陳 嬌 ， 張 蕾 ， 鄭 飛 ， 王 露 ， 晏譽(yù)文 ， 郭凌鄖 ，楊建業(yè) ， 沈 俊 ， 王家寧 △

（1湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 十堰 442000；2湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院臨床研究所，湖北 十堰 442000）

腹主動(dòng)脈瘤（abdominal aortic aneurysm，AAA）是指腹主動(dòng)脈的永久性局限性擴(kuò)張，以腎下腹主動(dòng)脈擴(kuò)張為主，其直徑超過(guò)30 mm 或比鄰近血管大50%［1］。且AAA 是導(dǎo)致65歲以上老年男性死亡的一個(gè)主要原因［2］。通常AAA 患者多無(wú)明顯臨床表現(xiàn)。一旦出現(xiàn)破裂則導(dǎo)致65%～85%的病例出現(xiàn)致命性出血和死亡［3］。流行病學(xué)篩查發(fā)現(xiàn)AAA 的主要危險(xiǎn)因素包括：高齡、性別、吸煙、家族史、目前患有心血管疾?。òo(wú)癥狀性心臟病和外周動(dòng)脈疾病），高血壓和血脂異常［4］。

目前認(rèn)為慢性炎癥是AAA 發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，而氧化應(yīng)激可產(chǎn)生過(guò)量活性氧（reactive oxygen species，ROS），ROS 可促進(jìn)炎癥細(xì)胞分泌炎癥因子誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）凋亡，同時(shí)激活基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）促進(jìn)主動(dòng)脈壁內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)降解并激活膠原蛋白酶造成彈力纖維破壞，從而造成血管壁彈性減弱最終發(fā)展成動(dòng)脈瘤。而超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是清除ROS 的主要酶之一。目前在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的SOD 主要有3 種亞型：Cu/Zn-SOD（SOD1）、Mn-SOD（SOD2）和 Fe-SOD（SOD3）。高等動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)主要有SOD1 和SOD2，其中 SOD1 較多。Ishiyama 等［4］采用 TaqMan 法測(cè)定基因型，采用ELISA 法測(cè)定蛋白濃度，結(jié)果證實(shí)SOD2可能通過(guò)氧化應(yīng)激反應(yīng)參與AAA的形成。

目前對(duì)AAA 的治療僅有血管內(nèi)修復(fù)或手術(shù)修復(fù)，而其中僅有10%的適合行血管內(nèi)修復(fù)或手術(shù)修復(fù)，有一部分人雖然不適合手術(shù)修復(fù)但仍有較高AAA 破裂風(fēng)險(xiǎn)?？傊?，目前關(guān)鍵是缺乏有效地手段限制主動(dòng)脈瘤生長(zhǎng)，故迫切需要進(jìn)一步揭示AAA 的分子機(jī)制，為臨床管理和藥物開(kāi)發(fā)提供新的靶點(diǎn)。結(jié)合Strauss等的研究結(jié)果，認(rèn)為SOD2可能通過(guò)氧化反應(yīng)與AAA 的形成有關(guān)［5］。因此，本課題著眼于SOD2 在A(yíng)AA 中的表達(dá)及其對(duì)AAA 發(fā)生發(fā)展的影響，期望通過(guò)闡明SOD2 在CaCl2誘導(dǎo)的小鼠AAA 發(fā)生發(fā)展中的影響及可能機(jī)制，為臨床AAA 的治療提供新的治療方向和治療靶點(diǎn)。

材料和方法

1 主要材料和試劑

活性氧檢測(cè)試劑盒、二氫乙啶（dihydroethidium，DHE；超氧化物陰離子熒光探針）和JC-10 線(xiàn)粒體膜電位熒光探針均購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；小鼠 IL-6、IL-10、MMP-9 和 IL-1β ELISA 試劑盒均購(gòu)自欣博盛生物科技有限公司；總SOD（total SOD，TSOD）和SOD 分型檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒和RIPA 蛋白裂解液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗小鼠骨橋蛋白（osteopontin，OPN）抗體購(gòu)自Immunoway；兔抗小鼠SOD2、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、Bcl-2、MMP2 及MMP9 抗體購(gòu)自Santa Cruz；兔抗小鼠tubulin 抗體購(gòu)自Sigma；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔Ⅱ抗購(gòu)自Antgene。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型構(gòu)建 C57BL/6J 小鼠，SPF 級(jí)，雄性，8～10 周齡，體重 25 g 左右，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；在特定無(wú)病原體條件下喂養(yǎng)于湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證編號(hào)為SCXK（京）2016-0006，常規(guī)飼養(yǎng)。予以0.75 mmol/L氯化鈣外敷腹主動(dòng)脈誘導(dǎo)AAA模型［6］。

