郭繼深， 豐嘉欣， 溫藝紅， 陳澤潤(rùn)， 李 藝， 朱杰寧，李 暉 ， 徐金東 ， 方咸宏 ， 單志新 ，△

［1南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510280；2華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510006；3華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510006；4廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）廣東省臨床藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510080；5廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）檢驗(yàn)科，廣東 廣州 510080；6廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）麻醉科，廣東 廣州 510080］

心臟肥大是心臟長(zhǎng)期處于壓力負(fù)荷過(guò)重狀態(tài)，導(dǎo)致心肌細(xì)胞代償性肥大，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞體積增大，收縮力增強(qiáng)，以維持正常的血液循環(huán)，同時(shí)使心臟具備一定的儲(chǔ)備力［1］。心臟肥大主要分為生理性肥大和病理性肥大，生理性肥大可長(zhǎng)期維持心臟功能［2］，而病理性肥大是心力衰竭（heart failure，HF）的常見(jiàn)病理前改變［3］。多種信號(hào)通路參與調(diào)控心臟肥大的病理過(guò)程［4］，但其具體的機(jī)制尚不明確；研究并闡明新的心臟肥大調(diào)控機(jī)制，可能為臨床心臟肥大的預(yù)防及治療提供科學(xué)依據(jù)和干預(yù)靶點(diǎn)。

大多數(shù)環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是由宿主編碼基因的外顯子或內(nèi)含子序列通過(guò)反向剪接（back-splicing）形成的，主要機(jī)制可能為長(zhǎng)側(cè)翼反向重復(fù)元件（如Alu 元件）、RNA 結(jié)合蛋白或套索驅(qū)動(dòng)環(huán)化等。circRNA 具有穩(wěn)定的環(huán)形結(jié)構(gòu)，相對(duì)于線性RNA，具有更高的RNA 穩(wěn)定性［5］。circRNA 具有多種生物學(xué)功能，胞核內(nèi)的circRNA 可直接參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、調(diào)節(jié)宿主基因的表達(dá)水平，胞質(zhì)中的circRNA 可能通過(guò)海綿吸附微小RNA、與RNA 結(jié)合蛋白（RNA-binding protein，RBP）相互作用或編碼蛋白等途徑發(fā)揮生物學(xué)作用［6］。既往研究表明，環(huán)狀RNA 與多種心血管疾病密切相關(guān)，參與調(diào)節(jié)心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程［7］，但大多數(shù)circRNA 發(fā)揮生物學(xué)作用的機(jī)制多集中在通過(guò)海綿吸附微小RNA［8］或與RBP 相互作用2種途徑［9］，通過(guò)編碼蛋白對(duì)心臟肥大表型影響及機(jī)制的研究卻少有報(bào)道。

本課題組前期工作顯示，HF 患者心肌組織中circRNA_0000994 表達(dá)顯著上調(diào)，通過(guò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)circBank 預(yù)測(cè)其可能包含了內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（internal ribosome entry site，IRES）及開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF），提示 circRNA_0000994可能具有編碼功能。circRNA_0000994 來(lái)源于溶質(zhì)載體家族 8 成員 A1（solute carrier family 8 member A1，SLC8A1），該基因可編碼鈉鈣離子交換器1（Na+-Ca2+exchanger 1，NCX1；一種逆向膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）。本文利用HF 患者心肌組織檢測(cè)circRNA_0000994 的表達(dá)特征，利用原代分離新生小鼠心室肌細(xì)胞（neonatal mouse ventricular cardiomyocytes，NMVCs），通過(guò)重組腺病毒rAd-circRNA_0000994 介導(dǎo)過(guò)表達(dá)該circRNA，探究circRNA_0000994 及其編碼蛋白對(duì)心肌細(xì)胞肥大相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控作用。

材料和方法

1 動(dòng)物

新生（1～3 日齡）SPF 級(jí)C57BL/6 乳小鼠，雌雄不限，購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SCXK（粵）2013-0034。

