李構(gòu)思，張雅玲，馬 坤，謝勇堯，陳樂天

(1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州 510642； 2 嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州 510642)

花粉發(fā)育是植物有性生殖的重要過程，包括體細(xì)胞絨氈層發(fā)育和小孢子母細(xì)胞分化、小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂和小孢子發(fā)育最終形成成熟花粉?；ǚ郯l(fā)育的任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常均可能導(dǎo)致植物雄性不育，尤其是絨氈層作為體細(xì)胞與雄性生殖細(xì)胞交流和連接的通道，其發(fā)育和凋亡對花粉發(fā)育更是至關(guān)重要[1-2]。植物雄性不育雖然不利于植物的自交繁殖，卻有利于驅(qū)動自交植物通過異交繁衍后代，增加基因交流和重組頻率，使植物適應(yīng)不斷變化的外部環(huán)境。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，雜種優(yōu)勢利用是提高農(nóng)作物產(chǎn)量、保障糧食安全的關(guān)鍵策略。雜交育種通過利用雄性不育系解決了雌雄同株同花作物雜交母本人工去雄困難的問題，降低了勞力成本，同時顯著提高了制種效率，促進(jìn)雜種優(yōu)勢利用[3]。因此，解析花粉發(fā)育和育性形成的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，既可以解答植物生殖發(fā)育的基礎(chǔ)科學(xué)問題，也能為農(nóng)作物雜交育種提供理論指導(dǎo)和技術(shù)支撐。

前期的植物生殖生物學(xué)研究重點(diǎn)在于鑒定不同花粉發(fā)育時期的關(guān)鍵基因和育性調(diào)控的分子網(wǎng)絡(luò)，現(xiàn)已從擬南芥Arabidopsis thaliana、水稻Oryza sativa等植物中克隆獲得上百個雄性不育基因，這些基因主要構(gòu)成了由轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)介導(dǎo)的糖代謝和脂代謝分子調(diào)控通路[2,4-6]。近年來，越來越多的研究表明，多種蛋白質(zhì)修飾參與了育性的調(diào)控和生殖發(fā)育過程，但蛋白修飾作為翻譯后調(diào)控的重要方式，如何影響植物花粉育性卻缺乏系統(tǒng)性的總結(jié)。為填補(bǔ)這一空白，本文整理歸納參與蛋白質(zhì)修飾過程的已報道雄性不育基因，以及花藥/花粉發(fā)育過程中受到修飾的底物蛋白，梳理了花粉發(fā)育各個階段的關(guān)鍵蛋白的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(圖1)，系統(tǒng)了解蛋白翻譯后修飾調(diào)控植物育性發(fā)育過程的分子機(jī)制，為后續(xù)植物生殖研究提供參考。

圖1 花粉發(fā)育各個階段的蛋白質(zhì)修飾Fig. 1 Protein modifications during pollen development

蛋白質(zhì)修飾是指將功能基團(tuán)或生物大分子共價結(jié)合到多肽鏈，從而改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的一種翻譯后調(diào)控方式。迄今為止，有多種不同的氨基酸修飾在真核生物蛋白中被發(fā)現(xiàn)，它們作用機(jī)制各異，通常影響蛋白活性、穩(wěn)定性、亞細(xì)胞定位以及蛋白間互作。其中，磷酸化(Phosphorylation)、泛素化(Ubiquitination)、類泛素化(SUMOylation)和糖基化(Glycosylation)是在植物各個發(fā)育階段普遍存在的修飾類型。磷酸化修飾是由蛋白激酶催化磷酸基團(tuán)添加到多肽的絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基的過程，而磷酸酶則能實(shí)現(xiàn)蛋白去磷酸化，與激酶共同調(diào)節(jié)蛋白的動態(tài)磷酸化水平。泛素(Ubiquitin，Ubi)和類泛素(Small ubiquitin-like modifier，SUMO)是一類結(jié)構(gòu)相似的小分子量蛋白，能以單分子或多聚鏈的形式共價結(jié)合在底物蛋白的賴氨酸殘基上。泛素化和SUMO化修飾經(jīng)歷相似的過程：Ubi/SUMO分子依次通過E1活化酶、E2結(jié)合酶和E3連接酶被激活并傳遞到底物上。糖基化修飾則依賴糖基轉(zhuǎn)移酶使單糖或多糖和蛋白之間以糖苷鍵共價連接，是一種更復(fù)雜多樣的修飾類型。根據(jù)連接方式的不同，糖基化可分為N-糖基化、O-糖基化和GPI(Glycosylphoshatidylinositol)錨定等類型，且底物與不同類型糖供體的結(jié)合通常由特異的糖基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)，同時存在對應(yīng)的去糖基化酶。這些修飾過程常改變蛋白構(gòu)象、活性和穩(wěn)定性，可影響蛋白定位、添加識別標(biāo)記、調(diào)節(jié)蛋白相互作用等，從而調(diào)控蛋白質(zhì)的功能，在植物生長發(fā)育、物質(zhì)代謝、生物和非生物逆境響應(yīng)等生命活動中發(fā)揮重要作用[7-12]。