2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 原代培養(yǎng)Sprague-Dawley 大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞并鑒定，用含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)，置于5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中。給予不同濃度（0、0.25、0.5、0.75、1 和 1.5 mmol/L）的H2O2處理細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并在處理后不同時(shí)間點(diǎn)鏡下觀(guān)察。后續(xù)收集細(xì)胞行Western blot 檢測(cè)。另取細(xì)胞給予有/無(wú)Ad-SOD2（MOI 100）處理 48 h 誘導(dǎo)SOD2 過(guò)表達(dá)，同時(shí)給予1 mmol/L H2O2處理細(xì)胞2 h，收集細(xì)胞行Western blot檢測(cè)?；虬凑f(shuō)明書(shū)行ROS檢測(cè)、DHE 檢測(cè)、JC-10 檢測(cè)、Annexin-V/PI 試劑盒進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

2.3 動(dòng)物取材和標(biāo)本收集 給予10%水合氯醛（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，剪開(kāi)皮膚，暴露心前區(qū)，抽取心室血約1 mL 入抗凝管中。4 ℃靜置（分層后離心取上清）。依次剪開(kāi)胸部肌肉、胸骨和心包膜，暴露心臟。心尖部穿刺，右心耳處剪開(kāi)，肝素生理鹽水順沿左心室行全身灌注，同時(shí)剪開(kāi)腹部皮膚、肌肉及腹膜，肉眼見(jiàn)肝臟顏色變白后換用預(yù)冷的4%多聚甲醛（或生理鹽水）快速灌注后取主動(dòng)脈組織。標(biāo)本放入冰醋酸固定液（去離子水、甲醇、冰醋酸體積比為6∶3∶1）中，室溫固定7 d，擬用于免疫組化檢測(cè)。而生理鹽水灌注的組織，放入液氮中，組織變脆后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆没蛑苯友心?，組織蛋白的提取和制樣，擬行Western blot 檢測(cè)。

2.4 組織病理檢測(cè) 取石蠟包埋組織塊，厚度約5 μm。切片行HE 染色，烤片、脫蠟、水化、蘇木素染色、分化、伊紅復(fù)染、脫水、透明后封片，顯微鏡下觀(guān)察并拍照，觀(guān)察整個(gè)血管形態(tài)，細(xì)胞核著深藍(lán)色，胞質(zhì)和膠原呈淺紅色。另外切片行彈力纖維染色，先烤片、脫蠟、水化、Verhoeff 染液 A 滴染 20 min、Verhoeff 分化液分化組織、95%乙醇快速分化、VanGieson 染液（9∶1）復(fù)染、脫水、透明后封片，鏡下可見(jiàn)彈力纖維呈黑色，膠原呈灰色。

2.5 Western blot檢測(cè)SOD2及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)每組取0.1 mg 組織加入裂解液，冰上勻漿器破碎組織，低溫離心后取上清。BCA 法測(cè)量蛋白濃度。每孔取10 μg蛋白樣本上樣進(jìn)行SDS-PAGE。電泳結(jié)束后，冰浴中電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)印蛋白至PVDF 膜上，5%BSA封閉液室溫封閉后，根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)，分別加入1∶1 000 比例稀釋的 SOD2、α-SMA、OPN、Bax、Bcl-2、MMP2、MMP9 單克隆抗體，孵育后，棄去 I 抗，TBST洗膜3 次，然后加入HRP 標(biāo)記的II 抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，洗膜后加入ECL試劑進(jìn)行曝光顯影。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 8 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理及作圖。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。如果數(shù)據(jù)為正態(tài)分布且方差齊，則采用Student'st檢驗(yàn)比較兩組間的差異，多組間比較采用單因素方差分析和Tukey 事后分析。對(duì)于未通過(guò)正態(tài)性檢驗(yàn)的數(shù)據(jù)，采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)比較兩組間的差異，多組間采用單因素方差分析和Tukey事后分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CaCl2誘導(dǎo)小鼠AAA模型的鑒定