2 細(xì)胞株和主要試劑

本文所用細(xì)胞株購(gòu)自ATCC 細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、胰蛋白酶（0.25% trypsin-EDTA）、膠原酶 II 及 DMEM/F12 培養(yǎng)液購(gòu)自 Gibco；血管緊張素 II（angiotensin II，Ang II）購(gòu)自Sigma-Aldrich；iFluor? 647 標(biāo)記鬼筆環(huán)肽購(gòu)自 Yeasen；Lipofectamine RNAiMax 和 Trizol 試 劑 購(gòu) 自 Invitrogen；RIPA 裂解液和考馬斯亮藍(lán)超快染色液購(gòu)自Beyotime；4× SDS loading Buffer 購(gòu) 自 TaKaRa；預(yù) 混 型qPCR 試劑盒（2× SYBR Green Premix）和逆轉(zhuǎn)錄試劑預(yù)混液（Evo M-MLV RT Premix）購(gòu)自Accurate Biology；PVDF 膜和ECL 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Millipore；蛋白酶和磷酸酶抑制劑微型片劑及BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher Scientific；siRNA 購(gòu)自Ribobio；兔抗 β-肌球蛋白重鏈（β-myosin heavy chain，β-MHC）抗體、兔抗骨骼肌肌動(dòng)蛋白α1（skeletal muscle actin alpha 1，ACTA1）抗體、兔抗NCX1 抗體和鼠抗GAPDH 抗體購(gòu)自Protein Technology；兔抗心房鈉尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）抗體購(gòu)自Bioworld；抗兔和抗小鼠Ⅱ抗購(gòu)自invitrogen；其他生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

3 主要方法

3.1 實(shí)驗(yàn)組織 本文所利用的18 份健康器官捐獻(xiàn)者和28 份HF 患者心肌組織樣品均獲得患者知情同意，并經(jīng)廣東省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（No.GDREC2016255H），手術(shù)樣品來(lái)源：廣東省心血管病研究所。

3.2 NMVCs的分離與培養(yǎng) 取10只1～3日齡的SPF級(jí)C57BL/6小鼠心臟置于預(yù)冷的PBS溶液中，修剪心臟周?chē)难芙M織，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管，加入10 mL胰蛋白酶（0.1%trypsin-EDTA），4 ℃、70 r/min水平震蕩消化過(guò)夜。次日，加入終止消化后加入7 mL 無(wú)血清 F12 和 70 μL 膠原酶 II，37 ℃、70 r/min 水平震蕩消化10 min，用巴氏管吹打直至組織完全消化，立即用完全培養(yǎng)液終止消化，使用70 μm濾網(wǎng)過(guò)濾，300×g離心5 min，棄上清，用完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞沉淀，轉(zhuǎn)移至T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5～2 h，進(jìn)行差速貼壁，未貼壁的即為NMVCs，將分離的NMVCs 懸液均勻鋪于預(yù)先用鼠尾膠原I包裹的12孔板，待細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)24 h，用PBS清洗細(xì)胞，更換完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h后處理。

3.3 RT-qPCR 檢測(cè) 利用Trizol 試劑提取人心肌組織或者 NMVCs 的總 RNA，取 1 μg 總 RNA 采用逆轉(zhuǎn)錄試劑預(yù)混液（Evo M-MLV RT Premix）逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，利用ViiA 7 Quantitative PCR System（Applied Biosystems）進(jìn) 行 qPCR 檢 測(cè) circRNA_0000994、SLC8A1 mRNA 及心臟肥大標(biāo)志物mRNA 表達(dá)水平。以GAPDH 為胞質(zhì)內(nèi)參照，U6 為胞核內(nèi)參照，利用2-ΔΔCt法比較目的基因的表達(dá)差異。本文所用qPCR引物序列見(jiàn)表1。

