李佳妮， 馬 堃， 范曉迪， 張 涵， 馬林納

（1中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京 100091；2中國中醫(yī)科學(xué)院，北京 100700；3中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100091；4天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617）

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指女性40 歲之前出現(xiàn)卵巢功能減退，臨床表現(xiàn)為閉經(jīng)、促性腺激素水平升高，伴有雌激素降低及圍絕經(jīng)期癥狀。目前POF 全球發(fā)病率約為1%，而中國為1%～3.8%，有逐漸上升趨勢［1］。POF 不僅影響患者受孕率，還會增加女性心血管和骨質(zhì)疏松等患病風(fēng)險。POF 的發(fā)病機制尚不明確，可能與原始卵泡池儲存不足、卵泡成熟障礙和閉鎖加速有關(guān)，涉及遺傳、免疫和線粒體異常等因素。sirtuins 能夠調(diào)控原始卵泡發(fā)育，增加卵巢儲備，應(yīng)對氧化應(yīng)激和促進線粒體生物合成，有望成為生殖醫(yī)學(xué)中新型診斷標(biāo)記和治療靶點。本文對sirtuins改善卵巢功能和預(yù)防卵巢衰老的研究進展綜述如下。

1 sirtuins概述

sirtuins是一類依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）的脫乙酰酶，主要通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)蛋白的乙酰化修飾水平，參與許多重要的生物學(xué)過程。哺乳動物sirtuins 包括SIRT1～SIRT7，具有不同的亞細胞定位和酶活性。SIRT1、SIRT6 和 SIRT7 主要存在細胞核中，SIRT3、SIRT4 和 SIRT5 主要定位于線粒體，SIRT2 則存在細胞質(zhì)中，但它們在細胞活動過程中可以重新定位［2］。sirtuins 可催化多種NAD+依賴性反應(yīng)，包括去乙?；?、脫?；虯DP-核糖基化，其功能及酶活性受細胞內(nèi)NAD+濃度或NAD+/NADH 比值變化調(diào)節(jié)。sirtuins 不僅能夠使組蛋白 H3、H4 和 H1 的賴氨酸殘基去乙?；?，也對非組蛋白進行去乙?；揎?，包括轉(zhuǎn)錄因子p53、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和過氧化物酶體增殖物激活受體γ 輔激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor-γ co-activator-1α，PGC-1α），以及DNA 修復(fù)蛋白Werner 解螺旋酶、Ku70 和聚 ADP-核糖聚合酶 1［poly（ADP-ribose）polymerase 1，PARP1］等。

2 sirtuins參與POF發(fā)生發(fā)展的機制

2.1 sirtuins 延緩原始卵泡激活和閉鎖 原始卵泡數(shù)量反映了卵巢的壽命，原始卵泡過度激活和閉鎖會加速卵泡耗竭，導(dǎo)致卵巢衰老，從而可能誘發(fā)POF。熱量限制（calorie restriction，CR）可以增加原始卵泡數(shù)量，延緩成年小鼠卵巢功能衰竭［3］。相反，高脂飲食大鼠原始卵泡數(shù)目明顯減少，閉鎖卵泡數(shù)量增加，其卵巢中內(nèi)源性SIRT1和SIRT6蛋白表達水平降低［4］。CR 增加卵巢儲備的分子機制與上調(diào)sirtuins 表達有關(guān)［5］。在老齡和 POF 小鼠模型中，原始卵泡數(shù)量明顯減少且SIRT1、SIRT3 和SIRT6 表達下調(diào)，而在CR小鼠中卵泡數(shù)量增加且這些sirtuins表達上調(diào)，表明sirtuins與原始卵泡數(shù)量呈正相關(guān)。因此，臨床上可將SIRT1、SIRT3 和SIRT6 作為評估卵巢儲備和生育力水平的潛在指標(biāo)［6］。

