杜 錕，薛貴民，支燕樂，趙珍珠，司盈盈，陳 輝，馬金蓮

1河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，鄭州 450046；2河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，鄭州 450000；3河南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)院，鄭州 450046

組蛋白賴氨酸特異性去甲基化酶1(lysine specific demethylase 1，LSD1)是第一個被發(fā)現(xiàn)的組蛋白去甲基化酶，2004年由施洋課題組所報道[1]。LSD1可通過黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD)催化的氧化反應(yīng)，能特異性去除組蛋白賴氨酸H3K4及H3K9的單甲基和雙甲基[2]，從而激活或者抑制基因的轉(zhuǎn)錄。LSD1通過改變與腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因啟動子區(qū)域組蛋白的甲基化狀態(tài)，從而調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的表達，促進多種腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移[3]。目前，LSD1已被證實是一個重要的致癌驅(qū)動因素和多種腫瘤的治療靶點。研究已顯示，多種黃酮類化合物對LSD1具有較好的抑制活性，為發(fā)現(xiàn)新型抗腫瘤先導(dǎo)化合物打下基礎(chǔ)[4]。但是，不同的黃酮類化合物可顯示較大差異的LSD1抑制活性，和其取代基的變化密切相關(guān)[4]。

菟絲子Cuscutachinensis系旋花科(Convolvulaceae)菟絲子屬(Cuscuta)植物，為一年生寄生草本，廣泛分布于我國東北、西北以及華北等地區(qū)，其種子為中醫(yī)臨床中常用的補益中藥[5]。菟絲子味辛、甘、平，歸肝、腎、脾經(jīng)，具有補益肝腎，固精縮尿，安胎，明目，止瀉等功效[6]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示菟絲子在生殖系統(tǒng)調(diào)節(jié)、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、心腦血管保護和降血糖等方面具有顯著的藥用價值[5]。菟絲子的化學(xué)成分主要為黃酮類化合物，此外還含有木脂素類、萜類和生物堿類等化合物[7]。因此，為進一步了解中藥菟絲子的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，提高其資源綜合利用效率，本文對菟絲子的甲醇部位的化學(xué)成分進行了分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定，并測試了其中黃酮類化合物的LSD1抑制活性，以期發(fā)現(xiàn)具有抗癌作用的先導(dǎo)化合物。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Bruker AVANCE III 500型核磁共振儀、Bruker maxis HD型飛行時間質(zhì)譜(德國Bruker公司)；Flexa型中壓制備液相色譜儀(博納艾杰爾，F(xiàn)L-H050G型半制備型高壓輸液泵，HP-Q-UV100型紫外檢測器，檢測波長：210 nm和254 nm；Agela technologies型色譜工作站)。LC52型高壓制備液相色譜儀(賽譜銳思北京科技有限公司，SP-5030型半制備型高壓輸液泵，UV200型紫外檢測器，檢測波長：210 nm和254 nm；Easychrom型色譜工作站；色譜柱為YMC-Pack ODS-A，250 mm × 20 mm，5 μm)。薄層色譜硅膠GF254、柱色譜硅膠(200～300目，青島海洋化工廠)；Sephadex LH-20(Pharmacia Biotech公司)；RP-C18(40～60 μm，YMC)；大孔樹脂Diaion HP-20(日本三菱化學(xué))；甲醇(色譜純，天津市四友精細化學(xué)品有限公司)；其他試劑均為分析級；HEPES緩沖溶液(北京索萊寶公司)；H3K4me2(上海吉爾生化公司)。

1.2 植物材料

菟絲子于2019年9月購自亳州市藥材市場，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院董誠明教授鑒定為旋花科植物菟絲子CuscutachinensisLam.的干燥成熟種子。憑證樣本(ID-20190920)存于河南中醫(yī)藥大學(xué)天然藥物化學(xué)與中藥化學(xué)研究室。

