劉 娜， 劉騰麗， 王 樂(lè)， 梁 瑞△， 王樹(shù)森

（1天津市第一中心醫(yī)院衛(wèi)生部危重病急救醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384；2天津市第一中心醫(yī)院器官移植中心，天津 300190）

糖尿病是一個(gè)重大的全球健康問(wèn)題，其中2 型糖尿病占總發(fā)病率的90%［1］。游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）是參與大多數(shù)生物體能量代謝的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，研究表明，空腹和餐后的FFA 濃度升高會(huì)增加患2 型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)［2］。血漿FFA 濃度的長(zhǎng)期增加會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)紊亂，從而導(dǎo)致β 細(xì)胞功能和活力下降（脂毒性），并因此誘發(fā)2型糖尿病［3］。

胰島功能受損是2 型糖尿病的主要特征之一，其中β 細(xì)胞功能下降或質(zhì)量不足是胰島功能受損的核心機(jī)制。新近的研究表明，β細(xì)胞去分化可能是導(dǎo)致2 型糖尿病β 細(xì)胞功能受損的主要原因［4-6］。我們已發(fā)表的研究中也證實(shí)，缺氧及炎癥信號(hào)通路通過(guò)誘導(dǎo)人胰島β 細(xì)胞發(fā)生去分化從而導(dǎo)致β 細(xì)胞功能障礙［7-8］。因此本研究將主要利用分離得到的中國(guó)人群非糖尿病胰島細(xì)胞，探討棕櫚酸（palmitic acid，PA）對(duì)人胰島功能的影響及其機(jī)制。

材料和方法

1 材料

人胰腺樣本于 2018 年 11 月～2021 年 7 月由天津市第一中心醫(yī)院器官移植中心提供，該研究經(jīng)過(guò)了天津市第一中心醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：2018N161KY），樣本信息見(jiàn)表1。C57BL/6J小鼠購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司。

表1 人胰腺樣本信息Table 1. Clinical characteristics of organ donor

2 主要試劑

胰島消化膠原酶購(gòu)自Serva；CMRL-1066 培養(yǎng)液購(gòu)自 Corning；RPMI-1640 培養(yǎng)液、DMEM 培養(yǎng)液和DMEM/F12培養(yǎng)液及胎牛血清和雙抗購(gòu)自Gibco；RIPA蛋白裂解液購(gòu)自索萊寶；PA購(gòu)自Sigma；人胰島素酶聯(lián)免疫試劑盒和小鼠胰島素酶聯(lián)免疫試劑盒購(gòu)自Mercodia；豚鼠抗胰島素抗體（ab7842）購(gòu)自Abcam；兔抗 NKX6.1 抗體（NBP1-49672）和兔抗 ALDH1A3抗體（NBP2-15339）購(gòu)自 Novus；兔抗 FOXO1 抗體（LSB-5283）購(gòu)自LSBio；兔抗MAFA 抗體（CST79737）和兔抗PDX1 抗體（CST5679）購(gòu)自Cell signaling technology；RNA 逆 轉(zhuǎn) 錄 試 劑 盒 購(gòu) 自 Qiagen；SYBR GREEN購(gòu)自TaKaRa。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 PA 配制 利用0.1 mol/L NaOH 溶液配制40 mmol/LPA 溶液，于75 ℃水浴充分皂化約30 min，最終至無(wú)色透明澄清。將PBS 溶液預(yù)熱至55 ℃，配制40%無(wú)脂肪酸-BSA 溶液。將40 mmol/LPA 溶液和40%無(wú)脂肪酸-BSA 溶液按1∶1 混合，得到20 mmol/LPA存儲(chǔ)液。

3.2 人胰島細(xì)胞的制備 人胰島細(xì)胞的制備在天津市第一中心醫(yī)院GMP 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成。經(jīng)主胰管內(nèi)灌注膠原酶后，應(yīng)用Ricordi 消化系統(tǒng)將胰腺組織消化，保持37 ℃恒溫，利用連續(xù)密度梯度離心法獲得純化的人胰島細(xì)胞［9］。雙硫腙染色法檢測(cè)胰島細(xì)胞純度，F(xiàn)DA/PI染色鑒定胰島細(xì)胞活性，選取純度超過(guò)90%、活性超過(guò)90%的胰島細(xì)胞進(jìn)行本研究。將所提取的胰島細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。

