曾 麗，陳賽紅，甘思言，杜鎣鎣，張炎達，黃一帆*，馬玉芳*

1中西獸醫(yī)結合與動物保健福建省高等學校重點實驗室；2福建省獸醫(yī)中藥與動物保健重點實驗室，福州 350002；3 福建貝迪藥業(yè)有限公司，寧德 355399

參與機體非特異性免疫的巨噬細胞是機體對抗病原的第一道防線[1]，被激活的巨噬細胞可以釋放多種炎癥因子和細胞因子(如NO和TNF-α)參與機體免疫應答，調節(jié)免疫反應[2]。研究表明，中藥皂苷類成分能夠激活巨噬細胞，增強細胞吞噬能力[3]，促進相關活性分子的分泌，上調相關蛋白的表達等[4]。太子參參須皂苷(Radix Pseudostellariae fibrous roots saponins，RPFRS)是從太子參(Pseudostellariaheterophylla)參須中分離出的生物活性成分之一，具有增強機體免疫、抗氧化等作用[5,6]?，F(xiàn)太子參以主根入藥，根須則棄之不用，造成極大浪費，研究發(fā)現(xiàn)太子參參須中總皂苷平均含量是塊根中的1.14倍[7]。課題組前期研究表明，以皂苷為主要成分的太子參參須提取物對免疫抑制小鼠具有免疫保護作用，能夠增強免疫抑制小鼠的免疫功能[5,6]。目前單獨對RPFRS免疫作用的研究鮮見報道，而小鼠單核巨噬細胞(RAW 264.7細胞)常作為體外免疫活性研究的模型[8]。故本實驗以RAW 264.7細胞為靶細胞，通過檢測RPFRS對其細胞增殖、細胞吞噬活性、相關細胞因子及其mRNA表達等免疫學指標，研究RPFRS體外免疫調節(jié)作用及可能的作用機制，研究旨在豐富RPFRS的免疫學內容，同時為太子參參須的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

RAW 264.7細胞來源于中國上海細胞庫，太子參參須皂苷(柘榮縣所產)采取醇提法自行完成皂苷的提取，經檢測可得皂苷濃度為41.17%。DMEM高糖培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液(PBS)(凱基生物，批號：8122175、20201224)；胎牛血清(Cell Max公司，批號：HQ202003)；含0.25%EDTA的胰酶(美國Hyclone，批號：2121203)；脂多糖(LPS)、MTT、中性紅(美國Sigma公司，批號：127M4030V、1015D0511、20190904)；細胞因子試劑盒(上海邦奕生物有限公司，批號：20201008)；RNAiso Plus(Takara公司，批號：AJ31082A)；ECL化學發(fā)光顯色液(Millipore公司，批號：R1KD49214)；RIPA蛋白裂解液，5×Loading buffer，β-actin，BCA蛋白定量試劑盒(Erwanbiotech公司，批號：20C28C08、C31151711、211090011、20200907)；Protein Marker，Rabbit MyD88抗體，兔抗TLR4抗體(生工生物公司，批號：00082872、00076193、00017692)；NO試劑盒，Rabbit IκB-α抗體(碧云天公司，批號：00059607、10004008)；兔抗TLR2抗體(博奧森公司，批號：200107)；兔抗TRIF抗體，兔抗NF-κB抗體(武漢三鷹公司，批號:115106201、400001571)，其他試劑均為國產分析純。

1.2 RAW 264.7細胞的培養(yǎng)

RAW 264.7細胞用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基(含雙抗)配制的完全培養(yǎng)液于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，選取第4～8代處于對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.3 MTT法測定RAW 264.7細胞的增殖

調整RAW 264.7細胞濃度為2×104個/mL，向96孔培養(yǎng)板中加入100 μL/孔的細胞懸液，再加入100 μL不同濃度RPFRS(終濃度為12.5、25、50、100、200、400、800 μg/mL)溶液，同時設空白對照組(加100 μL DMEM培養(yǎng)液)，每組設3個重復。完成后將培養(yǎng)板置于37 ℃，5%加入20 μL 5 mg/mL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取出，棄上清，于各孔加入150 μL DMSO，避光條件下?lián)u床混勻5 min，在波長為570 nm處檢測OD值。