1 蛋白磷酸化修飾作用于花粉發(fā)育

1.1 蛋白磷酸化修飾調(diào)控植物生殖器官細(xì)胞分化和花藥形態(tài)建成

花藥是花粉(小孢子)發(fā)育的場所。在雄性生殖發(fā)育早期，花分生組織經(jīng)過多次增殖和分化，形成具有4個藥室的花藥。每個藥室自外向內(nèi)由表皮層、藥室內(nèi)層、中層和絨氈層4層花藥壁體細(xì)胞包裹著小孢子母細(xì)胞[13-14]。在這一發(fā)育階段，類受體激酶(Receptor-like protein kinases，RLKs)介導(dǎo)的磷酸化修飾發(fā)揮了重要作用[15-16]。RLKs是一種常見的跨膜蛋白激酶，通過胞外受體結(jié)構(gòu)域接收配體信號分子，調(diào)節(jié)胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域的活性，從而向下游傳遞外源信號。

目前被報道的RLKs調(diào)控花藥細(xì)胞分化的途徑包括：1) ERf(ERECTA family)類RLKs介導(dǎo)的ERf-MPK3/6-SPL通路調(diào)控藥室形成[17-19]；2) LRRRLKs(Leucine-rich repeat RLKs)蛋白BAM1/2、RPK2及它們的共受體激酶CIKs控制初生壁及次生壁細(xì)胞分裂分化產(chǎn)生4層花藥壁[20-22]；3) LRRRLKs蛋白EMS1/EXS傳導(dǎo)的信號通路調(diào)節(jié)絨氈層細(xì)胞和小孢子母細(xì)胞的分化[23-24]。在這些調(diào)控過程中，常以“胞外配體-RLKs-轉(zhuǎn)錄因子”的信號傳導(dǎo)路徑調(diào)控花藥細(xì)胞分化。其中，由EMS1/EXS介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控機(jī)制最為明確。研究表明，在擬南芥中，涉及EMS1/EXS介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的突變體tpd1、ems1/exs、serk1serk2和bes1均表現(xiàn)為小孢子母細(xì)胞過多和絨氈層缺陷，無法產(chǎn)生可育花粉。研究還發(fā)現(xiàn)，胞外分泌的富半胱氨酸小肽TPD1作為配體與EMS1/EXS的LRR受體結(jié)構(gòu)域結(jié)合，誘導(dǎo)后者發(fā)生磷酸化[25-27]；功能冗余的一對LRR-RLKs蛋白SERK1/2作為共受體與EMS1/EXS相互作用并增強(qiáng)其功能，協(xié)同傳遞信號[28-30]；TPD1-EMS1/EXS-SERK1/2復(fù)合體產(chǎn)生的信號促使轉(zhuǎn)錄因子BES1發(fā)生去磷酸化而被激活，從而調(diào)控絨氈層發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)[31-32]。