于CaCl2外敷腹主動(dòng)脈后不同時(shí)間點(diǎn)（1、2、4和6周），取腹主動(dòng)脈組織并行HE 染色，與對(duì)照組相比，AAA 組腹主動(dòng)脈直徑明顯增大。彈力纖維染色提示AAA 組小鼠不僅腹主動(dòng)脈直徑增大，同時(shí)還伴有明顯的彈力纖維斷裂現(xiàn)象，見(jiàn)圖1。

2 SOD2在A(yíng)AA 小鼠中的表達(dá)及其與細(xì)胞表型、炎癥因子等的關(guān)系

Western blot 結(jié)果提示瘤體組織中α-SMA 和SOD2的表達(dá)較對(duì)照組降低，但隨著時(shí)間延長(zhǎng)，在第6周時(shí)有所上升；免疫組化染色中α-SMA及SOD2結(jié)果與Western bot 一致，但OPN 表達(dá)在各組間無(wú)明顯改變，見(jiàn)圖2A、B；同時(shí)由圖1B 可見(jiàn)AAA 組腹主動(dòng)脈術(shù)后炎癥反應(yīng)明顯，局部組織明顯粘連，但檢測(cè)小鼠血清中炎癥因子（IL-6、IL-10 和IL-1β）及MMP9 水平，結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見(jiàn)圖2C。此外，T-SOD 活性和SOD2活性有明顯改變，結(jié)果提示T-SOD在A(yíng)AA成瘤后明顯下降，而SOD2 在外敷CaCl2早期水平較高，隨后下降至正常水平以下。

3 Ad-SOD2對(duì)H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激模型中RASMCs凋亡的影響

為了探討SOD2 是否參與AAA 的發(fā)病過(guò)程，本實(shí)驗(yàn)原代培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞后傳代，給予不同濃度（0、0.25、0.5、0.75、1 和 1.5 mmol/L）的H2O2處理細(xì)胞2 h 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，鏡下觀(guān)察，同時(shí)采用 Western blot 檢測(cè) SOD2、MMP2、MMP9、Bax 和 Bcl-2 的表達(dá)。結(jié)果提示 MMP2、MMP9 和 Bax 的表達(dá)隨著H2O2濃度增加而增加，SOD2 和Bcl-2 的表達(dá)隨著H2O2濃度增加而下降。培養(yǎng)RASMCs 至合適密度，有/無(wú) Ad-SOD2 感染 RASMCs 48 h 誘導(dǎo) SOD2 過(guò)表達(dá)，于感染46 h時(shí)加入1 mmol/L H2O22 h誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，光鏡下可見(jiàn)SOD2 過(guò)表達(dá)明顯延緩細(xì)胞凋亡，采用Annexin-V/PI 試劑盒進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)亦支持這一結(jié)果。見(jiàn)圖3。

Figure 1. CaCl2-induce AAA model and identification. A：schematic diagram of CaCl2 induced AAA model；B：endoscopic images of the abdominal aorta；C：the maximum diameter of abdominal aorta；D：HE staining；E：elastic fiber staining CaCl2 external application of abdominal aorta for 6 weeks in AAA group. Mean±SD. n=5.**P＜0.01 vs control group.圖1 CaCl2誘導(dǎo)的AAA模型及其鑒定

Figure 3. Morphological changes of RASMCs and expression of SOD2 and other proteins in RASMCs treated with H2O2. A：morphological changes of RASMCs after H2O2 treatment；B：Western blot results of Bax，Bcl-2，MMP2，MMP9 and SOD2；C：morphological changes of Ad-null/Ad-SOD2-infected RASMCs treated with H2O2；D：apoptosis of RASMCs was detected by flow cytometry. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；△△P＜0.01 vs Ad-null group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs Ad-null+H2O2 group.圖3 H2O2處理RASMCs后細(xì)胞形態(tài)及SOD2等蛋白表達(dá)的變化

