劉 澤，尤 達(dá)，李 勇，何詠梅，李阿芳，李 潘，李春艷

湘南學(xué)院1護(hù)理學(xué)院，2臨床學(xué)院，湖南 郴州 423000；3湖南中醫(yī)藥大學(xué)護(hù)理學(xué)院，湖南 長沙410000

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是一種高度保守的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷酸肌醇3-激酶相關(guān)激酶家族［1-3］。mTOR在細(xì)胞內(nèi)與其他蛋白相互作用形成兩種結(jié)構(gòu)和功能不同的復(fù)合物：mTOR復(fù)合物1（mTORC1）和mTOR復(fù)合物2［4-6］。mTORC1通過整合營養(yǎng)因素、生長因子等信號(hào)，直接磷酸化其下游關(guān)鍵效應(yīng)因子蛋白核糖體S6激酶1（S6K1）和4E結(jié)合蛋白1（4EBP1）促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞生長和增殖［7,8］。在正常腎臟中，mTORC1在近端腎小管上皮細(xì)胞及其他腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞均有表達(dá)，對(duì)于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)具有重要作用［9-11］。近端腎小管上皮細(xì)胞mTORC1信號(hào)通路活性異常參與多種腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展［11-14］。因此深入闡明近端腎小管上皮細(xì)胞中mTORC1信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制，有望為以mTORC1信號(hào)通路作為靶點(diǎn)治療的腎臟疾病提供新思路和新靶點(diǎn)。

mTORC1受多種信號(hào)調(diào)節(jié)，如生長因子、氨基酸和細(xì)胞能量。AMP活化蛋白激酶（AMPK）作為一種關(guān)鍵的生理能量傳感器，可通過磷酸化TSC2 或直接通過磷酸化Raptor 抑制mTORC1的活化［15,16］。溶酶體作為氨基酸介導(dǎo)mTORC1活化的主要場所，其功能的維持對(duì)于mTORC1信號(hào)通路的活化具有重要作用［17,18］?？张菪虷+-ATP酶（V-ATPase）負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)溶酶體等細(xì)胞器的酸化，對(duì)于維持溶酶體功能及mTORC1的活化具有重要作用［19,20］。下調(diào)V-ATPase亞基V1G1的表達(dá)可抑制V-ATPase活性及mTORC1的活化［21］。Numb基因具有控制細(xì)胞不對(duì)稱分裂和細(xì)胞命運(yùn)選擇的功能［22］。哺乳動(dòng)物Numb有3個(gè)主要的功能結(jié)構(gòu)域，通過與不同的蛋白分子相互作用，參與p53、Notch等多條信號(hào)通路的調(diào)控［23-26］。研究證明，沉默MCF-7細(xì)胞中Numb基因的表達(dá)抑制溶酶體功能［27］。但是，Numb在近端小管上皮細(xì)胞mTORC1信號(hào)通路活化中的作用及作用機(jī)制尚不清楚。