此外，在水稻、玉米Zea mays和棉花Gossypium hirsutum中，也相繼鑒定獲得TPD1的同源基因OsTDL1A/MIL2和ZmMAC1、EMS1/EXS的同源基因OsMSP1以及SERK1/2的同源基因GhSERK1，這些基因突變后均會導(dǎo)致雄性不育[33-37]。這些研究表明TPD1-EMS1/EXS-SERK1/2-BES1調(diào)控花藥細(xì)胞分化的通路在植物中是相對保守的。盡管如此，這一通路在單子葉和雙子葉植物的調(diào)控機(jī)制中還是存在差異，表現(xiàn)在不同物種呈現(xiàn)不同的敗育程度和核心調(diào)控基因有不同的表達(dá)模式。例如，與擬南芥相比，水稻和玉米相關(guān)突變體的花藥壁中層和絨氈層均缺失，表現(xiàn)出更嚴(yán)重的細(xì)胞分化紊亂。此外，擬南芥TPD1和EMS1/EXS的時空表達(dá)為先重疊、后分化的模式，而水稻T D L 1 A/M I L 2和MSP1的表達(dá)模式則基本一致。

1.2 蛋白磷酸化修飾精確調(diào)控減數(shù)分裂

小孢子母細(xì)胞分化形成后，需要通過減數(shù)分裂產(chǎn)生單倍體小孢子，后者進(jìn)一步發(fā)育為成熟花粉。減數(shù)分裂首先經(jīng)歷間期的DNA復(fù)制物質(zhì)準(zhǔn)備過程，隨后發(fā)生2次細(xì)胞分裂，第1次細(xì)胞分裂后同源染色體分離、染色體數(shù)目減半，第2次細(xì)胞分裂后姐妹染色單體分離，遺傳物質(zhì)減半。在第1次細(xì)胞分裂時，染色體會發(fā)生聯(lián)會、重組交換等區(qū)別于有絲分裂的活動，這些活動均受到磷酸化修飾的精確調(diào)控。

染色體軸蛋白ASY1是聯(lián)會復(fù)合體組成的必需蛋白。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDKA;1通過介導(dǎo)ASY1的磷酸化修飾維持ASY1在染色體軸的正確定位，同時促進(jìn)其與另一聯(lián)會復(fù)合體蛋白ASY3的互作并調(diào)控其多聚化過程。擬南芥突變體asy1和cdka;1因同源染色體無法正常聯(lián)會而不育，且磷酸化位點(diǎn)突變后的ASY1不能回補(bǔ)asy1表型[38]。除了參與調(diào)控聯(lián)會過程，擬南芥CDKA;1還參與了聯(lián)會后的同源染色體重組交換，其激酶活性的降低導(dǎo)致重組頻率下降，這是由于它可能介導(dǎo)染色體交換標(biāo)記蛋白MLH1的磷酸化，從而促進(jìn)重組交換過程[39]。與之相反，HCR1/PPX1磷酸酶則是減數(shù)分裂中同源染色體交換的抑制因子，但該基因突變后并不造成擬南芥育性變化[40]。染色體重組交換等過程涉及DNA雙鏈斷裂(Double-strandbreak，DSB)產(chǎn)生及修復(fù)，磷酸激酶ATM參與了擬南芥和水稻的DSB修復(fù)過程[41-42]。突變體Osatm同源染色體能正常聯(lián)會，但小孢子母細(xì)胞中出現(xiàn)了非同源染色體異常黏連和DNA片段化，最終導(dǎo)致花粉不育[42]。雖然ATM可直接磷酸化組蛋白H2AX，且H2AX的磷酸化屬于DSB應(yīng)答機(jī)制的一部分，但ATM的突變并不影響水稻減數(shù)分裂時H2AX的磷酸化，說明ATM可能通過介導(dǎo)其他底物磷酸化，進(jìn)而調(diào)控這一過程[42]。

在聯(lián)會和重組交換完成后，同源染色體需要在紡錘體的牽引下實(shí)現(xiàn)分離并被分配到二分體中，在這一階段磷酸化修飾同樣發(fā)揮重要作用。水稻絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶BRK1通過直接或間接介導(dǎo)著絲粒區(qū)組蛋白H2A和H3的磷酸化修飾，并募集SHUGOSHIN1蛋白定位到著絲粒中，維持減數(shù)分裂I紡錘體的正確組裝[43]。突變體brk1在減數(shù)分裂中期I紡錘體形態(tài)異常，導(dǎo)致后期Ⅰ姐妹染色單體提前分離，引起不育[43]。同樣，蛋白去磷酸化修飾對同源染色體的正確分離也起重要作用。擬南芥磷酸酶PP2A通過介導(dǎo)染色體凝聚環(huán)蛋白SYN1/REC8去磷酸化，保護(hù)后者在減數(shù)分裂早期免受降解，該基因突變會導(dǎo)致染色體凝聚力提前喪失，姐妹染色單體在減數(shù)分裂后期I提前分離，育性下降[44-45]。

