于芯宜，徐家延，陳方圓，李莉，劉玲玲,*，王琛鑫

（1.浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江杭州310023；2.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)后處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310058）

大腸桿菌（Escherichia coli）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是自然界中分布廣泛的微生物，在食品加工過程中最易繁殖。眾多研究表明，植物精油對(duì)E.coli和B.subtilis等細(xì)菌有抑制作用，并且能夠與食品直接接觸。因此，本試驗(yàn)就丁香、薰衣草、桉葉、香茅和肉豆蔻5種精油對(duì)E.coli和B.subtilis的抑制效果進(jìn)行了研究，對(duì)各精油中主要的特征成分進(jìn)行了分析，旨為開發(fā)植物源天然抗菌劑在食品保鮮中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

丁香精油（CLEO）、薰衣草精油（LEO）、肉豆蔻精油（NEO），購(gòu)自廣州晶晶生物科技有限公司；桉葉精油（EEO）、香茅精油（CEO），購(gòu)自深圳市國(guó)鑫香料有限公司，密封4℃下保存待用；胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂、葡萄糖，均為國(guó)產(chǎn)市售；PCA平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基，購(gòu)自杭州百思生物技術(shù)有限公司；正己烷（純度99%，色譜純），購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；無(wú)水乙醇（純度99%，分析純），購(gòu)自上海國(guó)藥控股化學(xué)試劑有限公司。E.coli和B.subtilis為本實(shí)驗(yàn)室篩選。

1.1.2 設(shè)備與儀器

SpectraMax iD3多功能酶標(biāo)儀，美谷分子儀器（上海）有限公司；SW-CJ-2D型凈化工作臺(tái)、LRH-150細(xì)菌培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；LDF-50L-l型立式高壓蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；Agilent 7890-5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，安捷倫科技（中國(guó)）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備

用灼燒冷卻后的接種環(huán)挑取少量保藏的菌種，接種到已經(jīng)滅菌好的Luria-Bertani（LB）液體培養(yǎng)基的試管中，充分混合，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h進(jìn)行活化。對(duì)活化后的菌懸液進(jìn)行10倍系列稀釋，選取調(diào)至濃度為含菌體104～105CFU/mL的菌懸液（測(cè)定菌懸液的OD600值在0.31左右），備用[9]。

1.2.2 精油濃度梯度稀釋和最小抑菌濃度的測(cè)定

采用二倍稀釋法測(cè)定精油的最小抑菌濃度（Minimal inhibit concentration,MIC）。將精油用40%乙醇溶液稀釋至濃度為200 μg/mL，搖勻備用。取300 μL稀釋后的精油于裝有5.70 mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，然后采用二倍稀釋法，依次得到含有濃度分別為10.00、5.00、2.50、1.25、0.63、0.31、0.16、0.08 μg/mL的精油培養(yǎng)基。設(shè)置對(duì)照組A：只含培養(yǎng)基，不含精油（完全生長(zhǎng)）；對(duì)照組B：5.70 mL LB培養(yǎng)基和300 μL 40%乙醇溶液；對(duì)照組C：只有培養(yǎng)基，不接種菌懸液（空白對(duì)照組）。分別將50 μL稀釋好的菌懸液加至上述不同濃度的精油溶液和對(duì)照組中，每個(gè)濃度進(jìn)行2組平行組，于37℃培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)24 h。觀察試管液體培養(yǎng)基中菌體的生長(zhǎng)情況并做好記錄，培養(yǎng)結(jié)束后，若培養(yǎng)基渾濁，則說(shuō)明有菌生長(zhǎng)；對(duì)于臨界的透明試管（培養(yǎng)前后OD600值之差幾乎不變的最低精油濃度），需要進(jìn)行檢驗(yàn)。從臨界透明離心管及與之相鄰的2支試管中取液體培養(yǎng)基100 μL轉(zhuǎn)接平板，37℃培養(yǎng)24 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，確定精油的MIC[10]。

1.2.3 植物精油特征成分分析

稱取精油0.1 g，加入正己烷，溶解定容至10 mL容量瓶中。采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）對(duì)其組成成分進(jìn)行分析。參照張晶琳[11]的方法，稍作修改進(jìn)行測(cè)定。

采用程序升溫法對(duì)植物精油進(jìn)行分析。初始溫度為50℃，保持3 min，然后以5℃/min程序升溫至120℃，保持2 min，再以10℃/min程序升溫至250℃。噴射器和檢測(cè)器溫度為280℃；色譜柱為DB-5（30 m×0.25 mm×0.2 μm）；載氣為高純氦氣（純度＞99.99%）；分流比1∶50。質(zhì)譜條件：電子轟擊電離源（EI），電子能量70 eV，接口溫度280℃，離子源溫度250℃，溶劑延遲5 min[12]。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，再通過GC/MSD化學(xué)工作站軟件分別整理5種精油的成分含量表格，分別根據(jù)其中組分含量分析其與相應(yīng)精油抑菌作用的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種植物精油對(duì)兩種代表菌的抑制效果研究

