田云芳盧 超徐艷花劉宇邈陳景鮮張耀廣鄭鈞屏楊玉珍

(1.鄭州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,鄭州 450044;2.鄭州市觀賞藥用特色資源植物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,鄭州 450044)

典型被子植物的花由不同的組織(萼片、花瓣、雄蕊和心皮)徑向?qū)ΨQ的同心輪組成。參照ABCDE花發(fā)育模型(圖1),B 類擬南芥(Arabidopsis thaliana)MADS-box 基因APETALA3(AP3)、PI決定和控制花瓣和雄蕊的生長(zhǎng)發(fā)育[1-2]。B功能基因突變致花瓣向萼片轉(zhuǎn)變、雄蕊向心皮轉(zhuǎn)變。目前,B 類花發(fā)育基因PI/GLO已從多種植物中克隆,如擬南芥[3-4]、葡萄[5]、萬(wàn)壽菊[6]、煙草[7]、向日葵[8]、紅花玉蘭[9-10]等。國(guó)蘭花器官尤其花瓣是重要的觀賞部位,但其B 類花發(fā)育基因研究相對(duì)較少。

圖1 擬南芥ABCDE花發(fā)育模型[20]Fig.1 ABCDE flower development model of Arabidopsis thaliana[20]

傳統(tǒng)意義上,B 類基因AP3和PI在擬南芥花器官第二、三輪發(fā)育中表達(dá),在非花組織中不表達(dá)[11]。然而,擬南芥中B類功能基因表達(dá)界限不夠明晰,PI不完全限于花的第二、三輪中表達(dá),PI也表達(dá)于第四輪早期[4]。葡萄PI基因表達(dá)豐度較高的部位是花序,葉、根較低,雄蕊、花瓣中也有特異表達(dá)[5]。Dezar等[8]采用Northern 和原位雜交獲得向日葵不育花中Ha PI優(yōu)先表達(dá),而花瓣和可育花雄蕊中弱微表達(dá)。Yao等[12]將轉(zhuǎn)座子插入蘋(píng)果Md PI基因的突變體Rae Ime中,花瓣替換為萼片,雄蕊替換為心皮,最終單性結(jié)實(shí)。Sreekantan等[13]將葡萄Vv PI基因轉(zhuǎn)化擬南芥致花瓣重瓣、雄蕊缺失。萬(wàn)壽菊PI主要于花瓣、雄蕊中表達(dá),萼片中低表達(dá),轉(zhuǎn)基因植株花瓣、雄蕊和雌蕊明顯變短,TePI過(guò)表達(dá)影響花器官發(fā)育[6]。劉彩霞等[14]將擬南芥At PI轉(zhuǎn)化煙草,雄蕊變短,果實(shí)畸形,花冠變小,子房基部變長(zhǎng),At-PI基因調(diào)控雄蕊和花瓣的發(fā)育。Singh等[15]發(fā)現(xiàn)罌粟突變體Paps PI-1 進(jìn)行煙草異位表達(dá),花瓣萼片狀。異位表達(dá)Md PI的轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果果實(shí)變得扁平[16]。因此,不同物種PI基因的作用有所區(qū)別。

PI還可抑制AP1轉(zhuǎn)錄而調(diào)控花發(fā)育。Sundstr?m 等[17]通過(guò)染色質(zhì)免疫沉淀,發(fā)現(xiàn)PI蛋白可以直接與AP1基因的啟動(dòng)子相結(jié)合。AG基因的激活也需AP3和PI的調(diào)控。Wuest等[18]發(fā)現(xiàn)在擬南芥雄蕊中,AP3表達(dá)水平的維持除需要PI蛋白外,還需要AG轉(zhuǎn)錄表達(dá)。AP3和PI的起始轉(zhuǎn)錄是由AP1、LFY、UNUSUALFLORAL ORGANS(UFO)等花分生組織基因誘導(dǎo)的[19]。

