彭春芳，趙 華，唐昱婷，趙婉馨，賈 剛，劉光芒，田 剛，蔡景義，湯加勇

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，動(dòng)物抗病營(yíng)養(yǎng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物抗病營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物抗病營(yíng)養(yǎng)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611130）

在集約化養(yǎng)殖中，抗生素的使用給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)效益，但長(zhǎng)期濫用抗生素導(dǎo)致藥物殘留和細(xì)菌耐藥性增加，給人類健康和生態(tài)系統(tǒng)帶來(lái)極大危害。2020年7月1日起，我國(guó)實(shí)行全面禁抗，研制高效且安全的抗生素替代物勢(shì)在必行?？咕木哂袕V譜抗菌活性、抗病毒能力強(qiáng)和無(wú)殘留等優(yōu)點(diǎn)，已成為替抗的新型飼料添加劑，具有廣泛應(yīng)用前景。抗菌肽根據(jù)來(lái)源可分為：植物源、動(dòng)物源、微生物源和人工合成等來(lái)源抗菌肽；根據(jù)蛋白質(zhì)次級(jí)結(jié)構(gòu)可分為：α-螺旋型抗菌肽、β-折疊型抗菌肽、環(huán)形抗菌肽和延伸型抗菌肽。不同來(lái)源的抗菌肽，根據(jù)其結(jié)構(gòu)、作用靶點(diǎn)部位以及抗菌方式的不同，其抑菌效果相差很大。

鯰魚(yú)抗菌肽（parasin I，PI）是一種從受傷鯰魚(yú)體表黏液中分離出的廣譜抗菌肽，具有11%的α-螺旋、33%的β-折疊、56%的無(wú)規(guī)則卷曲，對(duì)革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌和真菌均表現(xiàn)出較高的抗菌活力，且無(wú)溶血活性[1-2]。PI抗菌效果是抗菌肽Maganin 2的12～100倍、BuforinⅠ的8倍，具有較高的研究和應(yīng)用價(jià)值[1]。但天然PI直接分離純化較為困難，限制了其在生產(chǎn)中的應(yīng)用。前期我們?cè)诖竽c桿菌系統(tǒng)中成功表達(dá)了重組抗菌肽PI，發(fā)現(xiàn)PI對(duì)金黃色葡萄球菌具抑制作用[3]。在此基礎(chǔ)上我們進(jìn)一步采用合成生物學(xué)技術(shù)，人工設(shè)計(jì)全新的生物蛋白API（Artificial parasinⅠ，含PI功能片段的基因工程蛋白）并實(shí)現(xiàn)了其在畢赤酵母中的高效表達(dá)，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)激活的API對(duì)革蘭氏陰性菌等病原微生物具有抑制作用[4]。張莉在飼糧中添加API能降低肉兔腹瀉率，改善腸道健康[5]。但API是否可提高家禽生長(zhǎng)性能和改善其腸道健康還有待進(jìn)一步研究。因此，本研究將API添加到肉雞飼糧，旨在探究其對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能和腸道健康的影響，進(jìn)而為其在畜禽生產(chǎn)應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

生物蛋白API（含PI功能片段）為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、表達(dá)后的發(fā)酵液用吸附劑吸附干燥后的產(chǎn)物，API蛋白含量約8.5 g/kg；愛(ài)拔益加（AA）肉雞購(gòu)自正大食品遂寧有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將450羽1日齡AA肉公雞隨機(jī)分為5組，對(duì)照組（飼喂基礎(chǔ)飼糧）和4個(gè)水平API添加組（在基礎(chǔ)飼糧中分別添加API 250、500、750、1 000 mg/kg），每組10個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)9只雞。試驗(yàn)期為42 d，分1～21 d和22～42 d兩階段飼養(yǎng)。基礎(chǔ)飼糧參照中國(guó)肉仔雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T 33—2004）營(yíng)養(yǎng)需要量并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際分兩階段配制，飼糧配方見(jiàn)表1。飼料形態(tài)為粉料。