2.1.1 5 種精油對(duì)E.coli的抑菌作用

由表1可知，5種精油對(duì)E.coli生長(zhǎng)的抑制活性排序?yàn)椋篊LEO＞LEO＝NEO＞EEO＝CEO，CLEO對(duì)E.coli的抑制作用最強(qiáng)，MIC為1.25 μg/mL；LEO、NEO對(duì)E.coli的抑制效果相當(dāng)，MIC為5.00 μg/mL，EEO和CEO對(duì)E.coli影響最弱，MIC均為10.00 μg/mL。由表2可知，5種精油對(duì)B.subtilis生長(zhǎng)的抑制活性排序?yàn)椋篘EO＞CLEO＞LEO＝CEO＞EEO。NEO對(duì)B.subtilis的抑制作用最強(qiáng)，MIC為0.31 μg/mL；CLEO對(duì)B.subtilis的抑制作用較強(qiáng)，MIC為0.63 μg/mL；EEO對(duì)B.subtilis的抑制作用最弱，MIC為2.50 μg/mL。CLEO對(duì)兩種細(xì)菌的抑菌區(qū)間為0.63～1.25 μg/mL，LEO對(duì)兩種細(xì)菌的抑菌區(qū)間為1.25～5.00 μg/mL，CEO對(duì)兩種細(xì)菌的抑菌區(qū)間為1.25～10.00 μg/mL，NEO對(duì)兩種細(xì)菌的抑菌區(qū)間為0.31～5.00 μg/mL，EEO的抑菌效果最差。這一結(jié)論符合前人所總結(jié)的革蘭氏陰性菌對(duì)植物精油的耐受性優(yōu)于革蘭氏陽(yáng)性菌[6]。

表1 不同種類及濃度的精油對(duì)E.coli的抑制作用Table 1 Inhibitory effects of different species and concentrations of EOs on E.coli

表2 不同種類及濃度的精油對(duì)B.subtilis的抑制作用Table 2 Inhibitory effects of different species and concentrations of EOs on B.subtilis

5種植物精油均對(duì)E.coli和B.subtilis有良好的抑制作用。精油會(huì)影響細(xì)胞膜的正常功能，導(dǎo)致其功能損害，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外泄[13]。同時(shí)可以看出，各組精油對(duì)B.subtilis的MIC均低于對(duì)E.coli的MIC，得出同等濃度下精油的殺菌效果對(duì)B.subtilis更顯著。本試驗(yàn)選取的菌種為革蘭氏陽(yáng)性菌（B.subtilis）和革蘭氏陰性（E.coli）的代表菌株，其對(duì)精油的敏感程度不同主要區(qū)別在于細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)不同。相較于革蘭氏陽(yáng)性菌，革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁由肽聚糖、脂蛋白、磷脂層和脂多糖層組成，能在一定程度上阻隔精油，即提高對(duì)精油的耐受性，使得需更高濃度精油才能達(dá)到作用效果[14]。

2.2 5種植物精油的成分分析結(jié)果

2.2.1 精油成分及含量

由表3和圖1可知：CLEO中的化合物較少，主要成分為丁香酚（相對(duì)含量84.90%），與前人研究報(bào)道一致[15]；其次為石竹烯，相對(duì)含量為13.27%；其余的化合物（α-石竹烯和氧化石竹烯）的相對(duì)含量較少。具體含量以及次要組分與已有報(bào)道[16]存在一定差異，主要是因植物品種、產(chǎn)地及氣候等因素造成上述化學(xué)成分的多樣性和含量差異，同時(shí)分析檢測(cè)的儀器、方法和條件等也可能會(huì)引起結(jié)果的不同。丁香酚為CLEO中的主要成分，即可以推測(cè)CLEO的良好抑菌活性主要來(lái)源于丁香酚。相關(guān)研究表明，丁香酚具有良好的抗菌活性，且與其酚羥基結(jié)構(gòu)增大物質(zhì)活性密切相關(guān)[17-19]；疏水性基團(tuán)隔離細(xì)菌細(xì)胞膜脂質(zhì)和線粒體，改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)增加細(xì)胞膜通透性[20-21]；此外，研究表明，丁香酚可以通過改變細(xì)菌胞內(nèi)酶的分子結(jié)構(gòu)及構(gòu)象，從而達(dá)到降低酶活性，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的效果[22-23]。