表1 qPCR引物序列Table 1. The sequences of the primers for qPCR

3.4 Western blot 檢測(cè) 利用RIPA 裂解液（加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑）提取細(xì)胞樣品，采用BCA試劑盒測(cè)定樣品的蛋白濃度，取20 μg 蛋白樣品，加入4×SDS loading buffer 混勻，99 ℃變性 10 min 后進(jìn)行SDS-PAGE，將凝膠中的蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，用Ⅰ抗［β-MHC 和ACTA1 抗體（1∶2 000），ANP和NCX1抗體（1∶1 000），GAPDH抗體（1∶5 000）］4 ℃過(guò)夜孵育。TBST 溶液漂洗 3 次，每次 10 min，用相同種屬的抗兔或抗小鼠Ⅱ抗（1∶5 000）室溫孵育 1 h，TBST 溶液漂洗 3 次，每次 10 min。使用LAS 500 超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀顯影，ImageJ 軟件進(jìn)行圖像灰度分析，采用目的蛋白/內(nèi)參的灰度值比值比較蛋白的表達(dá)水平，細(xì)胞內(nèi)參照為GAPDH。

3.5 鬼筆環(huán)肽染色 將分離的NMVCs 懸液均勻鋪于預(yù)先用鼠尾膠原I包裹的共聚焦培養(yǎng)皿，經(jīng)重組腺病毒感染或siRNA 轉(zhuǎn)染處理24 h 后，吸干培養(yǎng)液，用PBS 漂洗2 次；加入500 μL 4 %多聚甲醛固定液，室溫靜置20～30 min，棄去多聚甲醛固定液，PBS 漂洗2次，每次 10 min；加入 500 μL 0.5% TritonX-100 透化液，室溫靜置5 min，棄去透化液，PBS 漂洗2 次；加入500 μL 新鮮配制的鬼筆環(huán)肽工作液（1 mL 1% BSA溶液加入1 μL 1 000× iFluor? 647 標(biāo)記鬼筆環(huán)肽），室溫避光染色 60～90 min，PBS 漂洗 2 次，每次 10 min，滴入5 滴DAPI 封片劑，置于4 ℃避光保存，使用SP5-FCS激光共聚焦顯微鏡拍攝圖片。

3.6 考馬斯亮藍(lán)染色 染色：蛋白樣品利用SDSPAGE分離后，去離子水潤(rùn)洗1次，加入20 mL考馬斯亮藍(lán)超快染色液，于水平搖床40 r/min 室溫染色30 min；脫色：棄去染色液，加入適量去離子水，于水平搖床40 r/min 室溫脫色2 h，每隔30 min 更換新的去離子水，繼續(xù)在搖床上脫色。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用GraphPad Prism 9.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)；多組間均數(shù)比較先進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)，方差齊性檢驗(yàn)后采用單因素方差分析，并用Bonferroni 校正的t檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 circRNA_0000994在HF心肌組織中表達(dá)增加

RT-qPCR 結(jié) 果 顯 示 ，circRNA_0000994 及SLC8A1 mRNA 在HF 心肌中表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），見(jiàn)圖1A。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，circRNA_0000994 的反向引物能以人的cDNA 模板擴(kuò)增出特異性條帶，而不能以人的基因組DNA（genomic DNA，gDNA）為模板擴(kuò)增出條帶（圖1B）。circRNA_0000994 的序列來(lái)源于宿主基因SLC8A1第一個(gè)外顯子的全部序列，長(zhǎng)度1 832 nt；Sanger 測(cè)序證實(shí)檢測(cè)到的circRNA_0000994 包含特征的接頭序列，見(jiàn)圖1C。放線菌素D實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，circRNA_0000994的相對(duì)表達(dá)水平顯著高于SLC8A1 mRNA（P＜0.01），見(jiàn)圖 1D。RNase R 實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，circRNA_0000994 能夠耐受RNase R 消化，而線性SLC8A1 mRNA 很容易被RNase R 消化（P＜0.05），見(jiàn)圖1E。RNA 核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示circRNA_0000994 在人AC16 心肌細(xì)胞的胞質(zhì)中較豐富，見(jiàn)圖1F。

2 circRNA_0000994 抑制心肌細(xì)胞肥大相關(guān)基因的表達(dá)