本研究以兩種國(guó)蘭(蕙蘭和墨蘭)為試驗(yàn)材料,對(duì)PI/GLO基因的同源克隆與分析鑒定,利用實(shí)時(shí)熒光定量對(duì)不同時(shí)期的組織器官該基因的相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行分析,揭示兩種國(guó)蘭PI基因在花發(fā)育的保守性和差異性,為國(guó)蘭的分子育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

材料為兩種3 a及以上地生蘭:蕙蘭(Cymbidium faberi)、墨蘭(Cymbidium sinense),采自鄭州師范學(xué)院蘭花工程中心智能溫室,分別選取:成苗期(沒(méi)有花葶抽出)的根和葉;花蕾期(花葶抽出,有花蕾,無(wú)開(kāi)花)的根、葉、花葶和花蕾;盛花期(花葶上大部分花蕾展開(kāi))的根、葉、花(將花剝離為萼片、花瓣、唇瓣、合蕊柱、子房)和花葶。每份材料至少3個(gè)重復(fù)。所有材料用鋒利刀片切取后迅速用液氮速凍,并置于-80℃冰箱,備用。

1.2 試劑和儀器

主要試劑:RNAprep pure植物總RNA 提取試劑盒、SYBR Premix Ex Taq TM II、M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司;主要儀器:瓊脂糖凝膠電泳儀(P25T,德國(guó)Biometra),微量紫外分光光度計(jì)(Q5000,美國(guó)Quawell),實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(realplex2,德國(guó)Eppendorf)。

1.3 總RNA 的提取及cDNA 第一鏈的合成

按照RNAprep pure試劑盒的方法提取兩種國(guó)蘭器官和組織的總RNA,分別吸取不同材料的RNA 1.0μL,于1.0%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)其完整性,利用Quawell Q5000 微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 濃度、質(zhì)量,以蕙蘭和墨蘭的花蕾總RNA 為模板,用M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶完成RNA 的反轉(zhuǎn)錄。

1.4 PI 基因克隆及生物信息學(xué)分析

根據(jù)GenBank 建蘭(JQ326259.1)、春蘭(HM106984.1)、石斛(DQ017701.1)、文心蘭(HM140842.1)等的PI基因序列,選擇比較保守的區(qū)段,根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)1 對(duì)引物PI-F,PI-R(表1)用于蕙蘭和墨蘭PI基因的克隆。以蕙蘭和墨蘭花蕾總RNA 反轉(zhuǎn)錄后的cDNA 為模板進(jìn)行RT-PCR,Tm 為51.9 ℃,預(yù)期目的條帶獲得后切膠回收,再進(jìn)行TA 克隆,測(cè)序分析。將正確的PI基因序列在NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)上通過(guò)blastn檢索,并與其他物種PI核苷酸序列比對(duì);通過(guò)blastp比對(duì)所編碼蛋白獲得其保守結(jié)構(gòu)域及功能域。

1.5 PI 基因時(shí)空表達(dá)分析

依據(jù)得到的PI核苷酸序列設(shè)計(jì)特異熒光定量引物進(jìn)行RT-qPCR 試驗(yàn)。參照SYBR Premix ExTaqTMII使用說(shuō)明,用RT-qPCR 的方法檢測(cè)PI基因在蕙蘭和墨蘭不同發(fā)育階段不同部位的相對(duì)表達(dá)豐度,蕙蘭PI基因的表達(dá)檢測(cè)的內(nèi)參基因?yàn)锳CT、UBQ3,EF1α、ACT為墨蘭的內(nèi)參基因。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù),Tm 為58 ℃,利用蒸餾水為陰性對(duì)照,反應(yīng)體系20μL,程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃變性15 s,58 ℃退火15 s,72 ℃延伸30 s,變性、退火、延伸為一個(gè)循環(huán)單位,共40個(gè)循環(huán)。表達(dá)相對(duì)豐度計(jì)算方法為:Rel.Exp=2-ΔΔCt。RT-qPCR 反應(yīng)中使用引物及參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 擴(kuò)增PI/GLO 基因cDNA序列所用的引物及引物之間在各擴(kuò)增反應(yīng)中的組合Table 1 PCR primers for amplification of cDNA sequence of PI/GLO gene and combination of primers