1.4 中性紅法檢測RAW 264.7細胞吞噬活性

將RAW 264.7細胞以2×104個/孔接種在96孔板中，并在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，向每個孔中加入DMEM培養(yǎng)基作為空白對照孔、LPS作為陽性對照孔和不同濃度的RPFRS(終濃度為12.5、25、50、100、200 μg/mL)作為實驗孔，每個濃度重復4個孔。將96孔板置于含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后除去培養(yǎng)基，加入100 μL/孔的0.075%中性紅并放入培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育30 min。用PBS洗滌三次后，向每個孔中加入150 μL細胞裂解液(乙醇∶乙酸=1∶1)，室溫過夜，570 nm處測量OD值。

1.5 Griess法檢測NO含量

收集用0、12.5、25、50、100、200 μg/mL RPFRS與LPS處理24 h的RAW 264.7細胞的培養(yǎng)物上清液，每組4個重復，取每孔100 μL加到96孔板中，根據(jù)Griess試劑盒說明書進行后續(xù)操作，使用酶標儀在450 nm處測量吸光度，繪制NO的標準曲線，計算NO濃度。

1.6 ELISA法檢測細胞因子含量

收集用0、12.5、25、50、100、200 μg/mL RPFRS與LPS處理24 h的RAW 264.7細胞的培養(yǎng)物上清液，每組4個重復。根據(jù)ELISA試劑盒說明書的步驟檢測IL-6、IL-10、IL-1β和TNF-α的含量，使用酶標儀在450 nm處測量吸光度，再按試劑盒中重組細胞因子的標準曲線計算濃度。

1.7 qRT-PCR法檢測mRNA相對表達量

收集用0、12.5、25、50、100、200 μg/mL RPFRS與LPS處理6 h的RAW 264.7細胞沉淀，使用TRIzol法提取總RNA，加入50 μL的RNase-free水，測RNA濃度和純度。調整RNA的濃度，按照Takara試劑盒說明書將RNA進行逆轉錄，qRT-PCR按照SYBR(Premix EX TaqTM試劑說明書進行操作，引物序列見表1。

表1 基因及引物序列

1.8 免疫印跡(Western blotting)法檢測蛋白表達

RAW 264.7細胞分別用25、50、100、200 μg/mL的RPFRS，DMEM培養(yǎng)基與LPS處理1 h后棄上清，收集細胞，加入細胞裂解液，充分裂解，離心，取上清液，按BCA蛋白定量試劑盒說明書進行操作，根據(jù)被檢測的蛋白相對分子量的大小，配制5%的上層濃縮膠以及最適宜濃度的下層分離膠，將制備好的電泳凝膠置于5×十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)緩沖液中電泳(濃縮膠80 V，分離膠120 V)，結束后將其轉移至硝酸纖維素膜(NC膜)上，冰浴條件下250 mA恒流轉膜2 h，將NC膜放置于封閉液(5%脫脂奶粉的TBS)中，室溫封閉2 h，一抗、二抗孵育，二抗孵育結束后，將NC膜取出放在TBS里面清洗半小時，取培養(yǎng)皿加入等量的化學發(fā)光顯色液A液和B液，混合均勻，再將NC膜置于其中，均勻吹打后，取出NC膜放置于化學發(fā)光成像儀里進行曝光。

1.9 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均應用SPSS Statistics 19.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，LSD法進行多重比較，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 RPFRS對RAW 264.7細胞增殖的影響

RPFRS對RAW 264.7細胞增殖的影響如圖1所示：與空白對照組相比，各濃度的RPFRS均可顯著提高RAW 264.7細胞的增殖作用(P<0.05)，并且對RAW 264.7細胞無毒性作用。當濃度為12.5～200 μg/mL時可極顯著提高RAW 264.7細胞的增殖作用(P<0.01)，且在RPFRS濃度為100 μg/mL時作用最為明顯。所以選擇濃度為12.5～200 μg/mL的RPFRS進行實驗。

圖1 RPFRS對RAW 264.7細胞增殖的影響

2.2 RPFRS對RAW 264.7細胞吞噬活性的影響

RPFRS對RAW 264.7細胞吞噬活性的影響如圖2所示：與空白對照組相比，LPS與不同濃度的RPFRS均可極顯著增強RAW 264.7細胞的吞噬活性(P<0.01)，且在RPFRS濃度為12.5～200 μg/mL時呈上升趨勢。