1.3 蛋白磷酸化修飾參與其他花粉發(fā)育活動

絨氈層是花藥壁最內(nèi)層包裹著小孢子母細(xì)胞的體細(xì)胞層，主要負(fù)責(zé)花藥壁和小孢子母細(xì)胞/小孢子之間的物質(zhì)傳遞和營養(yǎng)輸送，并在減數(shù)分裂期啟動細(xì)胞程序性死亡(Programmed cell death，PCD)。絨氈層PCD的提前或延遲都會造成雄性不育，已報道的多個不育基因共同形成了絨氈層PCD的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，處于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中上游的基因大多數(shù)編碼轉(zhuǎn)錄因子。目前僅有少量報道關(guān)于磷酸化修飾調(diào)控絨氈層PCD過程，其中棉花酪氨酸激酶CKⅠ通過磷酸化淀粉合成酶抑制后者的酶活性，在高溫環(huán)境下，CKⅠ表達(dá)上調(diào)，葡萄糖含量升高導(dǎo)致活性氧平衡被破壞，最終引發(fā)絨氈層PCD延遲，花粉不育[46]。在水稻中，編碼磷酸激酶的2個功能冗余的同源基因TMS10和TMS10L是絨氈層PCD所必需，其中TMS10L的表達(dá)受到低溫誘導(dǎo)。單突變體tms10高溫下絨氈層不降解且花粉不育，低溫時TMS10L能補(bǔ)償TMS10的功能，恢復(fù)育性；雙突變體tms10tms10l在高低溫下均為不育[47]。這些研究提示磷酸化可能廣泛參與花粉發(fā)育對外界環(huán)境的應(yīng)答機(jī)制。

在小孢子壁形成前，四分體由胼胝質(zhì)包裹，后者為小孢子提供保護(hù)功能。水稻凝集素受體激酶LecRK5/LecRK-S.7/DAF1/AP1通過對胼胝質(zhì)合成酶UGP1磷酸化，促進(jìn)花藥中胼胝質(zhì)的合成，維持花粉正常發(fā)育[48]。此外，該蛋白還被報道在花粉外壁和萌發(fā)孔形成、花粉淀粉積累及成熟中發(fā)揮重要作用，說明該蛋白激酶存在多個磷酸化修飾底物[49-51]。在擬南芥中同樣發(fā)現(xiàn)了由凝集素受體激酶編碼基因突變產(chǎn)生的不育突變體sgc，突變體減數(shù)分裂后小孢子壁發(fā)育異常導(dǎo)致花粉不育，其具體調(diào)控機(jī)制可能與水稻相似[52]。

以上在花粉發(fā)育各個階段發(fā)揮作用的蛋白涉及大量的磷酸激酶和磷酸酶，其中多數(shù)為類受體激酶(表1)。

表1 花粉發(fā)育過程中參與蛋白磷酸化修飾的催化酶Table 1 Enzymes for protein phosphorylation during pollen development

2 蛋白泛素化和SUMO化修飾作用于花粉發(fā)育

2.1 蛋白泛素化和SUMO化修飾控制減數(shù)分裂過程

在真核生物中，泛素化修飾參與調(diào)控減數(shù)分裂同源染色體聯(lián)會、染色體重組交換和分離、DSB修復(fù)、端粒束形成等過程，且在不同物種中存在相對保守的調(diào)控機(jī)制[53]。泛素E3連接酶是直接與底物互作，決定泛素化底物特異性的蛋白。因此，泛素E3連接酶數(shù)目繁多，被分為多個蛋白家族。目前，被報道與植物減數(shù)分裂相關(guān)的泛素E3連接酶主要包括SKP1-Cullin-F-box(SCF)復(fù)合體、后期促進(jìn)復(fù)合體/細(xì)胞周期體(Anaphase-promoting complex or cyclosome，APC/C)以及HEI10蛋白[53]。