1.3 化合物的提取分離方法

菟絲子干燥種子2.67 kg，二氯甲烷和甲醇依次浸泡提取3次，濾過，合并提取液，減壓濃縮，分別得到二氯甲烷浸膏171 g和甲醇浸膏60 g。甲醇浸膏加水混懸，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，減壓回收溶劑，得乙酸乙酯部位(11 g)、正丁醇部位(18 g)。乙酸乙酯部位經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜純化(甲醇)，并經(jīng)硅膠薄層色譜檢識，合并相同流分得到16個組分(Fr.A1～A16)。Fr.A6經(jīng)硅膠柱色譜分離(二氯甲烷-甲醇5∶1)，得到組分5個亞流分(Fr.A6-1～A6-5)。Fr.A6-1 經(jīng)制備型HPLC制備(45%甲醇，體積流量3 mL/min)得到化合物6(3.0 mg，tR= 7.9 min)。Fr.A14 經(jīng)制備型HPLC制備(65%甲醇，體積流量 3 mL/min)得到化合物4(2.5 mg，tR= 10.0 min)、5(6.6 mg，tR= 16.5 min)。正丁醇部位經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜純化(甲醇)，并經(jīng)硅膠薄層色譜檢識，合并相同流分得到 15個組分(Fr.B1～B15)。Fr.B2(2 g)經(jīng)硅膠柱色譜分離，依次用二氯甲烷-甲醇(25∶1、15∶1、10∶1)洗脫，得到組分5個亞流分(Fr.B2-1～B2-5)。Fr.B2-3 經(jīng)制備型HPLC制備(20%甲醇，體積流量3 mL/min)得到化合物1(3.0 mg，tR= 13.5 min)。Fr.B7(1.5 g)經(jīng)硅膠柱色譜分離，依次用二氯甲烷-甲醇(25∶1、15∶1、10∶1)洗脫，得到組分5個亞流分(Fr.B7-1～B7-5)。Fr.B7-3 經(jīng)制備型HPLC制備(55%甲醇，體積流量3 mL/min)得到化合物2(7.5 mg，tR= 8.0 min)。Fr.B7-5 經(jīng)制備型HPLC制備(55%甲醇，體積流量3 mL/min)得到化合物3(3.0 mg，tR= 9.0 min)。

1.4 LSD1抑制活性試驗

利用純化好的LSD1重組蛋白，在96孔黑孔板中每孔先加入LSD1重組蛋白與不同濃度的化合物在HEPES緩沖溶液中室溫孵育，后加入反應(yīng)底物H3K4me2溶液于37 ℃恒溫搖床孵育；分別加入Amplex Red溶液，辣根過氧化酶溶液反應(yīng)顯色。最后用熒光酶標儀檢測熒光強度。每板同時設(shè)定空白對照孔與100%對照孔?？瞻卓字械臉悠放cH3K4me2分別用DMSO與緩沖溶液替代，100%孔中的樣品用1.25 μL的DMSO替代。ORY-1001作為陽性對照化合物。酶活實驗重復(fù)3次，使用SPSS20和GraphPad 7.0進行數(shù)據(jù)分析。