3.3 小鼠胰島細(xì)胞的制備 小鼠斷頸處死后取仰臥位，于近肝門(mén)端膽總管逆行插入27G 靜脈注射針，灌注（2～4）mL 冷膠原酶P 溶液，迅速將整個(gè)胰腺完整地分離放入50 mL 離心管中，于37 ℃水浴鍋消化，用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液終止消化，于4 ℃離心機(jī)中180×g離心2 min。棄上清后，用RPMI-1640培養(yǎng)液重懸，用40 μm篩網(wǎng)過(guò)濾懸液，于4 ℃離心機(jī)中180×g 離心2 min。棄上清后加入Histopaque-1077分離液重懸沉淀，之后沿試管壁緩慢加入 RPMI-1640 培養(yǎng)液，于20 ℃離心機(jī)中 1036.8×g離心20 min。吸取Histopaque-1077 分離液和RPMI-1640 培養(yǎng)液分界處的胰島，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液洗2遍后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)皿中，于顯微鏡下手挑純化胰島細(xì)胞［10］。將所提取的胰島細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。

3.4 細(xì)胞培養(yǎng) 人胰島細(xì)胞培養(yǎng)于添加了10%胎牛血清和1%雙抗的CMRL-1066 培養(yǎng)液中；小鼠胰島細(xì)胞培養(yǎng)于添加了10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640 培養(yǎng)液中；小鼠胰島素瘤βTC-6 細(xì)胞系（ATCC CRL-11506TM）培養(yǎng)于添加了10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)液中；小鼠胰島素瘤NIT-1 細(xì)胞系（ATCC CRL-2055TM）培養(yǎng)于添加了10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM/DF12培養(yǎng)液中。

3.5 PA 處理 將人胰島細(xì)胞和小鼠胰島細(xì)胞培養(yǎng)于低黏附6 孔培養(yǎng)板中，每孔200 個(gè)胰島細(xì)胞，分為對(duì)照組和PA0.6 mmol/L 組；βTC-6 細(xì)胞系按每孔106個(gè)傳于12 孔培養(yǎng)板中，分為對(duì)照組和PA0.6 mmol/L組［11］；NIT-1 細(xì)胞系按每孔5×105個(gè)傳于 12 孔培養(yǎng)板中，分為對(duì)照組和PA0.2 mmol/L 組，均處理48 h 后，收集細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.6 胰島素分泌水平檢測(cè) 收集各組胰島細(xì)胞，按所需數(shù)量（每個(gè)生物學(xué)重復(fù)7～8 個(gè)胰島細(xì)胞）挑選大小接近的胰島細(xì)胞，置于含1.67 mmol/L 葡萄糖的KREB 緩沖液中預(yù)孵育1 h，分別依次在含1.67 mmol/L 和 16.7 mmol/L 葡萄糖的 KREB 緩沖液中，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，收集上清，利用胰島素酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)胰島素含量［12］。收集胰島細(xì)胞用 RIPA 蛋白裂解液裂解（每孔100 μL），使用Bradford 法測(cè)定各孔細(xì)胞裂解液中蛋白含量，ELISA試劑盒檢測(cè)胰島細(xì)胞內(nèi)胰島素含量。

3.7 Western blot 收集各組細(xì)胞，提取總蛋白。將待測(cè)蛋白樣品與5×上樣緩沖液混合后，煮沸變性5 min，立即冰浴2 min 以上。根據(jù)蛋白分子量大小，配制12%的SDS-PAGE，將凝膠置于1× Tris-甘氨酸電泳緩沖液中，取合適量的蛋白樣品上樣，進(jìn)行電泳。電泳停止后將凝膠取出，置于轉(zhuǎn)膜專(zhuān)用的三明治夾中，于轉(zhuǎn)移緩沖液中4 ℃、250 mA 恒流轉(zhuǎn)膜。用5%脫脂牛奶封閉膜，并孵育Ⅰ抗。用1×TBST 洗滌后孵育Ⅱ抗，通過(guò)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法觀察免疫反應(yīng)性條帶，利用ImageJ軟件進(jìn)行蛋白定量。