卵泡發(fā)育成熟受抑制性和刺激性因子的雙重調(diào)節(jié)，處于一個精密的動態(tài)平衡狀態(tài)。研究表明，sirtuins 通過調(diào)控哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、叉頭框蛋白O3a（forkhead box O3a，F(xiàn)OXO3a）和p53 在原始卵泡激活和閉鎖中發(fā)揮重要作用。敲除小鼠Tsc1和Tsc2基因，mTOR 復(fù)合物 1（mTOR complex 1，mTORC1）呈現(xiàn)高表達同時原始卵泡過度激活，表明mTORC1 是促進卵泡發(fā)育的刺激性因子之一。高脂飲食能夠抑制SIRT1 信號傳導(dǎo)，進而上調(diào)mTOR 的表達，促使卵泡丟失，導(dǎo)致POF的發(fā)生。SIRT1激活劑SRT1720能夠通過下調(diào)卵巢中mTOR 表達水平，增加原始卵泡數(shù)，改善卵巢儲備［7］。FOXO3a 作為卵泡激活的抑制因子，在卵泡生長的早期發(fā)揮作用，減少原始卵泡的消耗［8］。研究顯示CR 可能是通過上調(diào)SIRT1-FOXO3a-核因子E2 相關(guān)因子1（nuclear factor E2-related factor 1，NRF1）-SIRT6 信號來抑制卵泡激活，維持原始卵泡的休眠狀態(tài)［5］。Sirt1基因敲入小鼠的陰道開口時間和第一次動情期均晚于野生型小鼠，免疫組織化學(xué) 顯 示 SIRT1 和 FOXO3a 的 表 達 增 加［9］。 此 外 ，SIRT2 和SIRT3 也能夠正向調(diào)節(jié)FOXO3a，增加卵巢儲備。相反，sirtuins表達缺陷會減少卵泡數(shù)量，加速原始卵泡的耗竭［10］。

p53作為調(diào)控細胞凋亡的關(guān)鍵分子，誘導(dǎo)卵母細胞和顆粒細胞過度凋亡，促進原始卵泡閉鎖。在POF大鼠卵巢組織中，觀察到p53的mRNA 和蛋白表達上調(diào)［11］。通過瞬時轉(zhuǎn)染過表達p53 能夠增加卵母細胞凋亡率，表明p53 參與了原始卵泡閉鎖的發(fā)生［12］。乙?；莗53 介導(dǎo)發(fā)揮效應(yīng)的重要修飾，可調(diào)節(jié) p53 活性與穩(wěn)定。SIRT1、SIRT2 和 SIRT3 表達的增加能夠降低p53 乙?；?，抑制p53 功能，減少卵泡凋亡與閉鎖，維持卵巢儲備［13-15］。SIRT1 降低p53 轉(zhuǎn)錄活性是通過去乙?；痯53 C 端Lys382 位點，間接下調(diào)p53 下游細胞周期負調(diào)控因子p21 和p53上調(diào)的凋亡調(diào)節(jié)因子（p53 up-regulated modulator of apoptosis，PUMA）的表達［16］。p53是誘導(dǎo)凋亡的關(guān)鍵介導(dǎo)者，上調(diào)sirtuins 能夠抑制p53 依賴的細胞周期阻滯和凋亡，減少卵泡閉鎖。

磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B通路也是啟動原始卵泡激活的關(guān)鍵信號，sirtuins 和 PI3K 是否同時調(diào)控 mTOR 和FOXO3的表達尚未闡明。卵泡發(fā)育是一個高度協(xié)調(diào)且精密調(diào)控的生理過程，卵泡閉鎖不僅只有凋亡參與，自噬也參與其中。盡管以上研究證實sirtuins 可通過調(diào)控卵巢衰老的關(guān)鍵基因及通路影響原始卵泡的激活與閉鎖，但sirtuins、PI3K 及自噬之間如何共同調(diào)節(jié)原始卵泡池的數(shù)量，還需深入研究，為揭示POF的發(fā)生機制提供基礎(chǔ)。