2 實驗結(jié)果

2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1淡黃色油狀物，易溶于甲醇；ESI-HR-MS譜給出準分子離子峰m/z241.097 3[M+H]+(calcd for C14H13O2N2，241.097 2)，確定化合物1的分子式為C14H12O2N2，計算其不飽和度為10。1H NMR譜(表1)中，低場區(qū)顯示有1組1，2-二取代的芳香質(zhì)子信號[δH8.18(1H，d，J= 8.0 Hz，H-9)，7.20(1H，dd，J= 8.5，8.0 Hz，H-10)，7.50(1H，dd，J= 8.5，8.0 Hz，H-11)，7.58(1H，d，J= 8.0 Hz，H-12)]，2個烯烴質(zhì)子信號[δH8.20(1H，d，J= 5.2 Hz，H-5)和7.91(1H，d，J= 5.2 Hz，H-6)]，1個活潑質(zhì)子信號[12.0(1H，br s，N-H)]；高場區(qū)顯示1個亞甲基質(zhì)子信號δH2.68(2H，t，J= 7.1 Hz，H-15)。另外，結(jié)合1H-1H COSY譜中的δH2.68(2H，t，J= 7.1 Hz，H-15)，3.32(2H，overlap，H-14)自旋偶合系統(tǒng)和δH2.68(2H，t，J= 7.1 Hz，H-15)的偶合常數(shù)，提示結(jié)構(gòu)中還有1個與溶劑峰重疊的亞甲基質(zhì)子信號3.32(2H，overlap，H-14)；13C NMR及DEPT譜中顯示了10個芳香碳或雙鍵碳(6個次甲基碳δC137.2、127.6、121.5、119.0、112.6、112.0和4個季碳δC140.4、134.2、126.9、121.0)。通過分析HSQC譜中相關(guān)(H-15/δC33.7，H-14/δC29.4)和HMBC譜中遠程相關(guān)(H-14/δC176.3和H-14，H-5/δC145.8)，提示該結(jié)構(gòu)在13C NMR譜中未出現(xiàn)的兩個亞甲基碳(δC33.7、29.4)、一個季碳(δC145.8)和一個羰基碳(δC176.3)信號。通過對以上數(shù)據(jù)和文獻對比分析，推測化合物1為一個β-卡波林類生物堿[8]。結(jié)合1H-1H COSY圖譜中顯示的三個自旋偶合系統(tǒng)(H-9/H-10/H-11/H-12，H-5/H-6和H-14/H-15)(見圖1)，和HMBC圖譜中的關(guān)鍵遠程相關(guān)(H-14/C-2，C-3，C-16；H-5/C-3，C-7；H-6/C-2，C-8和H-9/C-7，C-13)，化合物1鑒定為如圖2所示的結(jié)構(gòu)，命名為菟絲子新堿A(cuscutalin A，1)，是一個新化合物?；衔?的ECD譜沒有Cotton效應(yīng)，同時，經(jīng)IC手性色譜柱無法拆分，因此未確定C-3的絕對構(gòu)型?；衔?的詳細結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)原始圖譜可從本刊官網(wǎng)免費下載(www.trcw.ac.cn)。

表1 化合物1的1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)(500和125 MHz，DMSO-d6)

圖1 化合物1的關(guān)鍵1H-1H COSY和HMBC相關(guān)

圖2 化合物1的結(jié)構(gòu)

化合物2淡黃色油狀物，易溶于甲醇，ESI-MS：m/z463[M-H]-。1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：12.62(1H，s，5-OH)，7.66(1H，dd，J= 8.5，2.0 Hz，H-6′)，7.52(1H，d，J= 2.0 Hz，H-2′)，6.81(1H，d，J= 8.5 Hz，H-5′)，6.39(1H，s，H-8)，6.19(1H，s，H-6)，5.37(1H，d，J= 7.7 Hz，H-1′′)，3.14～3.70(6H，m，H-2′′，3′′，4′′，5′′，6′′)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：156.3(C-2)，133.4(C-3)，177.4(C-4)，161.2(C-5)，98.7(C-6)，164.4(C-7)，93.5(C-8)，156.2(C-9)，103.8(C-10)，121.1(C-1′)，115.1(C-2′)，144.8(C-3′)，148.5(C-4′)，115.9(C-5′)，122.0(C-6′)，101.8(C-1′′)，71.2(C-2′′)，73.2(C-3′′)，67.9(C-4′′)，75.8(C-5′′)，60.1(C-6′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[9]報道一致，故鑒定化合物2為金絲桃苷。

化合物3淡黃色油狀物，易溶于甲醇，ESI-MS：m/z597[M + H]+。1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：12.73(1H，s，5-OH)，7.78(1H，dd，J= 8.5，2.1 Hz，H-6′)，7.49(1H，d，J= 2.1 Hz，H-2′)，6.79(1H，d，J= 8.5 Hz，H-5′)，6.38(1H，s，H-8)，6.18(1H，s，H-6)，5.58(1H，d，J= 7.7 Hz，H-1′′)，5.31(1H，d，J= 1.0 Hz，H-1′′′)，3.03～3.85(11H，m，H-2′′，3′′，4′′，5′′，6′′，2′′′，4′′′，5′′′)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：156.2(C-2)，133.2(C-3)，177.3(C-4)，161.3(C-5)，98.6(C-6)，164.1(C-7)，93.4(C-8)，155.6(C-9)，103.9(C-10)，121.1(C-1′)，115.5(C-2′)，144.9(C-3′)，148.4(C-4′)，115.2(C-5′)，122.4(C-6′)，98.9(C-1′′)，74.7(C-2′′)，73.8(C-3′′)，68.3(C-4′′)，75.7(C-5′′)，60.0(C-6′′)，108.7(C-1′′′)，76.1(C-2′′′)，79.2(C-3′′′)，73.9(C-4′′′)，64.3(C-5′′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[10]報道一致，故鑒定化合物3為槲皮素-3-O-β-D-半乳糖-(2→1)-β-D-芹糖苷。