3.8 RT-qPCR 收集各組細(xì)胞，提取RNA，依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。RT-qPCR 總反應(yīng)體系為20 μL，包括反轉(zhuǎn)錄樣本1 μL，上、下游引物各1 μL，無(wú)菌水7 μL，Syber Green10 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min（40 個(gè)循環(huán)）。mRNA 的相對(duì)表達(dá)量以 36B4 作為內(nèi)參照，通過(guò) 2-ΔΔCT計(jì)算。引物序列見(jiàn)表2、3。

表2 人RT-qPCR引物序列Table 2. The suquences of the human primers

3.9 免疫熒光染色 將收集的人胰島細(xì)胞放入4%多聚甲醛中，4 ℃固定30 min，脫水后經(jīng)石蠟包埋切片（3 μm）。切片脫蠟后，用EDTA 抗原修復(fù)液放在微波爐中進(jìn)行抗原修復(fù)。經(jīng)洗滌、透化、血清封閉后，孵育Ⅰ抗于4 ℃過(guò)夜，然后孵育對(duì)應(yīng)的Ⅱ抗，放入37 ℃恒溫箱中反應(yīng)30 min，最后用 DAPI（Vector）進(jìn)行細(xì)胞核染色。采用Pannoramic MIDI 和Pannoramic Viewer（3DHistech）熒光掃描儀器對(duì)染色切片進(jìn)行掃描和圖像采集。每個(gè)樣本至少選擇6 個(gè)胰島，利用ImageJ 軟件分析目的蛋白表達(dá)的熒光強(qiáng)度，并利用IPP 6.0軟件分析目的蛋白表達(dá)區(qū)域面積。

表3 小鼠RT-qPCR引物序列Table 3. The suquences of the mouse primers

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

全部數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。組間比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，每組數(shù)據(jù)至少重復(fù)3 次，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PA 處理導(dǎo)致人和小鼠胰島細(xì)胞的胰島素分泌受損

為了研究PA 對(duì)β 細(xì)胞功能的影響，我們用PA處理人胰島細(xì)胞后，通過(guò)葡萄糖刺激的胰島素分泌實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖1 所示，高糖（16.7 mmol/L）刺激后，經(jīng)ELISA 檢測(cè)胰島素分泌量，并通過(guò)總蛋白量校準(zhǔn)后，顯示PA 處理的人胰島細(xì)胞組中胰島素分泌水平降低87%，顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)圖1A；在小鼠胰島細(xì)胞中，我們也觀察到相似的結(jié)果，PA 處理的小鼠胰島細(xì)胞中，葡萄糖刺激胰島素分泌降低了80%（P＜0.01），見(jiàn)圖1B。

2 PA抑制了β細(xì)胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平

Figure 1. Palmitic acid（PA）impaired the glucose-stimulated insulin secretion. A：absolute insulin secretion from human islets；B：absolute insulin secretion from mouse islets. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖1 棕櫚酸處理使葡萄糖刺激的胰島素分泌受損

為了探究PA 導(dǎo)致β 細(xì)胞胰島素分泌受損的機(jī)制，我們首先通過(guò)Western blot 檢測(cè)了小鼠β 細(xì)胞系βTC-6 和 NIT-1 中 β 細(xì)胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子 Pdx1 和 MafA的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示PA 處理組較對(duì)照組Pdx1和MafA 的蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖2A、B。RT-qPCR 結(jié)果顯示，PA 處理組較對(duì)照組βTC-6、NIT-1 和小鼠胰島中β 細(xì)胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Pdx1、Nkx6.1 和MafA 的 mRNA 表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），見(jiàn)圖2C～E。且3例非糖尿患者胰島細(xì)胞經(jīng)PA 處理后，結(jié)果亦顯示PA 處理組較對(duì)照組顯著抑制了人胰島β 細(xì)胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PDX1、NKX6.1 和 MAFA 的 mRNA 表達(dá)水平（P＜0.05 或P＜0.01），見(jiàn)圖2F～H。