2.2 sirtuins 調(diào)節(jié)減數(shù)分裂紡錘體的組裝和染色體分離 紡錘體是卵母細胞減數(shù)分裂過程中重要細胞器，其結(jié)構(gòu)和功能直接影響染色體的遷移和分離。當(dāng)紡錘體組裝錯誤且不斷積累時，卵母細胞減數(shù)分裂受阻，逐漸停止發(fā)育，甚至啟動p53 誘導(dǎo)的細胞凋亡信號通路，導(dǎo)致卵泡閉鎖，加速卵巢衰老。與年齡相關(guān)的卵母細胞質(zhì)量下降與減數(shù)分裂過程中紡錘體異常和染色體非整倍體增加有關(guān)。研究顯示卵母細胞中紡錘體缺陷和染色體的錯誤分離是由于sirtuins的表達降低［17］。組蛋白H4 第 16 位賴氨酸殘基（histone H4 lysine 16，H4K16）低乙?；癄顟B(tài)是維持卵母細胞中動粒功能的關(guān)鍵，高乙?；腍4K16 可破壞著絲粒周圍異染色質(zhì)干擾動粒組裝，損害動粒-微管之間的相互作用。敲除卵母細胞Sirt2將導(dǎo)致H4K16和α-微管蛋白超乙?；?，紡錘體缺陷和染色體分離異常，干擾減數(shù)分裂［18-19］。

在卵母細胞減數(shù)分裂中若紡錘體結(jié)構(gòu)合成錯誤，紡錘體組裝檢查點（spindle assembly checkpoint，SAC）會阻止染色體與異常紡錘體微管結(jié)合，延長細胞周期，直到紡錘體組裝完成，保證染色體正確分配。紡錘體組裝檢查點蛋白BubR1（budding uninhibited by benzimidazole-related 1，BubR1）是 SAC 的核心部分，在監(jiān)控微管動力學(xué)結(jié)構(gòu)中發(fā)揮重要作用。小鼠BubR1低水平導(dǎo)致染色體排列紊亂并影響生殖功能，這可能與SAC 未能及時監(jiān)控紡錘體組裝導(dǎo)致減數(shù)分裂異常有關(guān)［20］。BubR1 低乙酰化對確保紡錘體正確組裝具有重要意義。SIRT2 能夠降低BubR1第243 位賴氨酸殘基（BubR1 lysine 243，BubR1K243）的乙?；?，監(jiān)控紡錘體組裝，保證染色體分離，減少非整倍體卵子的發(fā)生［21］。

糖原合酶激酶3（glycogen synthase kinase 3，GSK3）在小鼠卵母細胞紡錘體極和動粒區(qū)域都有分布，能磷酸化MAP2C、MAP1B和tau等微管相關(guān)蛋白，調(diào)節(jié)微管動力學(xué)和穩(wěn)定性［22］。SIRT3 能夠使 GSK3β第15位賴氨酸殘基（GSK3β lysine 15，GSK3βK15）去乙?；鰪娖浠钚裕{(diào)控微管動粒和紡錘體組裝，減少卵母細胞減數(shù)分裂缺陷的發(fā)生［23］。此外，將來自Sirt3基因缺陷小鼠的卵母細胞用于體外受精，受精率和成胚率明顯降低，并且胚胎植入率和胎兒生長速率均下降［24］。sirtuins表達下調(diào)增加了胚胎發(fā)育缺陷和流產(chǎn)風(fēng)險，其可能與調(diào)節(jié)微管動粒和紡錘體組裝蛋白乙?；皆黾佑嘘P(guān)。

組蛋白乙?；癄顟B(tài)在卵母細胞發(fā)育成熟的不同階段是動態(tài)變化的，減數(shù)分裂過程中發(fā)生的去乙?；瘜τ谌旧w的分離、受精及胚胎發(fā)育至關(guān)重要。通過去乙?；?H4K16、BubR1 和 GSK3，sirtuins 調(diào)控細胞分裂中紡錘體組裝和染色體分離，保護卵母細胞發(fā)育成熟，減少染色體非整倍體產(chǎn)生及胚胎發(fā)育異常。與年齡相關(guān)的組蛋白去乙?；蛔銓?dǎo)致MII期卵母細胞呈高乙?；癄顟B(tài)，這可能是高齡女性卵母細胞發(fā)生高頻染色體非整倍分裂的重要原因。