圖2 RPFRS對RAW 264.7細胞吞噬活性的影響

2.3 RPFRS對RAW 264.7細胞分泌NO含量的影響

RPFRS對RAW 264.7細胞分泌NO含量的影響如圖3所示：與空白對照組相比，12.5 μg/mL與25 μg/mL的RPFRS可顯著增強RAW 264.7細胞分泌NO的能力(P<0.05)，50～200 μg/mL的RPFRS可極顯著提高RAW 264.7細胞分泌NO的能力(P<0.01)，且在RPFRS濃度為12.5～200 μg/mL時呈劑量效應關系。

圖3 RPFRS對RAW 264.7細胞分泌NO的影響

2.4 RPFRS對RAW 264.7細胞培養(yǎng)物上清液細胞因子含量的影響

RPFRS對RAW 264.7細胞培養(yǎng)物上清液細胞因子含量的影響如圖4所示：與空白對照組相比，25 μg/mL與50 μg/mL的RPFRS可顯著增強RAW 264.7細胞分泌IL-6和TNF-α的能力(P<0.05)，100 μg/mL與200 μg/mL的RPFRS可極顯著提高RAW 264.7細胞分泌IL-6和TNF-α的能力(P<0.01)，且在RPFRS濃度為12.5～200 μg/mL時呈劑量效應關系(圖4A、4D)；25 μg/mL的RPFRS可顯著增強RAW 264.7細胞分泌IL-10的能力(P<0.05)，50～200 μg/mL的RPFRS可極顯著提高RAW 264.7細胞分泌IL-10的能力(P<0.01)，且在RPFRS濃度為12.5～100 μg/mL時呈劑量依賴式上升(圖4B)；12.5 μg/mL的RPFRS可顯著增強RAW 264.7細胞分泌IL-1β的能力(P<0.05)，25～200 μg/mL的RPFRS可極顯著提高RAW 264.7細胞分泌IL-1β的能力(P<0.01)，且在RPFRS濃度為12.5～100 μg/mL時呈劑量效應關系(圖4C)。

2.5 RPFRS對RAW 264.7細胞iNOS的mRNA表達量的影響

RPFRS對RAW 264.7細胞iNOS的mRNA表達量的影響如圖5所示：與空白對照組相比，12.5 μg/mL的RPFRS可顯著提高RAW 264.7細胞iNOS的mRNA表達量(P<0.05)，25～200 μg/mL的RPFRS可極顯著提高RAW 264.7細胞iNOS的mRNA表達量(P<0.01)，且在RPFRS濃度為12.5～100 μg/mL時呈劑量效應關系。

圖5 RPFRS對RAW 264.7細胞分泌細胞iNOS的影響

2.6 RPFRS對細胞因子mRNA表達量的影響

RPFRS對細胞因子mRNA表達量的影響如圖6所示：與空白對照組相比，25～200 μg/mL的RPFRS可極顯著提高RAW 264.7細胞IL-6的mRNA表達量(P<0.01)，且呈劑量效應關系(見圖6A)；50 μg/mL的RPFRS可顯著提高RAW 264.7細胞IL-10的mRNA表達量(P<0.05)，100 μg/mL與200 μg/mL的RPFRS可極顯著提高RAW 264.7細胞IL-10的mRNA表達量(P<0.01)，且在12.5～100 μg/mL時呈劑量效應關系(見圖6B)；各濃度的RPFRS均可極顯著提高RAW 264.7細胞IL-1β的mRNA表達量(P<0.01)，且在12.5～100 μg/mL時呈劑量效應關系(見圖6C)；25～200 μg/mL的RPFRS可極顯著提高RAW 264.7細胞TNF-α的mRNA表達量(P<0.01)，且呈劑量-效應關系(見圖6D)。

圖6 RPFRS對RAW 264.7細胞的細胞因子mRNA表達量的影響

2.7 RPFRS對RAW 264.7細胞TLR4受體、MyD88 及NF-κB mRNA表達的影響

RPFRS對RAW 264.7細胞TLR4受體、MyD88 及NF-κB mRNA表達的影響如圖7所示：與空白對照組相比，各濃度的RPFRS均可極顯著降低RAW 264.7細胞TLR4受體mRNA的表達量(P<0.01)，有明顯的劑量依賴性；各個濃度的RPFRS均可極顯著提高RAW 264.7細胞MyD88 mRNA的表達量(P<0.01)，且在RPFRP濃度25～200 μg/mL時呈劑量依賴式上升；25～200 μg/mL的RPFRS可極顯著提高RAW 264.7細胞NF-κB mRNA的表達量(P<0.01)，且在RPFRS濃度12.5～200 μg/mL時呈劑量依賴式上升。