4 Ad-SOD2 對(duì) H2O2 誘導(dǎo) RASMCs 線(xiàn)粒體膜電位的影響

檢測(cè)有/無(wú) Ad-SOD2 感染 RASMCs 時(shí) H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞中ROS水平，結(jié)果顯示SOD2過(guò)表達(dá)可明顯清除ROS，見(jiàn)圖4A。同時(shí)也檢測(cè)有/無(wú)Ad-SOD2 感染RASMCs 并予以H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的超氧化物陰離子水平，結(jié)果證實(shí)SOD2可明顯降低超氧化物陰離子熒光水平，提示SOD2可清除ROS中的超氧化物陰離子，見(jiàn)圖 4B。檢測(cè)有/無(wú) Ad-SOD2 感染 RASMCs 時(shí)H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡后細(xì)胞線(xiàn)粒體的膜電位水平，結(jié)果提示Ad-SOD2 感染可延緩RASMCs 線(xiàn)粒體膜電位下降，見(jiàn)圖4C。

5 Ad-SOD2 基因轉(zhuǎn)移可減輕CaCl2 誘導(dǎo)的小鼠AAA形成

體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)SOD2 可減輕RASMCs 的凋亡，為進(jìn)一步明確SOD2 在CaCl2外敷誘導(dǎo)AAA 中是否起保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)在動(dòng)物建模時(shí)腹腔注射Ad-SOD2（1×109pfu），6 周時(shí)取腹主動(dòng)脈進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Ad-SOD2 組腹主動(dòng)脈炎癥減輕；HE 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SOD2可延緩腹主動(dòng)脈直徑擴(kuò)張。彈力纖維染色提示給予Ad-SOD2 腹腔注射后可抑制腹主動(dòng)脈直徑增大，同時(shí)減少?gòu)椓w維斷裂。見(jiàn)圖5。

6 Ad-SOD2 對(duì)AAA 小鼠細(xì)胞表型和炎癥因子的影響

為進(jìn)一步闡明機(jī)制，我們檢測(cè)了AAA 組腹主動(dòng)脈的SOD2等表達(dá)，結(jié)果提示Ad-SOD2組腹主動(dòng)脈組織中 α-SMA 和 SOD2 的表達(dá)較 AAA 組升高，OPN 無(wú)明顯改變；由大體標(biāo)本可見(jiàn)Ad-SOD2 組腹主動(dòng)脈的炎癥反應(yīng)明顯減輕，主動(dòng)脈直徑相對(duì)減少。檢測(cè)各組小鼠血清中炎癥因子（IL-6、IL-10 和 IL-1β）及MMP9 水平，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；對(duì)照組血清T-SOD的水平較高，AAA 組血清T-SOD 水平明顯下降，Ad-SOD2 組又明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)AAA組較control組血清SOD2活性有所下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而Ad-SOD2 組SOD2 活性明顯升高，與AAA相比有顯著差異。見(jiàn)圖6。

Figure 4. Effect of Ad-SOD2 on mitochondrial membrane potential of H2O2-induced RASMCs. A：ROS levels；B：the level of superoxide anion；C：JC-10 staining. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs Ad-null group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs Ad-null+H2O2 group.圖4 Ad-SOD2對(duì)H2O2誘導(dǎo)的RASMCs線(xiàn)粒體膜電位的影響