2.3 sirtuins 參與DNA 損傷修復(fù) 卵母細胞DNA 損傷修復(fù)能力在減數(shù)分裂和卵泡發(fā)育的過程中維持基因組的穩(wěn)定。當(dāng)DNA 損傷得不到及時有效修復(fù)，將導(dǎo)致減數(shù)分裂聯(lián)會過程受阻，卵泡數(shù)目下降，從而可能誘發(fā)POF的發(fā)生。特異性Sirt7敲除小鼠的胚胎在發(fā)育后期或出生后的第一個月死亡，表現(xiàn)出早衰表型，這可能與SIRT7缺失導(dǎo)致DNA 雙鏈斷裂修復(fù)受損有關(guān)［25］。DNA 雙鏈斷裂時，SIRT7 以依賴 PARP1的方式被募集到DNA 損傷位點，使組蛋白H3 第18位賴氨酸殘基（histone H3 lysine 18，H3K18）乙?；浇档?，增加DNA 損傷反應(yīng)因子p53 結(jié)合蛋白1（p53-binding protein 1，53BP1）在受損部位的聚集，募集DNA 損傷修復(fù)蛋白，增加非同源末端連接（nonhomologous end-joining，NHEJ）DNA 修復(fù)效率［26］。在DNA 修復(fù)過程中，SIRT6 也被募集到損傷位點，使組蛋白 H3 第 56 位賴氨酸殘基（histone H3 lysine 56，H3K56）和組蛋白 H3 第 9 位賴氨酸殘基（histone H3 lysine 9，H3K9）去乙?；?，募集ATP 依賴的染色質(zhì)重塑因子SNF2H（sucrose nonfermenting 2 homolog），穩(wěn)定DNA 雙鏈斷裂修復(fù)因子DNA 依賴性蛋白激酶（DNA-dependent protein kinase，DNA-PK），促進損傷修復(fù)［27-28］。此外，SIRT1 和 SIRT6 還可以調(diào)節(jié)端粒延伸所需的端粒逆轉(zhuǎn)錄酶的表達，保持端粒的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和基因完整性［29-30］。SIRT4 通過調(diào)節(jié)線粒體谷氨酰胺代謝在DNA損傷中發(fā)揮作用［31］。

在卵母細胞發(fā)育過程中，sirtuins 通過選擇性去乙酰化組蛋白H3K18、H3K56和H3K9參與染色質(zhì)重構(gòu)，促進53BP1、PARP-1、Ku70 和Werner 蛋白募集至DNA 損傷位點發(fā)揮修復(fù)作用，同時調(diào)控修復(fù)蛋白，抑制端粒磨損，維護卵母細胞基因組的穩(wěn)定性。在DNA 損傷修復(fù)過程中，sirtuins 的研究有利于深入探討卵巢衰老及POF 基因突變的機制和原因。然而，組蛋白乙?；揎椩诼涯讣毎l(fā)育成熟過程中是動態(tài)變化的，改變卵母細胞的乙?；瘜ζ浜蟠硇偷挠绊懸彩俏粗?，這些因素增加了sirtuins 在卵巢衰老領(lǐng)域開發(fā)藥物的難度和復(fù)雜性。