圖7 RPFRS對RAW 264.7細胞TLR4受體、MyD88 及NF-κB mRNA表達的影響

2.8 RPFRS對RAW 264.7細胞NF-κB相關蛋白表達量的影響

RPFRS對RAW 264.7細胞NF-κB相關蛋白表達量的影響如圖8所示：與空白對照組相比，各個濃度的RPFRS均可極顯著提高RAW 264.7細胞TLR2受體和TRIF蛋白的表達量(P<0.01)，前者在RPFRS濃度為100 μg/mL時達到峰值，而后者在50 μg/mL時達到峰值(見圖8A、8D)；各濃度的RPFRS均可降低RAW 264.7細胞TLR4受體的表達量，且在RPFRS濃度為25 μg/mL時達到最低值(見圖8B)；各濃度的RPFRS均可極顯著提高RAW 264.7細胞MyD88蛋白的表達量(P<0.01)，且在RPFRS濃度為100 μg/mL時達到峰值(見圖8C)，該結果與RPFRS對RAW 264.7細胞MyD88 mRNA表達量的影響的結果一致；各濃度的RPFRS均可極顯著降低RAW 264.7細胞IκB-α蛋白的表達量(P<0.01)，且在RPFRS濃度為100 μg/mL時達到最低值(見圖8E)；RPFRS可降低胞漿NF-κB 的表達量(P<0.01)，并且提高胞核的NF-κB的表達量(P<0.01)，且呈劑量依賴式下降和上升(見圖8F、8G)。

圖8 RPFRS對RAW 264.7細胞相關蛋白表達量的影響

3 討論與結論

3.1 RPFRS對RAW 264.7細胞增殖的影響

皂苷有一定的溶血性和毒性，且比其他植物提取物具有更低的中毒劑量，因此在使用時需注意劑量[9]。為確定RPFRS對RAW 264.7細胞是否具有毒性作用并篩選用于實驗的RPFRS的最佳濃度，經MTT法測定不同濃度的RPFRS對RAW 264.7細胞增殖作用的影響，本實驗結果顯示在12.5～800 μg/mL的濃度范圍內RPFRS可極顯著促進RAW 264.7細胞的增殖(P<0.01)，且在12.5～100 μg/mL時呈劑量效應關系，故選擇12.5～200 μg/mL的濃度進行后續(xù)實驗。

3.2 RPFRS對RAW 264.7細胞吞噬活性的影響

吞噬是巨噬細胞的主要功能之一，在非特異性免疫中巨噬細胞可以通過吞噬作用殺死或消化細胞內的病原體或者機體的死亡細胞以及其他大顆?？乖?，而在特異性免疫中，它能夠發(fā)揮免疫調節(jié)及抗原遞呈作用[10]。有研究報道，桔梗皂苷D[11]和球蘭皂苷[12]都可提高小鼠巨噬細胞的吞噬能力。與前人研究一致，本實驗結果表明，RPFRS可以在濃度為12.5～200 μg/mL下以劑量依賴的方式增大RAW 264.7細胞吞噬中性紅實驗的OD值(P<0.01)，說明RPFRS可以增強RAW 264.7細胞的吞噬活性，增強其免疫功能。

3.3 RPFRS對RAW 264.7細胞分泌NO和iNOS mRNA表達的影響

巨噬細胞可通過引起免疫-炎癥反應消滅病原體，也可輔助機體進行特異性免疫應答調節(jié)機體免疫，而由一氧化氮合酶(iNOS)合成的NO則與其發(fā)揮炎癥-免疫反應功能密切相關[13]。Yang等[13]研究發(fā)現(xiàn)太子參蛋白水解物可促進 RAW 264.7細胞分泌NO和TNF-α 活化巨噬細胞，增強其免疫活性。本實驗結果表明，與空白對照組相比，RPFRS可以顯著提高RAW 264.7細胞上清液中NO的含量(P<0.05)，同時，RAW 264.7細胞中的iNOS表達量也極顯著提高(P<0.01)，二者都呈劑量依賴式上升。這結果與Li等[14]研究發(fā)現(xiàn)的黃芪甲苷Ⅳ可提高RAW 264.7細胞上清液NO和細胞iNOS mRNA表達的結果一致。