SCF復(fù)合體中，F(xiàn)-Box蛋白特異性結(jié)合底物SKP1負(fù)責(zé)連接F-Box和Cullin蛋白，Cullin蛋白直接或間接與泛素E2結(jié)合酶互作，將E2上的泛素分子傳遞給底物。擬南芥SKP1突變后花藥減數(shù)分裂時同源染色體聯(lián)會、重組、分離及核仁遷移均出現(xiàn)異常，表示SCF復(fù)合體同時調(diào)控減數(shù)分裂多個步驟[54-55]。SCF主要通過不同的F-Box蛋白對特定底物進(jìn)行泛素化修飾從而實(shí)現(xiàn)不同功能，如水稻F-Box蛋白MOF和ZYGO1同時調(diào)控端粒束形成和同源染色體聯(lián)會，MOF還發(fā)揮DSB修復(fù)功能，突變體mof的花粉降解，zygo1的雌雄配子同時敗育[56-57]。玉米F-Box蛋白ACOZ1則是染色質(zhì)濃縮必需蛋白，突變體染色體維持在細(xì)線期而不進(jìn)入偶線期，端粒束形成和同源染色體配對受阻，DSB形成和修復(fù)不受影響，導(dǎo)致雌雄配子敗育[58]。然而，這些蛋白具體的泛素化修飾底物尚不明確。

APC/C同樣是由多個蛋白組成的復(fù)合體，是植物減數(shù)分裂必需的泛素E3連接酶之一[59]。擬南芥APC/C的組成蛋白APC8以及活性輔助因子CDC20.1被證明參與減數(shù)分裂染色體分離和花粉育性調(diào)控[60-61]。細(xì)胞周期蛋白是APC/C的泛素化底物之一，APC/C通過降解前者調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDKs的活性，從而控制減數(shù)分裂進(jìn)程；同時A P C/C本身又會受到細(xì)胞周期蛋白和CDKs的反饋調(diào)控[53]。例如，擬南芥的細(xì)胞周期蛋白OSD1和TAM功能喪失會導(dǎo)致減數(shù)分裂提前終止，小孢子發(fā)育異常[62]；細(xì)胞周期蛋白編碼基因TDM1突變則會導(dǎo)致減數(shù)分裂無法正確終止，細(xì)胞多次分裂[63]。OSD1通過結(jié)合APC/C的蛋白亞基抑制后者的活性，T A M-C D K A;1通過磷酸化TDM1抑制后者對APC/C的激活作用[62-63]。此外，APC/C還能通過降解PANS1蛋白釋放黏連蛋白分離酶的活性位點(diǎn)，促使后者降解SYN1/REC8，保證減數(shù)分裂后期I同源染色體分離[64]。

HEI10蛋白是攜帶RING結(jié)構(gòu)域的一種泛素E3連接酶，該蛋白與多個ZMM蛋白相互作用共同調(diào)控減數(shù)分裂同源染色體重組交換，擬南芥HEI10突變后染色體重組水平和育性均明顯下降[65-66]。然而，HEI10的具體泛素化修飾底物及其作用機(jī)制尚不完全清楚，有待進(jìn)一步研究。

目前發(fā)現(xiàn)的蛋白SUMO化修飾調(diào)控減數(shù)分裂主要與SMC5/6復(fù)合體的功能相關(guān)。SMC5/6是真核生物染色體結(jié)構(gòu)維持所必需的其中一類復(fù)合體，在DNA損傷修復(fù)、緩解DNA復(fù)制壓力、維持細(xì)胞正常分裂等過程中發(fā)揮作用[67]。SUMO E3連接酶MMS21/NSE2/HPY2與SMC5蛋白互作，是SMC5/6的組成蛋白之一。擬南芥MMS21突變體減數(shù)分裂時染色體出現(xiàn)碎片化及異常黏連，多個減數(shù)分裂相關(guān)基因表達(dá)水平發(fā)生變化，引起雌雄配子育性下降[68]。最新研究表明：擬南芥MMS21或其他SMC5/6組成蛋白的功能缺失均會造成同源染色體分離異常，產(chǎn)生二倍體花粉[69]。而玉米MMS21能對SMC5進(jìn)行SUMO化修飾，從而影響染色質(zhì)的狀態(tài)，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄水平[70]。