本研究采用近端腎小管上皮細(xì)胞株NRK-52E細(xì)胞、正常小鼠腎臟組織及發(fā)生AKI的小鼠腎臟組織為研究對(duì)象，證明了Numb具有促進(jìn)mTORC1活化的作用，并闡明其機(jī)制可能與上調(diào)V1G1的蛋白表達(dá)有關(guān)。本研究為闡明近端腎小管上皮細(xì)胞mTORC1信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制提供新的線索，為mTORC1活性異常介導(dǎo)的腎臟疾病的治療提供新靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)用野生型雄性BALB/c小鼠（南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心），共25只，7周齡，體質(zhì)量20～25 g。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株：正常大鼠近端腎小管上皮（NRK-52E）細(xì)胞由南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院慢性腎病國家臨床醫(yī)學(xué)研究中心提供，人腎上皮細(xì)胞（293T）由郴州市第一人民醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所提供，小鼠用NC-siRNA（陰性對(duì)照siRNA）、Numb-siRNA（廣州銳博），細(xì)胞用NC-siRNA、NumbsiRNA（上海吉瑪），100X 氨基酸混合液、Lipofectamine2000（Invitrogen）、順鉑、IV 型膠原酶（sigma），高糖型DMEM培養(yǎng)基、DMEM-F12培養(yǎng)、胎牛血清、胰蛋白酶、EBSS培養(yǎng)基（Gibco），ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（碧云天），Percoll 分離液（Amersham Biosciences），原代腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)基(Lifeline Cell Technology)，Numb、S6、p-S6、AMPK、p-AMPK、S6K1、p-S6K1、4EBP1、p-4EBP1、Megalin抗體（Cell Signaling Technology）、V1G1 及GAPDH 抗體（Proteintech），硝酸纖維素膜（Biorad），免疫組化試劑盒、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔、兔抗鼠二抗（北京中杉金橋），pSIN-EF2-puromycin空載病毒質(zhì)粒、pSPAX2質(zhì)粒及pMD2.G質(zhì)粒由郴州市第一人民醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所提供，pSIN-EF2-V1G1-puromycin慢病毒質(zhì)粒（南京金斯瑞），大腸桿菌DH5α感受態(tài)（康體生命）、質(zhì)粒抽提試劑盒（天根），SureENTRY（Qiagen），陽離子聚合物聚乙烯亞胺（PEI）（Polyscience）。所有動(dòng)物處理方案均經(jīng)湘南學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠小干擾RNA（SiRNA）轉(zhuǎn)染 所有動(dòng)物都在湘南學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室22～24 ℃、50%～60%的濕度、12 h明暗循環(huán)環(huán)境下飼養(yǎng)。適應(yīng)1周后將小鼠隨機(jī)分為NC-siRNA處理組和Numb-siRNA處理組，5只/組。NC-siRNA處理組小鼠給予尾靜脈注射NC-siRNA，Numb-siRNA處理組小鼠給予尾靜脈注射Numb-siRNA。具體方法為將Numb-siRNA或NC-siRNA（5 nmol/L溶于0.2 mLDEPC水中）于10 s 內(nèi)經(jīng)小鼠尾靜脈注射至體內(nèi)，連續(xù)注射4 d，1 次/d，第5 天收集小鼠腎臟組織用于檢測分析。Numb-siRNA 序列為5'-CAGCCUGUUUAGAGCGU AAdtdt-3'。

1.2.2 細(xì)胞siRNA轉(zhuǎn)染 NRK-52E細(xì)胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基）在37 ℃、5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)融合度達(dá)80%～90%時(shí)，用0.25%的胰蛋白酶消化，傳代接種到6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長融合至60%～70%時(shí)，按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行NC-SiRNA及Numb-siRNA的轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h 后收集細(xì)胞通過Western blot 檢測Numb的敲除效率。NC-siRNA序列為：GCGACGAU CUGCCUAAGAUdT，Numb-siRNA 序列為：GCACC UGCCCAGUGGAUCCTT。

1.2.3 氨基酸誘導(dǎo)mTORC1活化的細(xì)胞模型 NRK-52E細(xì)胞用完全培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待培養(yǎng)融合度達(dá)80%～90%或者轉(zhuǎn)染siRNA 48 h后，棄除完全培養(yǎng)基，給予1 mL EBSS培養(yǎng)基孵育50 min，使細(xì)胞處于氨基酸饑餓狀態(tài)，然后加入10 μL/孔100×氨基酸混合液至1×工作濃度刺激10 min。

1.2.4 順鉑誘導(dǎo)的AKI小鼠模型 雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組、順鉑處理組及Numb干預(yù)組。對(duì)照組給予NC-siRNA及生理鹽水注射；順鉑處理組給予NC-siRNA 及順鉑注射；Numb 干預(yù)組給予NumbsiRNA及順鉑注射。順鉑處理組和對(duì)照組模型建立方法為腹腔單次注射順鉑/生理鹽水25 mg/（kg·d）。具體建模方法為：NC-siRNA或Numb-siRNA注射完成后，第2天進(jìn)行順鉑/生理鹽水注射構(gòu)建AKI小鼠模型，在建模期間隔天注射1次NC-siRNA或Numb-siRNA，第3天收集小鼠腎臟組織及血液標(biāo)本。