利用定向克隆構(gòu)建circRNA_0000994 的重組腺病毒rAd-circRNA_0000994 并用于感染NMVCs。rAd-circRNA_0000994感染NMVCs，熒光顯微鏡視野下可見(jiàn)大部分細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP），提示rAd-circRNA_0000994 已充分感染NMVCs（圖2A）；RT-qPCR 結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)circRNA_0000994 在 NMVCs 中得到有效表達(dá)（P＜0.01），見(jiàn) 圖 2B。在 過(guò) 表 達(dá) circRNA_0000994 的NMVCs 中，心臟肥大相關(guān)基因Myh7（編碼β-MHC 蛋白）、Acta1和Nppa（編碼ANP 蛋白）的mRNA 表達(dá)水平顯著降低（圖2C）。Western blot 結(jié)果顯示，rAdcircRNA_0000994 感染NMVCs 后，心臟肥大相關(guān)蛋白β-MHC、ACAT1 和ANP 表達(dá)水平也顯著下調(diào)（圖2D）。鬼筆環(huán)肽染色結(jié)果顯示，Ang II處理的NMVCs表面積明顯增大，而過(guò)表達(dá)circRNA_0000994 可有效抑制Ang II誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)（圖2E）。

3 circRNA_0000994可翻譯蛋白SLC8A1-605aa

根據(jù)在線數(shù)據(jù)庫(kù)circBank（http：//www.circbank.cn/index. html）的預(yù)測(cè)結(jié)果，circRNA_0000994 序列中包含一個(gè)跨越接頭序列的ORF 和一個(gè)IRES，提示circRNA_0000994 具有編碼蛋白的潛能。預(yù)測(cè)circRNA_0000994 的ORF 序列可編碼605 個(gè)氨基酸，因此命名為SLC8A1-605aa，該蛋白的C 端包含2 個(gè)特異的氨基酸RL（圖3A、B）。通過(guò)SDS-PAGE 分離過(guò)表達(dá)circRNA_0000994 的人AC16 細(xì)胞總蛋白，結(jié)合考馬斯亮藍(lán)染色，在65～75 kD 之間的可見(jiàn)一條差異條帶；切割該位置凝膠行MS shot-gun分析，可鑒定到與預(yù)測(cè)的SLC8A1-605aa 蛋白一致的肽段序列（圖3C），而且利用NCX1多抗通過(guò)Western blot 檢測(cè)可證實(shí)SLC8A1-605aa蛋白的表達(dá)（圖3D）。

4 circRNA_0000994 通過(guò)編碼蛋白SLC8A1-605aa發(fā)揮抑制NMVCs肥大的作用

為了驗(yàn)證SLC8A1-605aa 蛋白的功能，我們構(gòu)建了可表達(dá)SLC8A1-605aa 的重組腺病毒載體，命名為rAd-circRNA_00000994-ORF。 Western blot 結(jié) 果 顯示 ，利 用 rAd-circRNA_0000994 和 rAd-circRNA_00000994-ORF 分別感染NMVCs，心臟肥大相關(guān)蛋白β-MHC、ACAT1 和ANP 表達(dá)均顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖4A。鬼筆環(huán)肽染色結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)circRNA_0000994 和 SLC8A1-605aa 可一致減弱 Ang II 誘導(dǎo)的NMVCs 肥大反應(yīng)（P＜0.05），見(jiàn)圖4B。進(jìn)一步的，在過(guò)表達(dá)circRNA_0000994 的NMVCs 中轉(zhuǎn)染SLC8A1-605aa siRNA，Western blot 結(jié)果顯示，SLC8A1-605aa siRNA 可 降 低 circRNA_0000994 翻 譯 SLC8A1-605aa水平，而敲減SLC8A1-605aa 表達(dá)能有效減弱circRNA_0000994 抑制NMVCs 中心臟肥大相關(guān)蛋白的表達(dá)（P＜0.05），見(jiàn)圖4C。