表1 飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）Table 1 Ingredient and chemical composition of diets(air-dried basis) %

1.3 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)試驗(yàn)在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所教學(xué)科研基地進(jìn)行。采用網(wǎng)上籠養(yǎng)，自由采食和飲水。前1～7 d溫度保持32～34℃，7 d后每周溫度降低2～3℃，直至保持在20～22℃；相對(duì)濕度保持在50%～65%，連續(xù)光照。免疫程序按常規(guī)進(jìn)行，每日觀察并記錄雞只健康狀況。

1.4 樣品采集及指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 生長(zhǎng)性能

以重復(fù)為單位，于試驗(yàn)第1、21和42天早上對(duì)雞只進(jìn)行空腹稱重，每周記錄每個(gè)重復(fù)的給料量、余料量及料損。計(jì)算階段平均日增重（ADG），平均日采食量（ADFI）和料肉比（F/G）。

1.4.2 樣品采集

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，按平均體重每個(gè)重復(fù)選1只健康肉雞進(jìn)行屠宰；取十二指腸、空腸和回腸中段各2～3 cm經(jīng)生理鹽水沖洗后立刻放入4%多聚甲醛溶液中固定、保存?zhèn)溆茫蝗∈改c、空腸和回腸黏膜樣和盲腸內(nèi)容物于凍存管中，于液氮中速凍后置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 腸道組織形態(tài)指標(biāo)測(cè)定

將保存于4%多聚甲醛溶液中的腸段每個(gè)處理組隨機(jī)取3個(gè)樣進(jìn)行石蠟切片制作，觀察并測(cè)定絨毛高度（villus height,VH）和隱窩深度（cypt depth,CD）。每個(gè)樣品至少制作3張切片，每張切片選擇10個(gè)完好無(wú)損的視野測(cè)量VH和CD并計(jì)算絨隱比（villus height/cypt depth,V/C）。

1.4.4 空腸消化酶活測(cè)定

空腸黏膜中淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶和脂肪酶活性測(cè)定均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測(cè)定（No.C016-1-1、No.A080-2-2、No.A080-3-1、No.A054-1-1），具體操作步驟按說(shuō)明書嚴(yán)格進(jìn)行。

1.4.5 腸道相關(guān)基因表達(dá)測(cè)定

用RNAiso Plus（No.9109,Takara）提取腸黏膜總RNA；用 PrimeScriptTMRT reagent Kit（No.RR047A,Takara）將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；再用SYBR Green?Primix Ex TaqTMⅡ Kit（No.RR820A,Takara）對(duì)黏膜中緊密連接蛋白相關(guān)基因（ZO-1、ZO-2、CLDN-1、CLDN-2、OCLN、MUC2）和免疫相關(guān)基因（IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。定量引物用Primer Express 3.0（Applied Biosystems）軟件設(shè)計(jì)，送上海生工生物公司合成。

1.4.6 盲腸微生物菌群測(cè)定

盲腸食糜總DNA用糞樣DNA提取試劑盒（No.D4015-01,Omega）提取，總菌數(shù)量用SYBR?Green染色法（No.Q711-02/03,Vazyme）檢測(cè)；大腸桿菌和乳酸桿菌數(shù)量用TaqMan探針?lè)ǎ∟o.Q513-02/03,Vazyme）檢測(cè)。具體引物和探針序列見(jiàn)參考文獻(xiàn)[5]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2019進(jìn)行初步整理后，用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件中One-way ANOVA程序?qū)?個(gè)處理組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，差異顯著運(yùn)用圖基（Tukey）法進(jìn)行多重比較，用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件中的回歸-曲線估算對(duì)每個(gè)處理組數(shù)據(jù)進(jìn)行線性及二次回歸分析。以P＜0.05為差異顯著，以P＜0.01為差異極顯著，以0.05≤P＜0.10為有趨勢(shì)水平；試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 API對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知，API添加對(duì)肉雞0～21、21～42和0～42 d的BW、ADG和ADFI無(wú)顯著影響（P＞0.05），但500 mg/kg的API添加組雞只末重較對(duì)照組提高了79.62 g/只；當(dāng)API添加為500 mg/kg時(shí)，雞只在后期及全期的F/G較對(duì)照組均有所下降，但未達(dá)顯著水平（P＞0.05）。