1.2.5 免疫組化染色檢測Numb、Megalin的表達(dá)與分布采用SP二步法，將4 μm厚的組織切片行脫蠟、水化、微波爐加熱進(jìn)行抗原修復(fù)；30 mL/L H2O2去離子水孵育，一抗Numb（1∶100）、Megalin（1∶100），4 ℃孵育過夜；PBS洗滌后，加相應(yīng)二抗孵育，DAB顯色，自來水充分沖洗、復(fù)染、脫水、封片，光鏡下觀察并拍照。

1.2.6 原代近端腎小管上皮細(xì)胞分離及培養(yǎng) 雄性BALB/c小鼠按照上述方法注射NC-siRNA或NumbsiRNA后，第2天小鼠經(jīng)5%水合氯醛麻醉后，75%乙醇中浸泡5 min，勿將小鼠口鼻浸入乙醇中。超凈臺(tái)中剖開小鼠胸腹部，取雙腎置于冷PBS中去除腎蒂及包膜，取薄層腎皮質(zhì)于PBS中剪碎至1 mm3，PBS洗滌800 r/min離心2次，5 min/次。棄上清液，加入0.75 mg/mL的IV型膠原酶消化液(含5%胎牛血清），終質(zhì)量濃度為1 g/L，37 ℃振蕩消化15 min，用1 mL 移液槍充分抽吸組織消化液使組織充分裂解，然后用等體積含10%胎牛血清的PBS 中止消化，將組織消化液置于4 ℃以50×g離心2 min收集腎小管。DMEM-F12培養(yǎng)基洗滌后，用32%Percoll 分離液重懸沉淀，以2000×g、4 ℃離心10 min。離心后可見液體分層，吸取近管底第2層細(xì)胞懸液，即為近端腎小管節(jié)段及其游離的腎小管上皮細(xì)胞。15 mL DMEM-F12培養(yǎng)基洗滌，并以1000 r/min離心10 min以去除殘留的Percoll分離液。純化的近端小管使用原代近端腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)基重懸后接種到60 mm的培養(yǎng)皿中，于37 ℃、5%CO2細(xì)胞孵箱靜置培養(yǎng)，隔天換液。原代培養(yǎng)待5～6 d 細(xì)胞長滿后，用0.05%胰蛋白酶消化并傳代培養(yǎng)。

1.2.7 慢病毒載體的包裝 委托南京金斯瑞生物科技有限公司構(gòu)建V1G1過表達(dá)的慢病毒重組質(zhì)粒pSIN-EF2-V1G1-puromycin，將制備好的pSIN-EF2-V1G1-puromycin 質(zhì)粒、對(duì)照空載病毒質(zhì)粒pSIN-EF2-puromycin 及其2 種輔助病毒包裝原件載體質(zhì)粒pSPAX2、pMD2.G分別進(jìn)行高純度無內(nèi)毒素抽提。將上述得到質(zhì)粒，pSIN-EF2-V1G1-puromycin/pSIN-EF2-V1G1-puromycin、pSPAX2、pMD2.G與PEI轉(zhuǎn)染試劑混勻并在室溫中孵育20 min，將上述混合液分別緩慢加入到293 T 細(xì)胞中混勻后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后將基礎(chǔ)培養(yǎng)基更換為2%血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞上清液，再于7000 r/min離心5 min，收集的上清即為V1G1過表達(dá)慢病毒顆粒及空載慢病毒顆粒，將其按照500 μL/管進(jìn)行分裝，凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8 慢病毒感染 NRK-52E細(xì)胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，將其接種于6 孔培養(yǎng)板，待其細(xì)胞融合度60%～70%時(shí)，按照SureENTRY轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行V1G1過表達(dá)慢病毒及空載慢病毒的感染，感染48 h后收集細(xì)胞通過Western blot檢測V1G1的過表達(dá)情況。