討 論

心臟肥大是心臟應(yīng)對(duì)壓力或容量負(fù)荷時(shí)的一種代償性調(diào)節(jié)，以維持心臟原有的泵血功能。然而，長(zhǎng)時(shí)間的病理性刺激引起的心臟肥大將最終導(dǎo)致HF。前期對(duì)HF 患者心肌的RNA 測(cè)序結(jié)果提示circRNA_0000994 表達(dá)增加。circRNA_0000994 是人心臟中表達(dá)豐度最高的 circRNA 之一［10］，它與編碼 NCX1 的SLC8A1基因序列同源［11］。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)在HF患者心肌組織中circRNA_0000994 表達(dá)水平顯著高于其宿主基因SLC8A1，提示該circRNA 可能參與心臟肥大病理過(guò)程的調(diào)節(jié)。

Figure 1. Up-regulation of circRNA_0000994 and its host gene in the myocardium of patients with heart failure（HF）. A：the expression of circRNA_0000994 and SLC8A1 mRNA in the human myocardium was detected by RT-qPCR（n=18 to 28）；B：PCR detection of circRNA_0000994 and SLC8A1 by divergent（??）and convergent（??）primers in human cDNA and genomic DNA；C：circRNA_0000994 sequence is derived from exon 1 of SLC8A1 gene，and the sequence of back splicing site in circRNA_0000994 was confirmed by Sanger sequencing；D：the levels of circRNA_0000994 and SLC8A1 mRNA were measured after treatment with 2 g/L actinomycin D at the indicated time points（n=3）；E：the levels of circRNA_0000994 and SLC8A1 mRNA in RNase R-treated total RNA（20 U/mg RNA）were detected by RT-qPCR（n=3）；F：circRNA_0000994 was abundant in the cytoplasm of human AC16 cardiomyocytes（n=3）. GADPH and U6 were used as positive controls in the cytoplasm and nucleus，respectively. Mean±SD.*P＜0.05，**P＜0.01 vs healthy donors；#P＜0.05，##P＜0.01 vs SLC8A1 mRNA；△△P＜0.01 vs mock group.圖1 環(huán)狀RNA circRNA_0000994及其宿主基因在心衰患者心肌組織中表達(dá)上調(diào)

Figure 2. Over-expression of circRNA_0000994 inhibited the expression of cardiac hypertrophy-related genes in NMVCs. A：the infection efficiency of rAd-circRNA_0000994 was monitored by the co-expressed marker green fluorescent protein（scale bar=100 μm）；B：the expression of circRNA_0000994 was determined by RT-qPCR；C：the mRNA expression of Myh7，Acta1 and Nppa in NMVCs was detected by RT-qPCR；D：the protein expression of β-MHC，ACTA1 and ANP in NMVCs was detected by Western blot assay；E：morphological changes of NMVCs observed by phalloidin-iFluor 647 staining（scale bar=50 μm）. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs vector group；##P＜0.01 vs vector+vehicle group；△△P＜0.01 vs vector+Ang II group.圖2 過(guò)表達(dá)circRNA_0000994抑制新生小鼠心室肌細(xì)胞中肥大相關(guān)基因的表達(dá)

circRNA 是由mRNA 反向剪接產(chǎn)生的共價(jià)閉合RNA，具有較高的穩(wěn)定性［12］。人類(lèi)基因組可編碼數(shù)以萬(wàn)計(jì)的circRNAs，而其中絕大部分功能仍未知［13］。長(zhǎng)期以來(lái)，人們認(rèn)為circRNA 是通過(guò)海綿吸附微小RNA 或與 RBP 相互作用直接參與各種生物過(guò)程［14］。近年來(lái)，已有多項(xiàng)證據(jù)表明circRNA 可以通過(guò)編碼蛋白來(lái)調(diào)節(jié)腫瘤的進(jìn)展［15］。由于編碼蛋白與宿主蛋白具有高度同源性，其可能作為“誘餌”減少宿主蛋白的降解［16］，從而增強(qiáng)宿主蛋白的功能或通過(guò)與宿主蛋白競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合下游信號(hào)分子，從而抑制宿主蛋白的功能［14］；還可以直接與下游信號(hào)分子結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)功能［15］。