表2 API對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響Table 2 Effects of API supplementation on growth performance of broilers

2.2 API對(duì)肉雞腸道形態(tài)的影響

由表3可知，與對(duì)照組相比，API添加顯著降低了肉雞空腸的CD（P＜0.05）、顯著增加了空腸V/C（P＜0.05）；API添加具有降低回腸CD的趨勢(shì)（P=0.098），其中500和750 mg/kg API添加較對(duì)照組回腸CD分別降低了27.38%和13.45%；空腸CD和V/C與API添加水平呈二次線性變化（P=0.008）。

表3 API對(duì)肉雞腸道形態(tài)的影響Table 3 The effect of API supplementation on the intestinal morphology of broilers

2.3 API對(duì)肉雞空腸消化酶活的影響

由表4可知，與對(duì)照組相比，API添加有提高空腸黏膜中α-淀粉酶活性的趨勢(shì)（P=0.09），且500 mg/kg API組α-淀粉酶活性最高并呈現(xiàn)二次線性變化（P=0.033）；500 mg/kg API組較對(duì)照組脂肪酶和胰蛋白酶活性分別提高了9.08%和9.06%。

表4 API對(duì)肉雞空腸消化酶活的影響Table 4 Effects of API supplementation on jejunal digestive enzyme activity of broilers

2.3 API對(duì)肉雞盲腸微生物數(shù)量的影響

由表5可知，與對(duì)照組相比，API添加顯著增加了肉雞盲腸中的總菌數(shù)量（P＜0.01），在降低了大腸桿菌數(shù)量的同時(shí)增加了乳酸桿菌數(shù)量（P＞0.05）；其中750 mg/kg API組顯著降低了大腸桿菌數(shù)量（P＜0.05）、顯著增加了乳酸桿菌數(shù)量（P＜0.01）；盲腸中總菌、乳酸桿菌和大腸桿菌數(shù)量與API添加水平呈二次線性相關(guān)（P＜0.01）。

表5 API對(duì)肉雞盲腸微生物數(shù)量的影響Table 5 The effect of API supplementation on the number of microorganisms in the cecum of broilers

2.4 API對(duì)肉雞腸道緊密連接蛋白基因表達(dá)量的影響

API對(duì)肉雞腸道緊密連接蛋白相關(guān)基因表達(dá)量的影響如圖1所示。從圖中可知，與對(duì)照組相比，250 mg/kg API添加一定程度上調(diào)了十二指腸MUC2的表達(dá)（P＞0.05），1 000 mg/kg API添加顯著上調(diào)了空腸黏膜中OCLN的表達(dá)（P＜0.05）；API添加對(duì)肉雞十二指腸和回腸的緊密鏈接蛋白相關(guān)基因表達(dá)量無(wú)顯著影響（P＞0.05）。

圖1 API對(duì)肉雞腸道緊密連接蛋白基因表達(dá)的影響Figure 1 The effect of API supplementation on the expression of tight junction protein genes in the gut of broilers

2.5 API對(duì)肉雞腸道免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

API對(duì)肉雞腸道免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響見(jiàn)圖2。與對(duì)照組相比，500和750 mg/kg API組顯著下調(diào)了十二指腸中TNF-α的表達(dá)（P＜0.05）（圖2A）；API添加顯著下調(diào)了空腸中TNF-α和IFN-γmRNA的表達(dá)（P＜0.05），同時(shí)750 mg/kg API添加顯著上調(diào)了空腸IL-10的表達(dá)（P＜0.05）（圖2B）；但API添加對(duì)回腸免疫相關(guān)基因無(wú)顯著影響（P＞0.05）（圖2C）。