1.2.9 siRNA轉(zhuǎn)染、慢病毒感染和氨基酸饑餓/再刺激共處理 將NRK-52E細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、Numb沉默組以及V1G1干預(yù)組。對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行NC-siRNA轉(zhuǎn)染及空載慢病毒感染；Numb 沉默組進(jìn)行NumbsiRNA 感染及空載慢病毒感染；V1G1 干預(yù)組進(jìn)行Numb-siRNA感染及V1G1過表達(dá)慢病毒感染。待細(xì)胞融合度為60%～70%進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，12 h后進(jìn)行慢病毒感染，培養(yǎng)48 h后再構(gòu)建氨基酸誘導(dǎo)mTORC1活化的細(xì)胞模型。

1.2.10 Western blot法檢測相關(guān)蛋白的表達(dá) 收集的腎臟及細(xì)胞使用RIPA蛋白裂解液提取總蛋白，采用蛋白質(zhì)二甲喹啉甲酸法（BCA法）進(jìn)行蛋白定量分析；加入2X SDS上樣緩沖液至終濃度為1X，蛋白于100 ℃煮10 min；用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白后將蛋白由凝膠轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上；使用5%脫脂奶粉于室溫封閉1 h后，剪出所需蛋白條帶用相應(yīng)的一抗于4 ℃孵育過夜；次日采用相應(yīng)的HRP標(biāo)記二抗于室溫孵育1 h，加入化學(xué)發(fā)光試劑，使用化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行拍照，F(xiàn)luorchem 8900 軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；3組比較采用單因素方差分析；4組比較采用兩因素方差分析，組間兩兩比較則采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Numb對(duì)小鼠近端腎小管上皮細(xì)胞中mTORC1信號(hào)通路活性的影響

Western blot結(jié)果顯示：與NC-siRNA 處理組相比，Numb-siRNA 處理組小鼠腎臟Numb、p-S6的蛋白表達(dá)水平下調(diào)（P＜0.05，圖1A、B、D、E）。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：Numb基因主要在腎臟近端腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)，與NC-siRNA 處理組相比，Numb-siRNA 處理組小鼠腎臟近端腎小管上皮細(xì)胞Numb蛋白表達(dá)水平降低，但不影響近端腎小管標(biāo)記蛋白Megalin的表達(dá)與分布（圖1C）。

圖1 Numb對(duì)小鼠近端腎小管上皮細(xì)胞中mTORC1信號(hào)通路活性的影響Fig.1 Effect of Numb knockdown on activity of mTORC1 pathway in mouse proximal tubules.A,B: Western blotting for detecting Numb protein expression in the kidneys of Numb-siRNA-treated mice and NC-siRNAtreated mice(n=5,*P＜0.05).C:Immunohistochemistry for detecting Numb(upper panel)and megalin(lower panel)expressions in sequential sections of the kidney tissues from Numb-siRNA treated mice and NC-siRNA treated mice (Scale bar: 50 μm).Upper arrows indicate an decreased expression of Numb,and lower arrows indicate an unchanged expression of Megalin.D,E: Western blotting for detecting the protein level of p-S6 in the kidneys of Numb-siRNA-treated mice and NC-siRNA-treated mice.S6 was used to verify equivalent loading(n=5,*P＜0.05).

2.2 Numb對(duì)AKI誘導(dǎo)的腎臟mTORC1信號(hào)通路活化的影響

Western blot 結(jié)果顯示：與對(duì)照組小鼠相比，NCsiRNA+順鉑處理組小鼠腎臟p-S6K1 和p-4EBP1的蛋白表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.05），而與NC-siRNA+順鉑處理組小鼠相比，Numb-siRNA+順鉑處理組小鼠腎臟p-S6K1 和p-4EBP1的蛋白表達(dá)水平下調(diào)（P＜0.05，圖2A～C）。

圖2 Numb對(duì)AKI誘導(dǎo)的腎臟mTORC1信號(hào)通路活化的影響Fig.2 Effect of Numb knockdown on ctivity of mTORC1 pathway in proximal tubules in cisplatin-induced AKI mouse model.A:Western blots of p-S6K1,S6K1,p-4EBP1,and 4-EBP1 in the kidneys of the mice in different groups.S6K1 and 4-EBP1 were used to verify equivalent loading for p-S6K1 and p-4EBP1,respectively.B: Quantitative analysis of p-S6K1 to total S6K1 ratio.C:Quantitative determination of p-4EBP1 to total 4-EBP1 ratio.*P＜0.05 vs NC-siRNA-treated mice with saline treatment;#P＜0.05 vs NC-siRNA-treated mice with cisplatin treatment(n=5).

