂的基本機(jī)制，并將相關(guān)知識應(yīng)用到作物育種中，從而突破傳統(tǒng)作物育種模式，加快定向改良作物品種，在振興種業(yè)和實現(xiàn)國家未來糧食安全方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。