3.4 RPFRS對RAW 264.7細胞分泌的細胞因子及其mRNA表達的影響

細胞因子，如IL-6、IL-10、IL-1β以及TNF-α主要在局部及全身炎癥反應中發(fā)揮作用。IL-6可誘導B淋巴細胞前體成為抗體分泌細胞[15]。IL-10作為抗炎因子可抑制巨噬細胞活性和IL-6、TNF-α等炎性細胞因子[16]。IL-1β可促使巨噬細胞和中性粒細胞活化及脫顆粒，促進其他炎性因子表達[17]。TNF-α是巨噬細胞對各種刺激反應產生的主要促炎細胞因子，可以促進如IL-6和IL-8等的分泌[18]。Sun等[19]研究發(fā)現(xiàn)大豆皂甙Ab能夠提高RAW 264.7細胞上清液中TNF-α和IL-1β的含量。Li等[14]研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷Ⅳ可以提高RAW 264.7細胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α的含量及其mRNA的表達。本研究結果顯示：與空白對照組相比，RPFRS可劑量依賴式提高RAW 264.7細胞上清液中IL-6、IL-10、IL-1β和TNF-α的含量，且RPFRS對RAW 264.7細胞中IL-6、IL-10、IL-1β以及TNF-α的mRNA表達量也有不同程度提高，說明RPFRS可通過刺激RAW 264.7細胞分泌細胞因子進而對其免疫功能起到調節(jié)作用。

3.5 RPFRS對RAW 264.7細胞NF-κB通路相關蛋白表達的影響

NF-κB作為核轉錄因子，可激活早期防御反應有關的多種基因的表達，從而調控細胞凋亡、免疫應答、炎癥和組織重塑等生理過程[20]。而NF-κB信號通路的激活受多種信號分子刺激，TLR2和TLR4作為模式識別受體家族的成員能在巨噬細胞、B細胞、DC細胞表面高表達，且能監(jiān)視識別疾病相關分子模式而啟動信號通路的信號轉導[21]，后者還可刺激MyD88觸發(fā)信號級聯(lián)誘導NF-κB激活[22]。MyD88與TRIF在胞質內與TLR結合蛋白結合，在泛素的作用下激活MAPK通路還可以促進IκB-α磷酸化激活NF-κB通路，并調節(jié)下游基因的表達[23]。He等[24]研究發(fā)現(xiàn)經不同劑量的桔?？傇碥崭深A后，膠原性關節(jié)炎大鼠踝關節(jié)滑膜組織中的IL-6、IL-1β及TNF-α含量降低，同時TLR2、TLR4、My D88等蛋白水平降低。Shin等[25]研究經熱處理后的人參皂苷Rg1和Rg3，能夠促進RAW 264.7細胞分泌IL-6和TNF-α，并且能夠促進MAPK的磷酸化和IκB-α的降解激活NF-κB傳導途徑。本實驗結果顯示，在RPFRS的作用下，RAW 264.7細胞的TLR4的mRNA表達降低，而MyD88和NF-κB的mRNA表達則升高；與之相符，WB的結果顯示TLR4、IκB-α和胞漿NF-κB蛋白表達降低，TLR2、MyD88、TRIF和胞核NF-κB蛋白表達升高，提示NF-κB從胞漿轉位至胞核。而NF-κB通路被激活后又可反作用于促炎細胞因子介導其轉錄誘導[26]，這也與上述細胞因子含量及mRNA表達的結果相對應，說明RPFRS可以通過TLR2、TLR4介導的TRIF/MyD88-NF-κB轉導途徑激活RAW 264.7細胞。

RPFRS可以促進RAW 246.7細胞的增殖、增強吞噬活性、提高相關細胞因子含量和mRNA表達量，下調TLR4的mRNA表達，上調TLR2、MyD88、TRIF、胞核NF-κB蛋白的表達，下調TLR4、IκB-α及胞漿NF-κB蛋白的表達，并呈一定的劑量效應。提示RPFRS可通過抑制LPS對TLR4的刺激作用而起免疫保護作用，也可能通過TLR2/4-MyD88/TRIF-NF-κB信號通路活化RAW 264.7細胞，參與免疫應答過程，發(fā)揮免疫調節(jié)作用。而RPFRS對RAW 264.7細胞免疫調節(jié)的其他信號通路及其各組分與免疫活性之間的關系有待進一步深入研究。