2.3 Numb對(duì)NRK-52E細(xì)胞中mTORC1 信號(hào)通路活性的影響

Western blot顯示：細(xì)胞給予PBS培養(yǎng)50 min后，p-S6的蛋白表達(dá)水平降低，而再給予1×氨基酸刺激10 min后，p-S6的蛋白表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.05，圖3A、B）；在NC-siRNA 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，氨基酸再刺激促進(jìn)S6的磷酸化，而轉(zhuǎn)染Numb-siRNA的細(xì)胞中，Numb及p-S6的蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組均顯著下調(diào)（P＜0.05，圖3C～E）。

圖3 Numb對(duì)NRK-52E細(xì)胞中mTORC1 信號(hào)通路活性的影響Fig.3 Effect of Numb knockdown on the activity of mTORC1 pathway in NRK-52E cells.A:Western blotting for detecting phosphorylation of S6 in NRK-52E cells after amino acid starvation and readdition.B:Quantitative determination of p-S6 in the cells(*P＜0.05 vs-/-controls;#P＜0.05 vs starved cells.n=3).C:Amino acids readdition failed to restore the phosphorylation of S6 in cells with Numb-siRNA transfection compared with cells with NC-siRNA transfection.D:Quantitative determination of Numb and S6 in each group(**P＜0.01 vs NC-siRNA-transfected cells with starvation;#P＜0.05 vs NC-siRNA-transfected cells with amino acid mixture readdition).E:Quantitative determination of p-S6 in each group(**P＜0.01 vs NC-siRNA-transfected cells with starvation.#P＜0.05 vs NC-siRNAtransfected cells with amino acid mixture readdition.n=3).

2.4 Numb對(duì)近端腎小管上皮細(xì)胞中AMPK活性的影響

Western blot 結(jié)果顯示：在NRK-52E 細(xì)胞中，與NC-siRNA處理組相比，Numb-siRNA處理組細(xì)胞中p-AMPK 的蛋白表達(dá)水平下調(diào)（P＜0.05，圖4A）；與NCsiRNA 處理組小鼠相比，Numb-siRNA 處理組小鼠腎臟p-AMPK的蛋白表達(dá)水平下調(diào)（P＜0.05，圖4B）；為了進(jìn)一步證實(shí)Numb促進(jìn)近端腎小管上皮細(xì)胞中AMPK的活化，我們從Numb-siRNA處理組小鼠和NC-siRNA處理組小鼠中提取了原代近端腎小管細(xì)胞。Western blot結(jié)果顯示：與NC-siRNA處理的小鼠原代近端腎小管細(xì)胞相比，Numb-siRNA處理的小鼠原代近端腎小管細(xì)胞中的Numb和p-AMPK表達(dá)水平均下調(diào)（P＜0.05，圖4C、D）。

圖4 Numb對(duì)近端腎小管上皮細(xì)胞中AMPK活性的影響Fig.4 Effect of Numb knockdown on the activity of AMPK in proximal tubular cells.A:Western blotting for detecting p-AMPK and AMPK in Numb-siRNA-or NC-siRNA-transfected NRK-52E cells and quantitative determination of p-AMPK to total AMPK ratio (n=3.*P＜0.05).B:Western blotting for detecting p-AMPK and AMPK in the kidneys of Numb-siRNA-treated mice and NC-siRNA-treated mice and quantitative determination of the p-AMPK to total AMPK ratio(n=5.*P＜0.05).C:Western blotting for detecting Numb expression in the primary proximal tubular cells from Numb-siRNA-treated mice and NC-siRNA-treated mice and quantitative determination of Numb to GAPDH ratio.D:Western blotting for detecting p-AMPK and total AMPK expressions in the primary proximal tubular cells(n=5.*P＜0.05).