圖2 API對(duì)腸道免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響Figure 2 The effect of API supplementation on the expression of intestinal immunity-related genes

3 討論

抗菌肽廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)中，其在預(yù)防和治療動(dòng)物疾病方面具有良好效果，且可通過(guò)抑制并殺死病原菌、維護(hù)腸道平衡和增強(qiáng)機(jī)體免疫等方式提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能。研究發(fā)現(xiàn)，肉雞飼糧添加抗菌肽AMP-P3和Plectasin可顯著增加其日增重并降低料重比，改善其生長(zhǎng)性能[6-7]。在山羊飼糧中添加抗菌肽PBD-ml和LUC-n，可改善瘤胃微生物群結(jié)構(gòu)、提高飼料轉(zhuǎn)化率和生長(zhǎng)性能[8]?？咕腁D對(duì)正常生理狀態(tài)下仔豬的生長(zhǎng)性能無(wú)顯著影響，但可顯著提高大腸桿菌攻毒狀態(tài)下仔豬生長(zhǎng)性能[9]。本研究中，飼糧添加API對(duì)雞只的生產(chǎn)性能改善雖未達(dá)到顯著水平，但在一定程度上可提高雞只末重，特別是500 mg/kg API組雞只末重較對(duì)照組提高了79.62 g/只。表明API對(duì)家禽動(dòng)物的生產(chǎn)性能具有一定的改善功能。

腸道是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要部位，腸道形態(tài)的完整性與腸道健康密切相關(guān)，絨毛高度、隱窩深度和絨隱比是評(píng)估腸黏膜損傷程度和小腸吸收能力的主要指標(biāo)[10]。抗菌肽進(jìn)入動(dòng)物腸道后可通過(guò)刺激腸上皮細(xì)胞的增殖促進(jìn)絨毛生長(zhǎng)進(jìn)而改善腸道形態(tài)[7]，如肉雞飼糧添加豬抗菌肽（SGAMP）可有效緩解慢性熱應(yīng)激對(duì)肉雞腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，增加腸道絨毛高度和腸黏膜厚度[11]；添加抗菌肽MccJ25可顯著提高在大腸桿菌和沙門氏菌攻毒情況下肉雞十二指腸、空腸和回腸的絨毛高度、隱窩深度和絨隱比[12]。本研究中，API添加顯著降低了空腸隱窩深度并顯著增加了空腸絨隱比，但對(duì)十二指腸和回腸形態(tài)無(wú)顯著影響，與Peng Z.X.等[13]研究結(jié)相似。SGAMP[11]、MccJ25[12]可緩解應(yīng)激對(duì)肉雞腸道形態(tài)的損傷，本試驗(yàn)條件下雞只處于正常飼養(yǎng)條件，但API添加依然改善了空腸的形態(tài)結(jié)構(gòu)。腸道中消化酶主要由小腸黏膜上皮細(xì)胞和胰腺分泌，消化酶分泌不足會(huì)影響腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收[14]。肉雞飼糧中添加抗菌肽可顯著增加十二指腸胰蛋白酶和脂肪酶的活性[15]，添加抗菌肽Gal-13可顯著增加空腸淀粉酶活性，但對(duì)蛋白酶活性無(wú)顯著影響[16]。添加抗菌肽Plectasin提高了肉雞十二指腸胰蛋白酶和脂肪酶活性[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，API添加具有提高空腸黏膜中α-淀粉酶活性的趨勢(shì)，一定程度提高了空腸中各消化酶活性，這與抗菌肽Gal-13[16]、Plectasin[7]在肉雞中對(duì)腸道消化酶活的作用效果相類似。以上結(jié)果表明，API可能通過(guò)維護(hù)腸道形態(tài)的完整性，提高腸道中消化酶活性，從而提高對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力，進(jìn)而改善腸道健康。