2.4 sirtuins 拮抗卵母細胞氧化應(yīng)激 維持自由基-抗氧化體系的動態(tài)平衡是卵巢行使內(nèi)分泌和生殖功能的保障，在卵巢中適量的氧自由基能夠促進卵泡發(fā)育，長期過度的氧化應(yīng)激會導(dǎo)致卵泡閉鎖［32］，降低卵母細胞數(shù)量和質(zhì)量，加速卵巢衰老。sirtuins 能夠調(diào)控抗氧化酶的活性，清除過量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），提高卵母細胞抗氧化能力。褪黑素是一種非酶類抗氧化物質(zhì)，研究顯示褪黑素通過增加SIRT1的表達降低老齡鼠中ROS水平，提高卵母細胞總抗氧化能力，增加ATP 含量，改善卵母細胞發(fā)育［33］。相反，使用 SIRT1 選擇性抑制劑 Ex527 處理后，卵母細胞中的ROS水平升高，且減數(shù)分裂后期紡錘體和染色體錯位異常增加［34］。在不孕女性患者中觀察到，SIRT1基因變異（rs10509291 和 rs12778366）的頻率明顯升高，SIRT1表達下調(diào)降低了錳超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，MnSOD）水平［35］。在氧化應(yīng)激刺激下，SIRT1通過去乙?；せ頕OXO3a，活化的FOXO3a易位進入細胞核，通過直接與MnSOD啟動子結(jié)合增加MnSOD 蛋白的表達來抵抗ROS，從而保護細胞免受氧化應(yīng)激［36］。

隨著年齡的增長，超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2，SOD2）乙?；街饾u增加，SOD2抗氧化酶活性與其乙?；匠守撓嚓P(guān)。過量的ROS會增加MII 期卵母細胞中紡錘體缺陷和染色體排列紊亂，降低細胞體外成熟率和囊胚形成率。SIRT3能夠通過調(diào)節(jié) SOD2 來調(diào)控抗氧化系統(tǒng)［37-38］。Sirt3敲除的卵母細胞中ROS 水平明顯增加，SOD2 第68 位賴氨酸殘基（SOD2 lysine 68，SOD2K68）乙?；缴撸纹に赝ㄟ^激活SIRT3 能夠逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象［39］。SIRT3 能夠直接去乙酰化SOD2K68，上調(diào)抗氧化酶活性，平衡卵母細胞ROS水平，對卵母細胞成熟和早期胚胎發(fā)育過程中的氧化應(yīng)激起保護作用。

抗氧化酶表達水平下降，持續(xù)和/或過量的自由基生成刺激會對卵巢造成累積性損傷，導(dǎo)致卵泡發(fā)育異常，從而加速卵巢功能的衰退，引發(fā)POF。SIRT1 和SIRT3 可通過直接去乙酰化上調(diào)抗氧化酶表達或激活轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)抗氧化程序，增加抗氧化酶活性，加速ROS的清除，平衡卵母細胞氧化還原狀態(tài)，減輕氧化損傷，保持卵巢內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。sirtuins可作為抗氧化劑清除多余的自由基，保護女性卵巢儲備和功能，但對于POF患者，sirtuins單藥治療或作為輔助用藥的效果如何仍需要確切的臨床試驗證據(jù)。同時，sirtuins的使用須警惕“還原應(yīng)激”的發(fā)生，用藥時機和劑量的把握也是評估其臨床有效性和安全性需要考慮的重點和難點。

2.5 sirtuins 促進線粒體生物發(fā)生 卵母細胞成熟和排卵過程中染色體移動需要消耗大量的能量，其能量主要由線粒體產(chǎn)生的ATP 供給。線粒體的結(jié)構(gòu)和數(shù)量并非靜態(tài)不變，而是由線粒體生物發(fā)生和線粒體自噬功能調(diào)控使線粒體數(shù)量達到動態(tài)平衡，以滿足機體不同階段的能量需求。線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）拷貝數(shù)下降會引起線粒體數(shù)量減少，導(dǎo)致卵母細胞線粒體功能障礙，影響染色單體分離，增加非整倍體發(fā)生。PGC-1α 作為線粒體重塑和生物發(fā)生的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，能夠促進核基因和mtDNA 轉(zhuǎn)錄來協(xié)調(diào)線粒體生物合成。PGC-1α的活性受翻譯后修飾調(diào)節(jié)，SIRT1能夠去乙?；险{(diào)PGC-1α 活性［40-41］?；罨蟮腜GC-1α 進入細胞核，激活NRF1和NRF2，誘導(dǎo)編碼線粒體蛋白的基因表達，繼而激活線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM），增強mtDNA 復(fù)制，調(diào)控線粒體數(shù)量和功能以響應(yīng)機體能量需求［42-43］。