2.5 V1G1是Numb的功能靶點(diǎn)，V1G1可逆轉(zhuǎn)Numb沉默導(dǎo)致的mTORC1活化的抑制

Western blot 顯示：在NRK-52E 細(xì)胞中，與NCsiRNA 處理組相比，Numb-siRNA 處理組細(xì)胞中V1G1 的蛋白表達(dá)水平下調(diào)（P＜0.05，圖5A、B）；感染V1G1過表達(dá)慢病毒的NRK-52E細(xì)胞V1G1蛋白表達(dá)上調(diào)（圖5C）；與NC-siRNA 處理組相比，轉(zhuǎn)染NumbsiRNA后抑制氨基酸介導(dǎo)的S6的磷酸化（P＜0.01），而感染V1G1過表達(dá)慢病毒可逆轉(zhuǎn)Numb沉默介導(dǎo)的p-S6的蛋白表達(dá)水平的降低（P＜0.05，圖5D～F）。

圖5 Numb通過上調(diào)V1G1促進(jìn)氨基酸介導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞中mTORC1的活化Fig.5 Numb promotes amino acid-induced activation of mTORC1 by upregulating V1G1 protein expression in NRK-52E cells.A,B:Western blotting for detecting the protein levels of V1G1 in Numb siRNA or NC-siRNA-transfected NRK-52E cells(n=3.*P＜0.05).C: Western blotting for detecting protein levels of V1G1 in NRK-52E cells with V1G1 overexpression.D: V1G1 overexpression restores the phosphorylation of S6 in cells with Numb-siRNA transfection.E: Quantitative determination of V1G1 and S6 in each group(**P＜0.01 vs NC-siRNA-transfected cells with amino acid mixture readdition;#P＜0.05 vs NumbsiRNA transfected cells with amino acid mixture readdition).F:Quantitative determination of p-S6 in each group(**P＜0.01 vs NC-siRNA transfected cells with amino acid mixture readdition;#P＜0.05 vs Numb-siRNA transfected cells with amino acid mixture readdition).

3 討論

mTORC1是一個(gè)從酵母到哺乳動(dòng)物都保守存在的復(fù)合體，通過促進(jìn)蛋白質(zhì)的翻譯以及合成等方式，促進(jìn)細(xì)胞的生長和增殖［2,28］。在腎臟近端腎小管上皮細(xì)胞中mTORC1具有豐富表達(dá)，其活性異常是AKI等腎臟疾病發(fā)生發(fā)展的重要原因［11-14］。因此，闡明近端腎小管上皮細(xì)胞中mTORC1 信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制，將為mTORC1活性異常相關(guān)性腎臟疾病的治療提供新靶點(diǎn)。Numb是一種多功能蛋白，參與調(diào)控多種信號(hào)通路的傳導(dǎo)［24-26］。我們前期研究證明，Numb在腎臟主要表達(dá)于近端腎小管上皮細(xì)胞，在AKI、CKD的發(fā)生發(fā)展中均發(fā)揮著重要作用［29-31］。關(guān)于Numb在近端腎小管上皮細(xì)胞mTORC1信號(hào)通路中的調(diào)控作用和機(jī)制的研究尚未見報(bào)道，因此，本研究旨在探討Numb對(duì)近端腎小管上皮細(xì)胞中mTORC1信號(hào)通路活化的影響及其潛在的分子機(jī)制。

