朱海濤，毛慧蘭，陶 爽，王文銳，陳昌杰，楊清玲

1蚌埠醫(yī)學(xué)院癌癥轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)安徽省重點實驗室，2蚌埠醫(yī)學(xué)院腫瘤基礎(chǔ)研究與臨床檢驗診斷重點實驗室，3生物技術(shù)教研室，4生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，安徽蚌埠233000

2020年，世界女性乳腺癌新發(fā)病例數(shù)超過220萬，超過肺癌發(fā)病數(shù)而成為全球癌癥首要發(fā)病原因，是第五大腫瘤致死因素［1］。當(dāng)前，臨床乳腺癌治療措施包括手術(shù)治療和各種抗腫瘤藥物治療，抗腫瘤藥物他莫昔芬、曲妥珠單抗和紫杉醇等是乳腺癌藥物治療中常用的藥物［2］，然而抗腫瘤藥物耐藥往往導(dǎo)致治療過程被迫中斷。因此，迫切需要闡明乳腺癌耐藥細(xì)胞對抗腫瘤藥物的分子機制，為臨床治療乳腺癌化療耐藥提供支持。非編碼RNA多是一類不能編碼蛋白質(zhì)的RNA，研究發(fā)現(xiàn)非編碼RNA在乳腺癌細(xì)胞耐藥誘導(dǎo)中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用［3,4］。miR-16-5p在肝癌、宮頸癌和肺癌等腫瘤中可影響腫瘤細(xì)胞對放化療藥物的敏感性，減弱放化療藥物的殺傷作用［5-7］，并有研究發(fā)現(xiàn)miR-16-5p還能抑制乳腺癌細(xì)胞生長［8,9］。但miR-16-5p在乳腺癌化療耐藥中的研究尚未見報道。YWHAQ屬于14-3-3家族，有研究通過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)患者乳腺發(fā)生病變時，YWHAQ表達量會升高，且YWHAQ還能夠影響乳腺癌的治療效果以及預(yù)后情況［10,11］。目前尚缺乏YWHAQ影響乳腺癌耐藥細(xì)胞活性的實驗性驗證。本研究希望通過分析miR-16-5p調(diào)節(jié)YWHAQ的表達，闡述二者影響乳腺癌紫杉醇耐藥細(xì)胞生物學(xué)活性的分子機制，為臨床治療乳腺癌化療耐藥提供有效的靶點。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 臨床標(biāo)本 臨床標(biāo)本選自2019年1月～2022年1月間在蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院以及蚌埠市第三人民醫(yī)院進行手術(shù)治療的乳腺浸潤性癌及其癌旁組織（與腫瘤均不在同一象限且與腫塊邊緣相距5 cm）共13 對，病理結(jié)果均得到病理醫(yī)師確認(rèn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：女性，通過手術(shù)或穿刺活檢病理確診為乳腺癌者，乳腺癌組患者均符合《中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南與規(guī)范（2015版）》［12］中的診斷標(biāo)準(zhǔn)；無其他系統(tǒng)疾病；術(shù)前無相關(guān)抗腫瘤藥物治療史；臨床資料完整者等。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前已接受抗腫瘤藥物治療者；既往乳腺癌治療復(fù)發(fā)者；發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移者；伴有其他惡性腫瘤者；合并其他器官嚴(yán)重受損者等。本實驗已通過蚌埠醫(yī)學(xué)院倫理委員會倫理審查。

1.1.2 一般資料與臨床病理特征 收集的乳腺浸潤癌患者均為女性，年齡43～87歲。根據(jù)美國腫瘤聯(lián)合會第8版乳腺癌分期標(biāo)準(zhǔn)（TNM法），其中臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者共11人，Ⅲ期共2人。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（+）共4人。免疫組化結(jié)果：ER（+）共11人，PR（+）共10人，HER-2（+）共8人。

1.1.3 細(xì)胞株 人乳腺癌親本細(xì)胞（SKBR-3）購自中國科學(xué)院細(xì)胞研究所；紫杉醇耐藥細(xì)胞（SKBR-3/PR）由課題組構(gòu)建［13］。

1.1.4 試 劑 DMEM 培養(yǎng)基（Hyclone）；Trazol（Invitrogen）；PCR 試劑盒（GeneCopoeia 和Vazyme）；miR-16-5p類似物、抑制劑和YWHAQ干擾片段、雙熒光素酶報告載體（GenePharma）；Bax、Bcl-2和β-actin抗體（Proteintech）；YWHAQ抗體（Abclonal）；細(xì)胞周期與凋亡檢測試劑盒（Beyotime）；雙熒光素酶報告檢測試劑盒（Promega）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SKBR-3和SKBR-3/PR細(xì)胞均使用含10%的FBS（胎牛血清）的完全培養(yǎng)基。SKBR-3/PR細(xì)胞培養(yǎng)過程中使用低濃度紫杉醇維持耐藥性。當(dāng)細(xì)胞融合度培養(yǎng)至80%～90%可傳代。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取8×104對數(shù)生長期的SKBR-3/PR細(xì)胞接種于六孔板內(nèi)；當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞融合度達到70%左右時，更換無血清培養(yǎng)基，按各實驗分組要求添加相應(yīng)的轉(zhuǎn)染片段，6 h后更換含10%FBS的完全培養(yǎng)基。