2 結(jié)果與分析

2.1 PI 基因cDNA 序列克隆

分別以蕙蘭、墨蘭的花蕾cDNA 為模板,結(jié)合PI-F、PI-R 簡(jiǎn)并引物(表1)擴(kuò)增PI/GLO保守序列,得到兩條長(zhǎng)度約為400 bp的目的條帶(圖2),與預(yù)期結(jié)果一致,測(cè)序后長(zhǎng)度均為398 bp。將其核苷酸序列在NCBI上Blast分析,發(fā)現(xiàn)蕙蘭CfPI1和墨蘭CsPI1均與建蘭(JQ326259.1)PI基因有99% 的一致性;CfPI1基因與石斛蘭(EU444028.1)、球花石斛(DQ017701.1)、細(xì)莖石斛(EU056326.2)、萼脊蘭(KM975642.1)的同源性為95%、94%、94%、93%;CsPI1基因與上述基因序列的同源性分別為95%、95%、94%、93%。提交GenBank,登錄號(hào)為 MW654194,MW654193。

圖2 兩種國(guó)蘭PI 基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 PCR amplification products of two Chinese orchids PI genes

2.2 PI 基因編碼的蛋白序列分析

通過(guò)NCBI網(wǎng)站比對(duì),兩個(gè)PI/GLO均為MIKC 型MADS-box 基因,均有保守的MADS區(qū)和相對(duì)保守的K 區(qū)(圖3 和圖4),且與春蘭(AD158461.1)同源性較高,分別為98%、99%。CfPI1和CsPI1與細(xì)莖石斛(XP_020679601.1)同源性為95%、97%,文心蘭(ACD85113.1)95%、96%,球花石斛(AAY86363.1)95%、96%,萼脊蘭(AJG41730.1)93%、95%,蝴蝶蘭(AAV28490.1)92%、93%。

圖3 CfPI1 基因核苷酸序列和推測(cè)的氨基酸序列及蛋白保守域Fig.3 Nucleotide acid sequence and deduced amino sequence of CfPI1 gene and conservative protein domain structure

圖4 CsPI1 基因核苷酸序列和推測(cè)的氨基酸序列及蛋白保守域Fig.4 Nucleotide acid sequence and deduced amino sequence of CsPI1 gene and conservative protein domain structure

2.3 CfPI1 在蕙蘭各組織器官中的表達(dá)

CfPI1在蕙蘭各組織器官中的相對(duì)表達(dá)豐度順次為花萼＞花瓣＞唇瓣＞花蕾＞子房＞盛花期花葶＞合蕊柱(圖5),除了盛花期花葶外在生殖器官中均表達(dá),而在苗期的根和葉、花蕾期的根、葉和花葶、盛花期葉中幾乎未檢測(cè)到,即除盛花期花葶外CfPI1在蕙蘭營(yíng)養(yǎng)器官中不表達(dá)。就蕙蘭的3個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期來(lái)說(shuō),表達(dá)豐度順次為營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期＜花蕾期＜盛花期。對(duì)于蕙蘭花器官來(lái)說(shuō),CfPI1在花器官組織中自外而內(nèi)表達(dá)水平逐漸降低。

圖5 CfPI1 在蕙蘭各組織器官中的表達(dá)Fig.5 Expression of CfPI1 in tissues of Cymbidium faberi