化合物4淡黃色無定形粉末，易溶于甲醇;ESI-MS：m/z303[M + H]+。1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：12.48(1H，s，5-OH)，7.67(1H，d，J= 2.1 Hz，H-2′)，7.53(1H，dd，J= 8.5，2.1 Hz，H-6′)，6.88(1H，d，J= 8.5 Hz，H-5′)，6.39(1H，d，J= 1.5 Hz，H-8)，6.17(1H，d，J= 1.5 Hz，H-6)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：156.6(C-2)，136.7(C-3)，176.6(C-4)，162.4(C-5)，98.5(C-6)，164.6(C-7)，94.2(C-8)，156.8(C-9)，104.2(C-10)，122.6(C-1′)，115.5(C-2′)，145.7(C-3′)，147.2(C-4′)，116.1(C-5′)，120.8(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[11]報道一致，故鑒定化合物4為槲皮素。

化合物5淡黃色無定形粉末，易溶于甲醇;ESI-MS：m/z287[M + H]+。1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：12.48(1H，s，5-OH)，8.05(2H，d，J= 8.5 Hz，H-2′，6′)，6.91(2H，d，J= 8.5 Hz，H-3′，5′)，6.15(1H，s，H-6)，6.40(1H，s，H-6)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：146.7(C-2)，135.4(C-3)，175.8(C-4)，160.8(C-5)，98.3(C-6)，163.6(C-7)，93.6(C-8)，156.4(C-9)，103.2(C-10)，121.4(C-1′)，129.3(C-2′，6′)，115.1(C-3′，5′)，159.2(C-4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[12]報道一致，故鑒定化合物5為山奈酚。

化合物6無色針狀結(jié)晶(MeOH)，溶于甲醇;ESI-MS：m/z377[M + Na]+。1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：6.92(2H，d，J= 1.2 Hz，H-2，2′)，6.86(2H，d，J= 8.0 Hz，H-5，5′)，6.83(2H，d，J= 8.0，1.2 Hz，H-6，6′)，5.99(4H，s，2 x OCH2O)，4.64(2H，d，J= 4.1 Hz，H-7，7′)，4.11(2H，dd，J= 9.0，6.8 Hz，H-9a，9′a)，3.75(2H，dd，J= 9.0，3.4 Hz，H-9b，9′b)，2.99(2H，m，H-8，8′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[13]報道一致，故鑒定化合物6為芝麻素。

2.2 LSD1抑制活性結(jié)果

對分離量較大的兩個化合物2和5進行了LSD1抑制活性評價，分別設(shè)濃度(C)50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39 μmol/L，ORY-1001濃度設(shè)100 nmol/L。結(jié)果表明，化合物2和5對LSD1顯示出較強的抑制作用，半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為5.74 ± 0.49和3.94 ± 0.27 μmol/L(見圖3)，ORY-1001的抑制率為69%。

圖3 化合物2和5的LSD1抑制活性

3 討論與結(jié)論

本文從菟絲子的甲醇提取物中共分離得到6個單體化合物。其中化合物1是一個消旋體，為一個新的β-卡波林類生物堿，化合物2～5為黃酮類化合物，化合物6為一個木脂素類化合物。菟絲子總黃酮具有較好的體內(nèi)外抗肝腫瘤活性，但其有效成分與作用機制尚未明確[14]。同時，菟絲子的LSD1抑制活性也尚未報道。本文首次對菟絲子中黃酮類化合物2和5進行了LSD1抑制活性評價，結(jié)果顯示兩個化合物均對LSD1具有較強的抑制作用，為完善黃酮類化合物L(fēng)SD1抑制活性的構(gòu)效關(guān)系研究打下基礎(chǔ)。另外，菟絲子中富含黃酮類化合物，但其中生物堿類成分報道較少，本文進一步豐富了中藥菟絲子中生物堿的種類，并為探究其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和更好地開發(fā)利用菟絲子藥材奠定了一定的理論基礎(chǔ)。