Figure 3. Identification of circRNA_0000994-translated SLC8A1-605aa protein. A：the potential IRES and ORF sequences in circRNA_0000994；B：the predicted amino acid sequences of circRNA_0000994-translated SLC8A1-605aa protein；C：total protein from human AC16 cardiomyocytes with over-expression of circRNA_0000994 was separated by SDS-PAGE，and the differential protein bands between 65 to 75 kD were cut and used for mass spectrum shot-gun analysis；D：the expression of SLC8A1-605aa in AC16 cells with over-expression of circRNA_0000994 was detected by Western blot.圖3 circRNA_0000994編碼蛋白SLC8A1-605aa的鑒定

Figure 4. circRNA_0000994 inhibited cardiomyocyte hypertrophy by translating SLC8A1-605aa protein. A：the protein expression of β-MHC，ACTA1，ANP and SLC8A1-605aa in NMVCs with over-expression of circRNA_0000994 or SLC8A1-605aa；B：morphological changes of NMVCs observed by phalloidin-iFluor 647 staining（scale bar=50 μm）；C：the protein expression of β-MHC，ACTA1，ANP and SLC8A1-605aa in NMVCs was detected by Western blot. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs vector group；##P＜0.01 vs vector+vehicle group；△P＜0.05 vs vector+Ang II group；$$P＜0.01 vs vector+si-NC group；▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs vector+si-circRNA_0000994-ORF group.圖4 circRNA_0000994通過(guò)翻譯SLC8A1-605aa蛋白發(fā)揮抑制心肌細(xì)胞肥大的作用

目前，有翻譯功能的circRNA 在心肌重構(gòu)調(diào)節(jié)方面的報(bào)道不多。有研究表明，circRNA-Nlgn 在心肌重構(gòu)中表達(dá)上調(diào)，而且能通過(guò)翻譯蛋白Nlgn173與lamin B 結(jié)合入核，進(jìn)一步激活血清及糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)激酶 3（serum and glucocorticoid-inducible kinase-3，SGK3）和生長(zhǎng)蛋白4 抑制因子（inhibitor of growth protein 4，ING4）啟動(dòng)子參與心肌重構(gòu)過(guò)程［17］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，circRNA_0036176可通過(guò)編碼蛋白Myo9a-208aa 發(fā)揮抑制心肌成纖維細(xì)胞增殖的作用，而 miR-218-5p 可通過(guò)與 circRNA_0036176 結(jié)合來(lái)抑制編碼蛋白Myo9a-208aa 的表達(dá)，從而減弱circRNA_0036176 對(duì)心肌成纖維細(xì)胞增殖的抑制作用［18］。本文通過(guò)預(yù)測(cè) circRNA_0000994 具有的潛在ORF 及IRES 序列，利用特異性抗體及質(zhì)譜shot-gun技術(shù)鑒定了編碼蛋白SLC8A1-605aa 的存在。功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)SLC8A1-605aa 與circRNA_0000994 同樣具有抑制心肌細(xì)胞肥大的作用；進(jìn)一步的功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，利用siRNA 靶向沉默circRNA_0000994 上SLC8A1-605aa 的ORF 序列，能有效減弱circRNA_0000994 抑制心肌細(xì)胞肥大的作用，提示circRNA_0000994 可能通過(guò)翻譯SLC8A1-605aa 蛋白發(fā)揮抑制心肌細(xì)胞肥大的作用。

綜上所述，本文證實(shí)circRNA_0000994 在HF 心肌中表達(dá)上調(diào)，且能夠編碼蛋白SLC8A1-605aa 來(lái)發(fā)揮抑制心肌細(xì)胞肥大的作用。而對(duì)于SLC8A1-605aa通過(guò)何種途徑發(fā)揮抑制心肌細(xì)胞肥大的作用，我們將繼續(xù)探究其相關(guān)信號(hào)通路和具體分子機(jī)制，為基于circRNA 為干預(yù)靶點(diǎn)的心臟肥大治療研究提供科學(xué)資料。