3 PA 對(duì)人胰島 β 細(xì)胞中 NKX6.1 和 FOXO1 表達(dá)分布的影響

我們進(jìn)一步通過(guò)免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了PA處理后的人胰島β 細(xì)胞中NKX6.1 和FOXO1 的表達(dá)水平及分布情況。結(jié)果如圖3 所示，NKX6.1 主要在人胰島β細(xì)胞的細(xì)胞核中表達(dá)，相較于對(duì)照組，PA處理組人胰島β 細(xì)胞表達(dá)NKX6.1 的平均熒光強(qiáng)度顯著下調(diào)，NKX6.1 表達(dá)面積亦顯著下調(diào)（P＜0.05）。PA 處理組中，未觀察到NKX6.1 由人胰島β 細(xì)胞的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)，29%的insulin 陽(yáng)性細(xì)胞中NKX6.1表達(dá)丟失（見(jiàn)圖3A白色箭頭）。FOXO1則主要在人胰島β 細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，相較于對(duì)照組，PA 處理組人胰島β 細(xì)胞表達(dá)FOXO1 的平均熒光強(qiáng)度下調(diào)，F(xiàn)OXO1 表達(dá)面積亦顯著下調(diào)（P＜0.01），但未觀察到FOXO1 由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位的現(xiàn)象，見(jiàn)圖4。

4 PA對(duì)人胰島β細(xì)胞中ALDH1A3表達(dá)的影響

β細(xì)胞去分化的關(guān)鍵特征是回到祖細(xì)胞樣階段，ALDH1A3 作為祖細(xì)胞的標(biāo)志性分子，通常在去分化的細(xì)胞中富集表達(dá)。3 例非糖尿患者胰島細(xì)胞的RT-qPCR 結(jié)果均顯示，PA 顯著抑制了人胰島 β 細(xì)胞中ALDH1A3的 mRNA 表達(dá)水平（P＜0.01），見(jiàn)圖 5。我們通過(guò)免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了PA 處理后人胰島 β 細(xì)胞中 ALDH1A3 表達(dá)，結(jié)果顯示，ALDH1A3 陽(yáng)性的細(xì)胞均不表達(dá)insulin，與對(duì)照組相比，PA處理組人胰島β 細(xì)胞表達(dá)ALDH1A3 的平均熒光強(qiáng)度無(wú)顯著差異，ALDH1A3 表達(dá)面積亦無(wú)顯著差異（P＞0.05），見(jiàn)圖6。

5 PA誘導(dǎo)人胰島細(xì)胞炎癥反應(yīng)

通過(guò)RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PA 處理后人胰島細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)水平，結(jié)果顯示PA 顯著上調(diào)了人胰島細(xì)胞中 IL-1β 和 COX2 的 mRNA 表達(dá)水平（P＜0.01），見(jiàn)圖7。

討 論

PA 是人體中最普遍的飽和脂肪酸，流行病學(xué)研究顯示PA 和2 型糖尿病密切相關(guān)，且在個(gè)體飽和脂肪酸中，PA 對(duì)糖尿病的發(fā)展具有更高的風(fēng)險(xiǎn)比［13］。因此，我們通過(guò)分離非糖尿患者胰島細(xì)胞和小鼠胰島細(xì)胞，體外暴露于PA 培養(yǎng)48 h，PA 顯著抑制高糖刺激的人胰島細(xì)胞和小鼠胰島細(xì)胞胰島素分泌，導(dǎo)致β細(xì)胞功能受損。