因此，sirtuins 能夠去乙?；{(diào)控PGC-1α 活性，促進線粒體生物發(fā)生和氧化磷酸化，增加mtDNA 拷貝數(shù)，為卵母細胞發(fā)育成熟過程中紡錘體分布和染色體排列提供能量。目前僅有少數(shù)研究證明sirtuins激動劑能夠減輕卵母細胞因能量不足引起的發(fā)育成熟障礙，因此有待更多體內(nèi)體外的研究來充分驗證sirtuins 在線粒體功能中的保護作用，揭示線粒體生物發(fā)生在卵巢中的作用機制和關(guān)鍵靶點，探尋安全有效的sirtuins 激活劑，為POF 和生育力低下的女性提供新的治療策略。

3 總結(jié)

卵巢是女性重要的生殖內(nèi)分泌器官，卵巢功能衰退直接影響女性多系統(tǒng)的健康。POF 是導(dǎo)致女性不孕癥的主要原因，且發(fā)病呈年輕化趨勢。引起特發(fā)性POF 的原因仍未明確，許多患者與遺傳、自身免疫、醫(yī)源性因素等有關(guān)。POF 的發(fā)病機制尚未闡明，未來還需要進一步對卵泡發(fā)育成熟的過程進行探索，揭示POF 發(fā)生發(fā)展的機制，為改善卵母細胞質(zhì)量和發(fā)育潛能提供新的思路。對于POF，臨床主要采用激素替代治療和輔助生殖技術(shù)（assisted reproductive technology，ART）。卵母細胞冷凍是ART中用于女性生育力保存的方法之一，研究顯示玻璃化冷凍會減少 mtDNA 拷貝數(shù)［44］，降低線粒體酶活性［45］，增加ROS水平，損傷卵母細胞線粒體功能，導(dǎo)致受精和胚胎發(fā)育能力低下［46］。臨床上，接受ART 治療的患者也存在卵巢低反應(yīng)和周期取消情況，其根本原因在于卵母細胞質(zhì)量的下降。ART 雖一定程度可提高POF 的妊娠率，但無法從根本上改善患者的卵巢功能，即使成功妊娠，后期還會有胚胎停育的風(fēng)險。

年齡是影響女性生育力及妊娠結(jié)局的獨立危險因素，隨著生育年齡的推后，優(yōu)生優(yōu)育是保證國家人口素質(zhì)的關(guān)鍵，目前尚無最佳的用藥方案，缺乏有效藥物和治療方法從根本上改善卵巢功能，因此探尋安全可靠的藥物來提高卵母質(zhì)量是未來的研究方向。多項研究表明，sirtuins能夠改善卵巢功能，保護女性生殖健康，包括延緩原始卵泡過度激活和閉鎖、調(diào)節(jié)卵母細胞成熟過程中紡錘體的組裝和染色體分離等（表1）。另外，sirtuins通過增加卵母細胞和胚胎中mtDNA 數(shù)量和ATP 含量，提高解凍胚胎的存活率，改善胚胎移植（embryo transplantation，ET）后的妊娠結(jié)局［47-49］。sirtuins 有望成為改善和預(yù)防 POF 的潛在靶點，以sirtuins 為靶點的作用藥物未來可作為ART 預(yù)處理方案，減少因冷凍引起的線粒體損傷，從而提高體外成熟卵母細胞的低溫耐受性和發(fā)育潛能。目前對卵巢細胞中sirtuins表達水平及其精密調(diào)節(jié)機制的研究尚不深入，未來的研究將進一步揭開組蛋白修飾在POF 發(fā)生中的作用。此外，sirtuins 激活藥物大多還停留在細胞和動物實驗，還需進一步深入研究，后續(xù)可通過多中心、大樣本、多階段的臨床試驗來提供證據(jù)支持，為sirtuins 對卵巢衰老的防治提供更多科學(xué)依據(jù)。

表1 sirtuins在POF形成與發(fā)展的作用Table 1. Roles of sirtuins in the formation and development of POF