圖1 丁香精油的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of CLEO

表3 CLEO的特征成分Table 3 Characteristic components of CLEO

由表4和圖2可知：LEO中的化合物較多，以醇類（44.62%）和酯類（37.45%）物質(zhì)為主，還含有少量的萜烯類。其中含量最多的是乙酸芳樟酯，相對(duì)含量為34.05%，該酯又名乙酸沉香酯，多存在于天然薰衣草、香檸檬等植物的精油中，是芳樟醇的主要酯類化合物[24]；其次為芳樟醇，相對(duì)含量為28.40%，芳樟醇屬于鏈狀萜烯醇類物質(zhì)，具有鈴蘭香氣；再者是(R)-2-樟腦（9.11%）和桉樹醇（7.54%），這些都是薰衣草精油的特征香氣成分[25]，且桉樹醇、芳樟醇和乙酸芳樟酯的含量越高，則精油的抗菌作用越好[26]。楊瀅瀅等[27]研究表明，芳樟醇對(duì)果蔬采后致病菌有良好的抑菌活性。通過對(duì)生長(zhǎng)曲線測(cè)定和細(xì)胞形態(tài)觀察，郭俸鈺等[28]發(fā)現(xiàn)，芳樟醇因其疏水作用破壞細(xì)胞的細(xì)胞膜，進(jìn)而破壞其通透性和完整性，影響細(xì)菌細(xì)胞的正常能量代謝，導(dǎo)致菌體死亡，且作用效果隨著芳樟醇濃度的增加而增強(qiáng)。

圖2 薰衣草精油的總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatogram of LEO

由表5和圖3可知：EEO的主要成分為桉樹醇（34.29%）、D-檸檬烯（18.39%）、β-傘花烴（8.79%）、3-蒈烯（6.99%）和α-萜品油烯（6.60%），其中桉樹醇和D-檸檬烯總相對(duì)含量為52.68%。桉樹醇又名桉樹腦，是一種一萜醇，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，具有抗菌、抗氧化、抗炎等廣泛的生物活性。桉樹醇處理真菌可致真菌的結(jié)構(gòu)異常及生理功能紊亂等，從而達(dá)到抑菌效果[29]。檸檬烯是一種天然的功能單萜，具有廣譜抑菌性，其抑菌效果受環(huán)境條件（溫度、濃度、pH條件、易揮發(fā)性等）影響。檸檬烯對(duì)細(xì)菌、真菌的抑制機(jī)理主要為作用于細(xì)菌的蛋白表達(dá)基因，破壞細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)，抑制呼吸復(fù)合物及相應(yīng)的代謝酶活性[30]。EEO成分包含了脂肪烴類化合物、醇類化合物、桉樹醇及萜烯類化合物，不同品種的桉樹葉揮發(fā)性成分不同[23]。祝一鳴[31]研究表明，不同桉樹葉片揮發(fā)油對(duì)桉樹青枯菌均有明顯的抑制作用，植物精油的抗性作用由主要化合物及次要化合物共同作用導(dǎo)致。

表5 EEO的特征成分Table 5 Characteristic components of EEO

由表6和圖4可知：CEO中的主要成分為(R)-香茅醛（16.22%）、檸檬醛（11.72%）、(R)-花側(cè)柏烯（16.04%）、(S)-順式-去氫白菖烯（7.99%）、反式-香葉醇（5.9%）和D-檸檬烯（5.42%）。香茅屬精油的主要成分及組分含量會(huì)因其基因、產(chǎn)地、環(huán)境和采摘時(shí)間等因素影響而具有較大差異，主要成分多為烯萜、酚、醇，含順式-檸檬醛和反式-檸檬醛的比例較高[32]。楊輝祥等[33]對(duì)福建廈門產(chǎn)香茅精油的抑菌性及抗氧化活性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，香茅精油具有廣譜抑菌活性及強(qiáng)抗氧化活性。曾桃花等[34]研究表明，香茅醛對(duì)細(xì)胞群體感應(yīng)具有高效的抑制作用，能調(diào)節(jié)銅綠假單胞菌毒力基因的表達(dá)水平。郭丹[35]研究表明，香茅醛和檸檬醛對(duì)纖維素降解酶、多聚半乳糖醛酸酶、果膠甲基半乳糖醛酸酶、多聚半乳糖醛酸轉(zhuǎn)移消除酶、果膠甲基轉(zhuǎn)移消除酶活性均具有良好的抑制作用，且濃度越高，抑制率越高。吳建挺[36]研究表明，香茅醛具有良好的抑菌效果，能引起細(xì)菌細(xì)胞膜透性和胞內(nèi)酶活性發(fā)生改變。