多項(xiàng)機(jī)制研究表明脂肪酸主要通過(guò)激發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激［14-16］，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)和線(xiàn)粒體功能障礙［17-18］，誘導(dǎo) β 細(xì)胞自噬［19-21］，激活 β 細(xì)胞炎癥通路［22-23］，進(jìn)而導(dǎo)致β 細(xì)胞功能衰竭。我們的研究顯示，PA 處理抑制了β 細(xì)胞系中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Pdx1 和MafA的蛋白表達(dá)水平，且抑制了β細(xì)胞系，小鼠及人胰島細(xì)胞中β 細(xì)胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子包括Pdx1、Nkx6.1和MafA 的mRNA 表達(dá)水平。免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了PA 處理引起非糖尿患者胰島β 細(xì)胞中NKX6.1 和FOXO1 蛋白水平表達(dá)降低。研究報(bào)道顯示2 型糖尿病β 細(xì)胞去分化程度隨著病程的發(fā)展而推移，表現(xiàn)為FOXO1 由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核至表達(dá)丟失，NKX6.1 由細(xì)胞核轉(zhuǎn)位至細(xì)胞質(zhì)［5］，我們已發(fā)表的研究也報(bào)導(dǎo)了中國(guó)2 型糖尿患者胰島β 細(xì)胞中NKX6.1 的異常表達(dá)，包括NKX6.1 在細(xì)胞核質(zhì)中均表達(dá)，NKX6.1 僅在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)以及β 細(xì)胞NKX6.1 表 達(dá) 缺 失［24］。 本 研 究 中 PA 處 理 前 后NKX6.1均在人胰島β細(xì)胞細(xì)胞核中表達(dá)，F(xiàn)OXO1均在人胰島β 細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，暫未觀察到NKX6.1和FOXO1 的細(xì)胞轉(zhuǎn)位，但29%的insulin 陽(yáng)性細(xì)胞NKX6.1 表達(dá)缺失。成熟β 細(xì)胞的身份特征由β 細(xì)胞核心轉(zhuǎn)錄因子和胰島素決定［25］，因此，我們認(rèn)為PA誘導(dǎo)非糖尿患者胰島β細(xì)胞發(fā)生了去特征化。

Figure 2. Palmitic acid（PA）inhibited the expression of β-cell key transcription factors. A and B：effect of PA treatment on the protein expression of Pdx1 and MafA in βTC-6 cells and NIT-1 cells；C～H：relative mRNA expression in βTC-6 cells，NIT-1 cells，mouse islets and human islets with or without PA for 48 h. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖2 棕櫚酸抑制β細(xì)胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平

Figure 3. Immunofluorescence staining of NKX6.1 in human islets with or without palmitic acid（PA）treatment. A：PA inhibited NKX6.1 expression in human islet β cells［immunofluorescence staining of NKX6.1（red），insulin（Ins，green）and DAPI（blue）in human islets with or without PA treatment；arrows indicated the β cells without NKX6.1 expression；scale bar=20 μm］；B，C and D：quantification of NKX6.1 expression and β cells with nuclear expression of NKX6.1（NKX6.1nuc+Ins+cells）. Mean±SD. n=10.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖3 棕櫚酸對(duì)人胰島β細(xì)胞中NKX6.1表達(dá)分布的影響

ALDH1A3是成熟 β 細(xì)胞非允許基因，其在 β 細(xì)胞中的異位表達(dá)是β 細(xì)胞去分化特征之一［26］。為了研究PA 處理是否通過(guò)誘導(dǎo)β 細(xì)胞去分化，從而使β細(xì)胞功能受損，我們檢測(cè)了ALDH1A3 在人胰島β 細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示PA 處理后，但并未導(dǎo)致ALDH1A3 表達(dá)的升高，即未發(fā)生向祖細(xì)胞方向的去分化。Nordmann 等［27］用硬質(zhì)酸鹽處理小鼠胰島細(xì)胞，同樣是僅僅觀察到β 細(xì)胞特有的轉(zhuǎn)錄因子和功能基因的變化，但并未觀察到ALDH1A3 的變化，即未發(fā)生去分化，這與我們的研究結(jié)果一致。