討 論

AAA 是一種主動(dòng)脈疾病，患者早期無(wú)典型癥狀，大多數(shù)的AAA 病變?cè)谀I動(dòng)脈水平以下［1］。在發(fā)達(dá)國(guó)家，多數(shù)患者在接受其他檢查時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)或者常規(guī)超聲檢查發(fā)現(xiàn)。流行病學(xué)篩查發(fā)現(xiàn)AAA的主要危險(xiǎn)因素包括：高齡、性別、吸煙、家族史、目前患有心血管疾?。òo(wú)癥狀性心臟病和外周動(dòng)脈疾?。?，高血壓和血脂異常。流行病學(xué)提示女性患AAA的概率低于男性，超過(guò)70 歲曾吸煙的女性AAA 的患病率約1%，AAA的主要并發(fā)癥是瘤體破裂，據(jù)估計(jì)全世界每年有15萬(wàn)到20萬(wàn)人死于主動(dòng)脈瘤破裂。雖然AAA女性患病率較男性低，但因AAA 的形態(tài)學(xué)和血流動(dòng)力學(xué)特征具有非常明顯的性別差異，導(dǎo)致女性AAA 的破裂風(fēng)險(xiǎn)更高。目前主要治療手段為經(jīng)典外科手術(shù)或主動(dòng)脈腔內(nèi)介入治療，尚無(wú)有效的藥物手段證實(shí)可抑制或逆轉(zhuǎn)主動(dòng)脈瘤的進(jìn)展［1］。故迫切需要發(fā)現(xiàn)預(yù)防、抑制甚至逆轉(zhuǎn)主動(dòng)脈瘤進(jìn)展的藥物和方法。

目前常用的AAA 動(dòng)物模型有多種，主要有皮下泵入輸注血管緊張素II、彈力蛋白局部灌注、氯化鈣或磷酸鈣誘導(dǎo)的模型以及異種移植模型等。本研究采用常用的、經(jīng)濟(jì)的、技術(shù)難度中等的CaCl2誘導(dǎo)的小鼠 AAA 模型［1］。CaCl2可以在組織中產(chǎn)生不溶性鹽，引發(fā)慢性炎癥，從而促進(jìn)動(dòng)脈瘤的發(fā)展，最終導(dǎo)致外敷CaCl2的主動(dòng)脈段直徑擴(kuò)大主動(dòng)脈壁變薄。CaCl2外敷的腹主動(dòng)脈在組織病理變化包括外膜炎癥與細(xì)胞浸潤(rùn)，激活炎癥信號(hào)分子如 JNK 和 NF-κB［7］，分泌各種MMPs 并降解彈性纖維等［8］。亦有研究表明磷酸鈣誘導(dǎo)的小鼠腹主動(dòng)脈瘤模型中，主動(dòng)脈組織彈力纖維斷裂明顯，炎癥加重［9］。這和本研究實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒Y(jié)果一致，外敷CaCl2后腹主動(dòng)脈周?chē)装Y明顯增加，彈力纖維破壞明顯。同時(shí)該模型的不足，主要在于一方面它沒(méi)有進(jìn)展到動(dòng)脈瘤的破裂，另一方面在于此模型動(dòng)脈瘤不合并動(dòng)脈粥樣硬化或壁內(nèi)血栓。

Strauss 等［5］采用 TaqMan 法測(cè)定基因型，采用ELISA 法測(cè)定蛋白濃度，結(jié)果證實(shí)SOD2 可能通過(guò)氧化應(yīng)激反應(yīng)參與AAA 的形成。本研究中CaCl2外敷腹主動(dòng)脈后誘導(dǎo)慢性炎癥發(fā)生，而炎癥發(fā)生后ROS增加，是機(jī)體自我保護(hù)引起SOD2應(yīng)激性增加以利于清除ROS所致。為探討SOD2對(duì)小鼠AAA的影響，我們采用致病性低、轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高、無(wú)宿主細(xì)胞基因組整合的腺病毒為載體的Ad-SOD2腹腔注射誘導(dǎo)小鼠SOD2過(guò)表達(dá)。本研究檢測(cè)了CaCl2誘導(dǎo)的AAA 小鼠血清中促炎因子（IL-6 和IL-1β）和抗炎因子（IL-10），結(jié)果均無(wú)顯著差異。支持這一結(jié)果的是，有報(bào)道稱(chēng)CaCl2誘導(dǎo)的AAA 模型中，動(dòng)脈瘤組織局部炎癥因子有明顯變化，但循環(huán)血中炎癥因子差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［8］。我們同時(shí)檢測(cè)了血清T-SOD 和SOD2活性，結(jié)果提示AAA 早期T-SOD 活性明顯升高，隨后呈下降趨勢(shì)，而SOD2 活性在外敷CaCl21 周時(shí)最高，隨后亦逐漸下降。這些結(jié)果提示在A(yíng)AA發(fā)病過(guò)程中SOD活性隨之改變。理論上SOD2可減輕炎癥反應(yīng)，而本研究觀(guān)察到，腹腔注射Ad-SOD2誘導(dǎo)SOD2過(guò)表達(dá)的AAA小鼠的腹主動(dòng)脈炎癥明顯減輕，彈力纖維破壞減少，同時(shí)主動(dòng)脈直徑的進(jìn)展受到抑制，與理論推測(cè)一致。這些結(jié)果提示SOD2可延緩CaCl2誘導(dǎo)的AAA進(jìn)展。