2.4 CsPI1 在墨蘭各組織器官中的表達(dá)

CsPI1在墨蘭各組織器官中的相對(duì)表達(dá)豐度順次為花瓣＞唇瓣＞花蕾＞花萼＞合蕊柱＞子房(圖6),在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期、花蕾期、盛花期的根、葉、花葶中幾乎未檢測(cè)到熒光信號(hào)。CsPI1只在墨蘭生殖器官中表達(dá),而在營(yíng)養(yǎng)器官中均不表達(dá)。對(duì)于3個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期,CsPI1在墨蘭器官組織中的表達(dá)量逐漸升高,說(shuō)明CsPI1主要調(diào)控生殖器官的生長(zhǎng)發(fā)育。

圖6 CsPI1 在墨蘭各組織器官中的表達(dá)Fig.6 Expression of CsPI1 in tissues of Cymbidium sinense

3 討論

所克隆的兩條PI/GLO序列均為MIKC 型MADS-box基因。均有M、I和K 結(jié)構(gòu)域。兩基因與春蘭(AD158461.1)、細(xì)莖石斛(XP_020679601.1)、文心蘭(ACD85113.1)、球花石斛(AAY86363.1)、萼脊蘭(AJG41730.1)、蝴蝶蘭(AAV28490.1)的同源性均在92%以上,推測(cè)CfPI1和CsPI1基因功能與以上蘭科植物PI/GLO基因相似。

通過(guò)RT-qPCR 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)基因在不同的組織和器官中均差異表達(dá),CfPI1和CsPI1均主要表達(dá)于花器官中,這與蝴蝶蘭GLO/PI基因Pe MADS6的表達(dá)特性一致[21]。兩個(gè)基因表達(dá)相似之處在于二者均在花萼、花瓣、唇瓣和花蕾中突出表達(dá),表明這兩個(gè)基因主要參與花被片的發(fā)育,而且二者在子房中也有表達(dá)。不同之處在于,蕙蘭表達(dá)最突出部位是花萼,墨蘭是花瓣;而且蕙蘭盛花期花葶中也有表達(dá),墨蘭在合蕊柱中表達(dá)也相對(duì)突出。二者均是主要調(diào)控花器官的發(fā)育。CfPI1在花器官中自外而內(nèi)表達(dá)水平逐漸下調(diào),CsPI1在花器官花瓣中的表達(dá)高于花萼,這與紅花玉蘭Mawu PI[9-10]的表達(dá)相似。這表明不同植物中PI功能并不完全保守,而是存在一定差異。前人研究中,Tunen等[22]首次指出花瓣類似的萼片的形成是B 類基因的表達(dá)區(qū)域向外擴(kuò)展導(dǎo)致的結(jié)果,致本來(lái)花器官第一輪僅A 類基因控制變?yōu)锳+B同時(shí)控制。

擬南芥PI蛋白直接結(jié)合AP1啟動(dòng)子中的序列以調(diào)控AP1基因的表達(dá),從而參與花的發(fā)育[17]。白樺Bp PI過(guò)表達(dá)可能通過(guò)限制開(kāi)花激活因子來(lái)延遲開(kāi)花,其中Bp AP1顯著下調(diào),而且Bp PI可以直接與Bp AP1的啟動(dòng)子結(jié)合,限制Bp AP1的表達(dá)[23]。蕙蘭的AP1/FUL亞家族同源基因CfAP11[24]、CfMADS1[25]主要在營(yíng)養(yǎng)期葉、花蕾期葉、花蕾、花葶、盛花期葉和子房中表達(dá),與蕙蘭的成花誘導(dǎo)和子房發(fā)育有關(guān)。而Cf-PI1在花蕾和盛花期花器官突出表達(dá)。由此推斷蕙蘭CfPI1的表達(dá)限制了開(kāi)花時(shí)間基因CfAP11和CfMADS1的表達(dá),CfPI1基因可能通過(guò)調(diào)控Cf AP11和Cf MADS1的表達(dá)來(lái)調(diào)控花器官的發(fā)育。這還需要通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀方法進(jìn)一步分析驗(yàn)證。