表6 CEO的特征成分Table 6 Characteristic components of CEO

由表7和圖5可知：NEO成分包括脂肪烴類、醇、酚、萜烯類及酯類化合物，主要成分具體為α-蒎烯（23.96%）、檸檬烯（32.68%）、(S)-α-松油醇（21.44%）、α-松油烯（6.04%）和丁香酚（4.08%）。檸檬烯又稱苧烯，相對(duì)分子質(zhì)量136.24，是多種水果（主要為柑橘類）、蔬菜及香料中存在的天然成分。本研究中NEO的成分以烯類（67.86%）和醇類（24.49%）物質(zhì)為主。相關(guān)研究表明，采用水蒸氣蒸餾法提取肉豆蔻揮發(fā)油，用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析其化學(xué)成分和相對(duì)含量發(fā)現(xiàn)，揮發(fā)油除了主要含有單萜類化合物及其衍生物和倍半萜外，還含有肉豆蔻醚等苯丙素類化合物和欖香素。賴聞玲等[37]也報(bào)道了肉豆蔻揮發(fā)油含有肉豆蔻醚、欖香素和黃樟醚3個(gè)醚類化合物。本研究中未直接發(fā)現(xiàn)肉豆蔻醚和欖香素，主要是由于肉豆蔻原料和儲(chǔ)藏條件的差異性導(dǎo)致化學(xué)成分和含量不同，另外精油的制備和提取方法上的差異也會(huì)造成化學(xué)成分及含量的差異。邱琴等[38]采用超臨界二氧化碳萃取法提取的肉豆蔻精油主要活性物質(zhì)為肉豆蔻酸、肉豆蔻醚、松油烯-4-醇、α-蒎烯、黃樟醚等，大分子量的成分相對(duì)較多。微波輔助-水蒸氣蒸餾法較傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾法在提取所得的揮發(fā)油中具有較高含量的高沸點(diǎn)含氧類化合物。多數(shù)研究表明，含氧類化合物與揮發(fā)油的特殊香氣有著密切關(guān)系，且與揮發(fā)油的品質(zhì)呈正相關(guān)[39]。

表7 NEO的特征成分Table 7 Characteristic components of NEO

圖5 肉豆蔻精油的總離子流色譜圖Fig.5 Total ion chromatogram of NEO

3 結(jié)論與討論

5種植物精油經(jīng)GC-MS分析證實(shí)其成分復(fù)雜，含有多種化學(xué)成分，共有的主要成分為烯類、酚類和醛類物質(zhì)。這些成分與植物精油的抗菌活性密切相關(guān)。這些物質(zhì)能對(duì)細(xì)菌的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、脂肪酸、蛋白質(zhì)、代謝活動(dòng)產(chǎn)生影響，從而使細(xì)菌無(wú)法正常生長(zhǎng)繁殖。本試驗(yàn)中，丁香精油對(duì)革蘭氏陰性代表菌（E.coli）和革蘭氏陽(yáng)性代表菌（B.subtilis）的抑制效果都很明顯，丁香精油所含具有廣譜抑菌性的丁香酚占比達(dá)84.90%，丁香酚在細(xì)菌生長(zhǎng)環(huán)境中穩(wěn)定性較好，并且能夠使細(xì)胞膜滲透性發(fā)生改變，從而造成細(xì)胞快速死亡。肉豆蔻精油對(duì)革蘭氏陽(yáng)性代表菌的抑制效果較明顯，除了醇類和酚類物質(zhì)對(duì)細(xì)菌有抑制作用外，其含有的烯類物質(zhì)在臨床醫(yī)學(xué)上也被廣泛用于抗真菌感染的抗生素中，推測(cè)其對(duì)于細(xì)菌生長(zhǎng)也有一定抑制作用。薰衣草精油對(duì)革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性代表菌的抑菌作用一般，桉葉精油和香茅精油的抑菌作用相對(duì)較弱，這與未檢測(cè)到抑菌活性較高的酚類物質(zhì)有關(guān)。關(guān)于精油的有效成分有待進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，驗(yàn)證其抑菌效果并揭示其抗菌機(jī)理。同時(shí)，通過精油抑菌性能的比較和組分的分析，進(jìn)一步證明植物精油的抑菌廣譜性，這些結(jié)論為更好地開發(fā)和利用綠色、安全、高效的新型抗生素替代品及復(fù)合型的植物源天然抗菌劑，提高生產(chǎn)效率、降低生產(chǎn)成本提供理論依據(jù)。