我們已發(fā)表的研究證實(shí)了中國(guó)2 型糖尿患者群胰島β 細(xì)胞中炎癥水平上調(diào)，且IL-1β/COX2/PGE2信號(hào)通路在 β 細(xì)胞功能損傷中發(fā)揮重要作用［12，28］。我們的研究發(fā)現(xiàn)PA 促進(jìn)了胰島細(xì)胞中IL-1β 和COX2 mRNA 表達(dá)水平的上調(diào)，推測(cè)PA 可能通過(guò)誘導(dǎo)胰島內(nèi)炎癥水平升高，從而導(dǎo)致β 細(xì)胞功能損傷。以往的研究中也已經(jīng)證實(shí)了炎癥信號(hào)在誘導(dǎo)β 細(xì)胞去分化中發(fā)揮重要作用［27］。然而，盡管脂肪酸急性處理增強(qiáng)了胰島內(nèi)的炎癥信號(hào)，但是僅僅導(dǎo)致β 細(xì)胞功能方面的“去特征化”，并未導(dǎo)致ALDH1A3表達(dá)的升高，發(fā)生向祖細(xì)胞方向的轉(zhuǎn)化?？梢?jiàn)脂肪酸對(duì)β細(xì)胞的毒性作用機(jī)制較為復(fù)雜，所引起的炎癥水平升高只是其中的一部分改變，可能并非主導(dǎo)的信號(hào)通路。

Figure 4. Immunofluorescence staining of FOXO1 in human islets with or without palmitic acid（PA）treatment. A：PA inhibited FOXO1 expression in human islet β cells［immunofluorescence staining of FOXO1（red），insulin（Ins，green）and DAPI（blue）in human islets with or without PA treatment；scale bar=20 μm］；B and C：quantification of FOXO1 expression.Mean±SD. n=10.**P＜0.01 vs control group.圖4 棕櫚酸對(duì)人胰島β細(xì)胞中FOXO1表達(dá)分布的影響

Figure 5. Relative mRNA expression of ALDH1A3 in human islets with or without palmitic acid（PA）treatment. Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs control group.圖5 棕櫚酸處理對(duì)人胰島β細(xì)胞中ALDH1A3 mRNA表達(dá)水平的影響

Figure 6. Immunofluorescence staining of ALDH1A3 in human islets with or without palmitic acid（PA）treatment. A：PA treatment had no effect on ALDH1A3 expression in human islets［immunofluorescence staining of ALDH1A3（red），insulin（Ins，green）and DAPI（blue）in human islets with or without PA treatment；scale bar=20 μm］；B and C：quantification of ALDH1A3 expression. Mean±SD. n=10.圖6 棕櫚酸對(duì)人胰島β細(xì)胞中ALDH1A3表達(dá)的影響

Figure 7. Relative mRNA expression of IL-1β and COX2 in human islets with or without palmitic acid（PA）treatment. Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs control group.圖7 棕櫚酸對(duì)人胰島細(xì)胞中IL-1β 和COX2 mRNA 表達(dá)水平的影響

綜上所述，本研究檢測(cè)PA 暴露對(duì)體外分離的原代人胰島細(xì)胞造成的損傷。首先，我們觀察到PA 處理嚴(yán)重?fù)p傷了胰島細(xì)胞的葡萄糖刺激下胰島素分泌能力；其次，進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究顯示，PA 處理抑制 β 細(xì)胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子 PDX1、NKX6.1、MAFA 和FOXO1 等的表達(dá)，但是并未造成β 細(xì)胞去分化標(biāo)志基因ALDH1A3表達(dá)的升高，及 FOXO1 和 NKX6.1 的錯(cuò)誤轉(zhuǎn)位，提示PA 處理可能誘導(dǎo)了β 細(xì)胞發(fā)生去特征化，進(jìn)而引起β 細(xì)胞功能障礙；第三，對(duì)炎癥信號(hào)通路的研究顯示，PA 處理激活了胰島內(nèi)IL-1β/COX2信號(hào)通路，提示PA 引起的炎癥反應(yīng)可能也參與調(diào)控了β細(xì)胞的去特征化。