Figure 5. Protective effect of Ad-SOD2 on CaCl2-induced AAA in mice. A：schematic diagram of CaCl2-induced AAA model；B：endoscopic images of the abdominal aorta and the maximum diameter of the abdominal aorta；C：HE staining；D：elastic fiber staining. Mean±SD. n=5.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs AAA group.圖5 Ad-SOD2在CaCl2誘導(dǎo)的小鼠AAA中的保護(hù)作用

ROS 主要來(lái)源于線(xiàn)粒體，能激活細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，增加促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放，從而維持炎癥反應(yīng)。而炎癥反應(yīng)亦可引起氧化應(yīng)激，加重細(xì)胞損傷。ROS 的相對(duì)過(guò)量積累會(huì)破壞細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激和線(xiàn)粒體功能障礙，進(jìn)一步產(chǎn)生ROS。同時(shí)MMP2 和MMP9 被認(rèn)為是細(xì)胞外基質(zhì)降解中最重要的兩種MMPs，也是AAA 形成和發(fā)展的關(guān)鍵因素［10］。早期一項(xiàng)由彈力蛋白酶誘導(dǎo)的小鼠AAA 模型表明，早期病變組織SOD2 升高，同時(shí)MMP2 的活性升高［11］。而本研究細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)伴隨OS 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡越明顯MMP2、MMP9 的表達(dá)亦越高，和這項(xiàng)研究結(jié)果基本一致。本研究采用細(xì)胞流式術(shù)檢測(cè)結(jié)果證實(shí)SOD2 可明顯抑制RASMCs 凋亡。同時(shí)證實(shí)H2O2所致氧化應(yīng)激誘發(fā)細(xì)胞凋亡時(shí)ROS 水平升高、超氧陰離子水平升高同時(shí)細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位明顯下降。而給予Ad-SOD2后ROS及超氧陰離子水平明顯下降，同時(shí)延緩了線(xiàn)粒體膜電位下降，說(shuō)明SOD2 對(duì)線(xiàn)粒體膜電位有一定的保護(hù)作用。

本研究的最大缺陷在于未能排除同齡小鼠腹主動(dòng)脈起始直徑的差異；同時(shí)該模型由給予外敷CaCl2造成急性炎癥所致，而人患AAA多由慢性炎癥所致，這與人類(lèi)的AAA 發(fā)病機(jī)制亦有所不同，故不能完全模擬AAA的發(fā)病機(jī)制；因?yàn)樵撃Ｐ蜑榧毙云鸩。嗖焕陂L(zhǎng)期的臨床藥物研究。但是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示SOD2 可通過(guò)減輕主動(dòng)脈周?chē)装Y、減少主動(dòng)脈壁內(nèi)彈力纖維破壞從而對(duì)AAA起一定的保護(hù)作用。這對(duì)臨床AAA的治療提供新的治療方向和治療靶點(diǎn)。也為進(jìn)一步研究AAA發(fā)病機(jī)制提供了新思路。

Figure 6. Effects of Ad-SOD2 transfer on expression of inflammatory factors in AAA mice. A：Western blot results of α-SMA and SOD2；B：immunohistochemical staining of α-SMA，OPN and SOD2；C：the content of IL-6，IL-10，IL-1β and MMP9，and the activity of SOD2 and total SOD. Mean±SD. n=5.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs AAA group.圖6 Ad-SOD2腹腔注射對(duì)AAA小鼠主動(dòng)脈細(xì)胞表型和炎癥因子的影響