2.2 蛋白泛素化和SUMO化修飾調(diào)控減數(shù)分裂后花粉發(fā)育過程

絨氈層PCD的發(fā)生是保證花粉正常發(fā)育的必要條件，該過程也受到蛋白泛素化修飾調(diào)控。擬南芥PUB4和水稻PUB73均編碼U-box泛素E3連接酶，突變pub4絨氈層增厚未及時降解，而pub73的絨氈層則提前出現(xiàn)液泡化，以上2種情況均導(dǎo)致花粉外壁發(fā)育異常而敗育，其中pub4的育性能在低溫環(huán)境下恢復(fù)[71-72]。在水稻中，另一對泛素E3連接酶HUB1和HUB2介導(dǎo)組蛋白H2B的單泛素化，該泛素化修飾通過表觀調(diào)控UDT1、CP1、C4等下游基因的表達(dá)維持絨氈層的正常發(fā)育和降解[73]。此外，編碼細(xì)胞膜定位F-Box蛋白的水稻ADF基因被敲減后同樣會導(dǎo)致絨氈層降解異常，盡管ADF的作用靶標(biāo)尚不清楚，但這表明蛋白泛素化復(fù)合體SCF可能參與了絨氈層的正常降解[74]。

在花粉發(fā)育后期，單倍體小孢子經(jīng)歷2次有絲分裂，最終形成帶有3個細(xì)胞核的成熟花粉。在這一過程中，擬南芥FBL17與SKP1結(jié)合形成SCF復(fù)合體，泛素化降解細(xì)胞周期抑制蛋白，促進(jìn)生殖細(xì)胞發(fā)生第2次有絲分裂[75-76]。除了調(diào)控減數(shù)分裂，擬南芥MMS21也對轉(zhuǎn)錄因子DPa進(jìn)行SUMO化修飾，阻礙E2Fa/DPa轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體的形成與細(xì)胞核定位，后者參與了細(xì)胞周期調(diào)控和花粉有絲分裂過程[77-78]。

另一類SUMO E3連接酶SIZ1和SIZ2被報道與水稻花粉發(fā)育和花藥開裂相關(guān)，而擬南芥去SUMO化蛋白酶SPF1和SPF2被認(rèn)為在SIZ1的下游發(fā)揮功能，這些蛋白的功能喪失均會引起育性下降[79-83]。這些研究提示SUMO化的缺失或過度均會影響正常生殖發(fā)育過程。

上述參與花粉發(fā)育過程中蛋白泛素化和SUMO化修飾的各類催化酶總結(jié)列于表2。

表2 花粉發(fā)育過程中參與蛋白泛素化和SUMO化修飾的催化酶Table 2 Enzymes for protein ubiquitination and SUMOylation during pollen development