mTORC1是一種營養(yǎng)傳感器，當(dāng)細(xì)胞接受到氨基酸、生長因子等信號(hào)刺激后，mTORC1從細(xì)胞胞漿轉(zhuǎn)移至溶酶體而被激活［32］。研究發(fā)現(xiàn)，溶酶體功能受損抑制氨基酸誘導(dǎo)mTORC1信號(hào)通路的活化［17,18］。最近的一項(xiàng)研究表明，在MCF-7細(xì)胞中，沉默Numb基因的表達(dá)抑制Rab7活性和溶酶體功能［27］。提示Numb可能參與近端腎小管上皮細(xì)胞中mTORC1信號(hào)通路活性的調(diào)控。近有研究報(bào)道，同時(shí)敲除成骨細(xì)胞中Numb 和Numbl基因通過抑制PTEN蛋白的降解抑制mTORC1信號(hào)通路的活化［33］。本研究表明，在Numb表達(dá)水平下調(diào)的NRK-52E 細(xì)胞株、正常小鼠腎臟及順鉑誘導(dǎo)的AKI 小鼠模型腎臟中，mTORC1 下游信號(hào)分子S6、S6K1和4EBP-1的磷酸化水平顯著降低，說明在生理情況及AKI病理情況下，Numb均具有促進(jìn)近端腎小管細(xì)胞中mTORC1 信號(hào)通路活化的作用，與既往研究一致。接下來，我們進(jìn)一步探討Numb激活mTORC1信號(hào)通路的潛在分子機(jī)制。

AMPK 作為機(jī)體代謝的重要調(diào)控分子，是mTORC1的負(fù)性上游調(diào)控分子，直接參與對(duì)mTORC1活性的調(diào)節(jié)［34］。研究證明，AMPK 可以通過磷酸化TSC2 或直接通過磷酸化Raptor 抑制mTORC1信號(hào)通路的活化［15,16］。本研究結(jié)果顯示，在Numb表達(dá)水平下調(diào)的NRK-52E細(xì)胞、小鼠腎臟或者原代近端腎小管上皮細(xì)胞中，p-AMPK的蛋白表達(dá)水平均是下調(diào)的，說明下調(diào)近端腎小管上皮細(xì)胞中Numb的表達(dá)抑制AMPK的活化，與我們預(yù)想結(jié)果相反。另有研究報(bào)道，溶酶體V-ATPase-ragulator 復(fù)合物是AMPK和mTORC1活化的共同激活劑，V-ATPase 酶活性降低，導(dǎo)致AXIN/LKB1-AMPK 復(fù)合物和mTORC1從溶酶體外膜解離，從而分別抑 制LKB1 和Rheb-GTP 對(duì)AMPK 和mTORC1 的激活［35］。因此，我們認(rèn)為Numb可能通過穩(wěn)定V-ATPase的酶活性從而激活mTORC1信號(hào)通路。

V-ATPase是一類特殊的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是由14個(gè)亞基組成的質(zhì)子泵，只有V0 和V1亞單位相結(jié)合才能發(fā)揮其蛋白酶的作用［36］。V-ATPase 位于溶酶體等多種細(xì)胞器的膜上，通過與Ragulator形成復(fù)合物，促進(jìn)mTORC1的溶酶體定位及其活化［33］。研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)宮頸癌（Hela）細(xì)胞中V-ATPase亞型V1G1 的蛋白表達(dá)抑制VATPase 活化以及溶酶體功能［37］。有研究證明，小分子天然產(chǎn)物Verucopeptin 靶向V-ATPase的V1G亞基，有效的抑制V-ATPase的活性和mTORC1信號(hào)通路的活化［21］。本研究結(jié)果顯示，沉默NRK-52E細(xì)胞中Numb的表達(dá)，V1G1蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)，V1G1過表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)Numb沉默所介導(dǎo)的mTORC1活化的抑制作用，該結(jié)果表明Numb可以通過上調(diào)NRK-52E細(xì)胞中V1G1的蛋白表達(dá)激活mTORC1信號(hào)通路，與既往研究一致［21］。

綜上所述，本研究表明，Numb可通過上調(diào)V1G1的蛋白表達(dá)，促進(jìn)近端腎小管上皮細(xì)胞中mTORC1信號(hào)通路的活化。這揭示了mTORC1信號(hào)通路的新分子調(diào)控機(jī)制，為由mTORC1活性異常介導(dǎo)的腎臟疾病的治療提供了新的治療靶點(diǎn)。