腸道微生物菌群的穩(wěn)定可反映腸道健康狀況，菌群的改變可影響腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收[17]?？咕目梢种颇c道內(nèi)有害菌群的數(shù)量和促進(jìn)有益菌的定植，從而改善腸道健康[6]。飼糧添加抗菌肽MccJ25可降低豬糞便中大腸桿菌數(shù)量、增加雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量，可有效改善糞便微生物群組成[18]。斷奶仔豬飼糧中添加復(fù)合抗菌肽可顯著增加腸道乳酸桿菌數(shù)量并顯著降低大腸桿菌數(shù)量[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，API添加降低了肉雞盲腸中大腸桿菌數(shù)量、增加了總菌數(shù)和乳酸桿菌數(shù)量，與抗菌肽MccJ25[18]和復(fù)合抗菌肽[19]在仔豬中、cLF36在禽中[20]可顯著降低腸道中大腸桿菌數(shù)量的結(jié)果相似，表明API可通過(guò)改善肉雞盲腸中的微生物群結(jié)構(gòu)進(jìn)而促進(jìn)腸道健康。

腸道屏障包括物理屏障、化學(xué)屏障、免疫屏障和微生物屏障，它們共同抵抗外部環(huán)境給腸道帶來(lái)的刺激，有效防止病原微生物的入侵[21]。腸道是腸腔與內(nèi)環(huán)境之間的第一道防線，緊密連接蛋白是其重要組成結(jié)構(gòu)，主要有Occludin、Claudins和ZOs等[22]，它們調(diào)控著腸道上皮通透性并反映腸道屏障功能缺陷情況。黏蛋白2（MUC2）是腸道黏液層的主要成分，反映腸道化學(xué)屏障功能狀況，可促進(jìn)有益菌的定植并阻止病原菌的黏附[23]。肉雞飼糧中添加抗菌肽Plectasin可提高回腸中ZO-1和CLDN-3的表達(dá)[24]；通過(guò)腹腔注射抗菌肽C-BF可顯著提高斷奶仔豬空腸和結(jié)腸中ZO-1、OCLN和CLDN-1的表達(dá)，維持腸道上皮細(xì)胞屏障的完整性[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，API添加可上調(diào)空腸OCLN和十二指腸MUC2的表達(dá)。表明API可上調(diào)緊密連接蛋白基因和黏蛋白基因的表達(dá)，一定程度抑制病原菌對(duì)腸道的黏附，減少由于腸道屏障功能缺陷而導(dǎo)致的腸道健康問(wèn)題。

腸道是機(jī)體最大的免疫器官，腸道免疫屏障中相關(guān)淋巴樣組織可分泌多種細(xì)胞因子，它們能夠抑制并殺死病原體進(jìn)而調(diào)節(jié)腸道黏膜的免疫功能[26]。斷奶仔豬腹腔注射抗菌肽C-BF可顯著降低空腸和回腸中IL-6、IL-8、IL-22和IL-10的表達(dá)[25]。海蘭褐蛋用仔公雞飼糧中添加天蠶素抗菌肽可顯著降低空腸中IL-6、IFN-γ和TNF-α的表達(dá)，有效減輕了腸道炎癥的發(fā)生[27]。本研究中API添加上調(diào)了空腸中IL-10的表達(dá)，下調(diào)了十二指腸和空腸TNF-α和IFN-γ的表達(dá)，表明API可通過(guò)調(diào)節(jié)腸道免疫細(xì)胞因子的表達(dá)增強(qiáng)腸道免疫屏障功能，改善腸道健康。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)條件下，API添加在一定程度上提高了雞只的末重，同時(shí)提高了空腸消化酶活性，降低了盲腸中大腸桿菌數(shù)量并提高了有益菌數(shù)量，上調(diào)了腸道緊密連接蛋白基因表達(dá)并調(diào)節(jié)腸道免疫相關(guān)基因的表達(dá)。本試驗(yàn)條件下，根據(jù)腸道微生物指標(biāo)，API添加以750 mg/kg對(duì)改善肉雞腸道健康效果較好。