3 蛋白糖基化修飾作用于花粉發(fā)育

3.1 蛋白糖基化修飾影響絨氈層和花粉壁發(fā)育

細(xì)胞膜、細(xì)胞壁富含糖蛋白，后者常作為結(jié)構(gòu)成分或信號傳導(dǎo)因子發(fā)揮重要生物學(xué)功能。水稻MTR1編碼細(xì)胞膜定位的成束糖蛋白，該蛋白的N-糖基化位點(diǎn)或膜定位信號缺失均會影響絨氈層和小孢子正常發(fā)育[84]。阿拉伯半乳糖蛋白(Arabinogalactan-proteins，AGPs)是富含脯氨酸的高度糖基化蛋白，研究發(fā)現(xiàn)AGPs在絨氈層、小孢子母細(xì)胞及小孢子等部位高水平表達(dá)，提示該類蛋白參與花粉發(fā)育過程[85-86]。目前已有多個AGPs被報道調(diào)控花粉育性，且主要與花粉壁形成相關(guān)。例如，擬南芥AGP編碼基因FLA3的下調(diào)表達(dá)造成花粉內(nèi)壁發(fā)育異常而不育[87]；白菜Brassica campestrisAGP編碼基因MF8的沉默破壞了花粉壁正常發(fā)育，導(dǎo)致花粉活性下降[88]；水稻AGP編碼基因FLA1突變后烏氏小體和小孢子外壁異常，致使花粉不育[89]；水稻另一個AGP編碼基因DEAP1喪失功能會產(chǎn)生多種發(fā)育紊亂，包括絨氈層延遲降解、花粉外壁缺陷、萌發(fā)孔畸形，進(jìn)一步研究表明DEAP1可能通過與2個萌發(fā)孔發(fā)育相關(guān)蛋白D6PKL3(D6 protein kinase-like 3)互作，參與花粉萌發(fā)孔的形態(tài)建成[90]。半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(Galactosyltransferases，GALTs)主要介導(dǎo)AGPs的半乳糖基化修飾，部分GALTs同樣參與調(diào)控植物的生殖發(fā)育。例如，GALTs編碼基因ZmMs8、KNS4/UPEX1功能喪失分別引起玉米和擬南芥雄性不育[91-92]。KNS4/UPEX1主要通過介導(dǎo)小孢子初生外壁中AGPs的β-1,3-半乳糖鏈合成，維持小孢子外壁的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而確?；ǚ壅０l(fā)育[92]。此外，KNS4/UPEX1突變后會導(dǎo)致四分體胼胝質(zhì)延遲降解，反而幫助部分花粉壁缺陷型光溫敏雄性不育系的花粉育性得到一定程度的恢復(fù)[93]。

3.2 蛋白糖基化調(diào)控花粉后期發(fā)育途徑

在花粉發(fā)育后期的有絲分裂及成熟階段，參與蛋白糖基化修飾的多種糖供體合成和代謝相關(guān)的催化酶，如UDP-糖焦磷酸化酶、N-乙酰氨基葡萄糖-1-P尿甙基轉(zhuǎn)化酶、谷氨酰胺:果糖-6-磷酸酰胺基轉(zhuǎn)移酶，是維持花粉育性正常的必需因子，表明糖代謝及蛋白糖基化修飾在花粉后期發(fā)育階段發(fā)揮著重要作用[94-96]。目前，糖蛋白在花粉發(fā)育后期的功能研究主要在擬南芥中被報道?？赡嫣嵌嚯木幋a基因RGP1和RGP2的突變體、AGP6/AGP11雙基因突變體均表現(xiàn)為有絲分裂異常、花粉不育。攜帶GPI錨定修飾糖鏈的多個非特異脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LTPGs功能同時喪失后，花粉染色正常，但在掃描電鏡觀察下表現(xiàn)為畸形皺縮，表明花粉成熟過程出現(xiàn)問題[97]。同樣受到GPI錨定修飾的天冬氨酸蛋白酶A36和A39在成熟花粉中高水平表達(dá)，該蛋白功能被破壞會導(dǎo)致花粉發(fā)生PCD而不育[98]。花粉特異表達(dá)的伸展蛋白LRXs是參與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)組成的其中一類糖蛋白，它們參與維持細(xì)胞壁穩(wěn)定并調(diào)節(jié)胞內(nèi)生理指標(biāo)特性，保證了成熟花粉的正常萌發(fā)[99]。

以上研究表明，參與花粉發(fā)育過程的糖蛋白及糖基化修飾類型具有多樣性，因此其調(diào)控方式也各不相同。本文總結(jié)了參與花粉發(fā)育時蛋白糖基化修飾的不同催化酶(表3)，這些酶可能同時調(diào)控了多個蛋白的糖基化修飾過程。

表3 花粉發(fā)育過程中參與蛋白糖基化修飾的催化酶Table 3 Enzymes for protein glycosylation during pollen development

4 總結(jié)與展望

盡管目前圍繞不育突變體鑒定及不育基因克隆已開展了大量研究，但這些不育基因的具體作用機(jī)制、基因所在的調(diào)控通路以及各通路之間的互作關(guān)系等問題有待進(jìn)一步明確。除了文中提及的4種常見蛋白質(zhì)修飾，近期少量研究表明蛋白乙?；?、組蛋白甲基化等其他修飾類型也參與了植物生殖發(fā)育調(diào)控過程[100-102]。而目前已有超過300種蛋白翻譯后修飾類型被報道[10]，說明了植物中的育性與生殖發(fā)育相關(guān)蛋白修飾調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能比我們想象的更加復(fù)雜。此外，借助蛋白修飾組學(xué)分析，能夠高效獲得特定發(fā)育時期的花藥/花粉中受到翻譯后修飾調(diào)控的蛋白，為進(jìn)一步的功能驗(yàn)證提供參考。例如，對減數(shù)分裂期的水稻花藥進(jìn)行磷酸化蛋白組測定，發(fā)現(xiàn)3203個蛋白受到磷酸化修飾，這些蛋白參與DNA修復(fù)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程[103]。擬南芥、煙草Nicotiana tabacum、玉米等蛋白磷酸化組學(xué)分析表明，成熟花粉中也存在大量蛋白被磷酸化修飾，其中包括各物種共有的同源蛋白[104]。在水稻幼穗中開展的賴氨酸泛素化修飾組學(xué)研究顯示，鑒定獲得的916個泛素化修飾蛋白中有710個是未經(jīng)報道的新底物蛋白，還包括7個已發(fā)表的花粉發(fā)育相關(guān)蛋白[105]。這些研究表明花粉發(fā)育各個階段的蛋白普遍存在翻譯后修飾，然而這些蛋白是如何通過修飾參與水稻花藥發(fā)育以及生殖過程，如生殖細(xì)胞的分裂分化、絨氈層與小孢子之間的物質(zhì)信息傳遞、花粉與柱頭的識別等，仍是值得研究的重要科學(xué)問題。

另一方面，花粉發(fā)育過程的同一蛋白或同一調(diào)控通路往往涉及多種蛋白修飾的協(xié)同或拮抗作用。例如，在花藥細(xì)胞分化過程中起重要作用的RLKs蛋白激酶，其胞外受體結(jié)構(gòu)域常受到糖基化修飾從而與配體信號分子相互識別。此外，部分蛋白的磷酸化修飾能幫助其被泛素E3連接酶識別并降解，如染色體凝聚環(huán)蛋白SYN1/REC8，該蛋白在減數(shù)分裂后期被磷酸化，隨后通過泛素化途徑降解，促進(jìn)染色體正常分離[44]。又如泛素E3連接酶APC/C通過降解細(xì)胞周期蛋白調(diào)節(jié)CDKs蛋白激酶的活性，而CDKs又能通過磷酸化修飾對APC/C進(jìn)行反饋調(diào)節(jié)[53]。而泛素化和SUMO化修飾普遍被認(rèn)為在蛋白穩(wěn)定性調(diào)控中起拮抗作用，且這2種修飾都在花粉發(fā)育特別是減數(shù)分裂過程中發(fā)揮重要作用，但它們之間確切的調(diào)控關(guān)系仍需具體的研究驗(yàn)證。

綜上，盡管目前關(guān)于蛋白的翻譯后修飾已經(jīng)有相當(dāng)多的研究，但蛋白修飾的多樣性決定了其在調(diào)控花粉發(fā)育過程中的多效性和復(fù)雜性。該領(lǐng)域的研究仍面臨著諸多困難與挑戰(zhàn)：1)同一蛋白往往存在著多種修飾，不同種類的修飾如何彼此作用影響蛋白功能的完整性和蛋白間的相互作用；2)對蛋白修飾的系統(tǒng)性鑒定仍缺乏高效的技術(shù)手段；3)蛋白的修飾存在著一個動態(tài)的過程，蛋白修飾的動態(tài)過程與植物生長發(fā)育之間的關(guān)系存在較多的未解之謎。本文所總結(jié)的蛋白或許僅僅是翻譯后修飾調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的冰山一角，仍有大量相關(guān)功能蛋白以及蛋白翻譯后修飾的生物學(xué)機(jī)制有待進(jìn)一步探索。隨著各種質(zhì)譜技術(shù)和蛋白修飾組學(xué)技術(shù)的不斷興起，并日益走向成熟，我們對蛋白修飾調(diào)控花粉發(fā)育的認(rèn)知將持續(xù)擴(kuò)大和深入，對花粉發(fā)育相關(guān)基因的分子作用機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的了解將不斷完善。