1.2.3 qRT-PCR檢測RNA表達水平 Trazol裂解細(xì)胞提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，稀釋后進行qRT-PCR。U6和GAPDH分別為miR-16-5p與YWHAQ的內(nèi)參。U6和miR-16-5p的引物由廣州易錦生物（GeneCopoeia）公司合成提供，GAPDH和YWHAQ引物由生工（上海）公司合成提供。qRT-PCR反應(yīng)程序：首先設(shè)置95 ℃預(yù)變性10 min，然后以95 ℃10 s、55 ℃20 s與72 ℃10 s為一個循環(huán)，進行40～55 個循環(huán)，結(jié)果取平均Ct值，相對表達量以2-ΔΔCt法計算。

1.2.4 Western blot檢測細(xì)胞蛋白水平 在細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后收集各處理組細(xì)胞，依細(xì)胞量加入裂解液，于冰上充分裂解。樣品變性后電泳，200 mA轉(zhuǎn)膜2 h。室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗（1∶8000）孵育2 h 后曝光。蛋白條帶經(jīng)灰度值掃描得到結(jié)果，經(jīng)歸一化處理后統(tǒng)計作圖。實驗中使用的各蛋白抗體稀釋比如下：YWHAQ（1∶1500），Bax（1∶5000），Bcl-2（1∶6000），β-actin（1∶4000）。

1.2.5 Transwell實驗 將小室放入加了完全培養(yǎng)基的24孔板內(nèi)，向上室緩慢加入6×103個轉(zhuǎn)染培養(yǎng)24 h后的SKBR-3/PR細(xì)胞。培養(yǎng)24 h后取出小室，經(jīng)固定、染色、晾干后，拍照并計數(shù)穿孔細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 CCK-8實驗 向96孔板中加入SKBR-3/PR細(xì)胞懸液（2×103/孔），當(dāng)密度達到70%左右進行轉(zhuǎn)染。依次在培養(yǎng)24、48、72 h與96 h時拿出培養(yǎng)板，各孔加入CCK-8試劑，37 ℃孵育1 h后在450 nm處測定吸光度值A(chǔ)450nm。

1.2.7 細(xì)胞周期實驗 在轉(zhuǎn)染24 h后，收集各處理組細(xì)胞，PBS洗滌，1000g離心5 min，70%乙醇重懸并4 ℃固定，過夜后棄去固定液，加入RNaseA和碘化丙啶，37 ℃避光30 min后，使用流式細(xì)胞儀檢測各期細(xì)胞比例。PBS與乙醇均需提前冰浴預(yù)冷處理。

1.2.8 細(xì)胞凋亡實驗 使用無EDTA胰酶將各實驗組細(xì)胞消化下來，2000 r/min離心5 min，PBS重懸，離心棄上清，吸取結(jié)合液和染液將細(xì)胞混勻。室溫避光10 min后，使用流式細(xì)胞儀觀察各實驗處理下細(xì)胞凋亡情況。

1.2.9 雙熒光素酶實驗 實驗以YWHAQ-WT+miRNA陰性對照組/miR-16-5p 類似物組、YWHAQ-MUT+miRNA陰性對照組/miR-16-5p類似物組分4 組。轉(zhuǎn)染培養(yǎng)24 h后，依據(jù)試劑說明書測出各組熒光值。實驗結(jié)果以兩種熒光素酶熒光活性比值作為基因的活性值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS16.0進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組采用獨立樣本t檢驗，多組采用單因素方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-16-5p 在乳腺癌組織中表達水平較低

通過qRT-PCR檢測miR-16-5p在乳腺癌臨床樣本間的差異表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳腺腫瘤組織中的miR-16-5p表達水平相對于癌旁組織顯著降低（-1.19±1.90vs1.59±1.76，P＜0.01，圖1A）。通過Kaplan Meier-plotter數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌患者中，miR-16低表達的患者預(yù)后較差（P＜0.01，圖1B）。

圖1 miR-16-5p在乳腺癌中的表達與預(yù)后Fig.1 Expression of miR-16-5p in breast cancer tissues and outcomes of the patients.A:Ex-pression of miR-16-5p in breast cancer tissue and adjacent tissue.B: Kaplan-Meier survival curves of breast cancer patients with high and low expressions of miR-16-5p.**P＜0.01 vs adjacent tissue.

2.2 miR-16-5p在乳腺癌化療耐藥細(xì)胞中表達水平較低

通過qRT-PCR 實驗檢測發(fā)現(xiàn)，相對于SKBR-3，SKBR-3/PR 細(xì)胞中miR-16-5p 的表達水平明顯降低（P＜0.01，圖2A）。通過qRT-PCR實驗驗證miR-16-5p類似物與抑制劑的作用效果，結(jié)果顯示，相對于對照組，陰性對照組的miR-16-5p的表達量變化無統(tǒng)計學(xué)意義，而miR-16-5p 類似物能夠顯著上調(diào)SKBR-3/PR 細(xì)胞miR-16-5p的表達量（P＜0.01，圖2B），miR-16-5p抑制劑能夠顯著下調(diào)細(xì)胞miR-16-5p表達量（P＜0.01，圖2C）。

圖2 qRT-PCR檢測miR-16-5p在不同組中的差異表達Fig.2 Expression of miR-16-5p in SKBR-3 and SKBR-3/PR with different treatments detected by qRT-PCR.A: Expression of miR-16-5p in SKBR-3 and SKBR-3/PR cells.B,C:Transfection efficiency of miR-16-5p.##P＜0.01 vs SKBR-3,**P＜0.01 vs control.

2.3 miR-16-5p對乳腺癌耐藥細(xì)胞的增殖、遷移及凋亡的影響

通過CCK-8實驗，在耐藥細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-16-5p類似物48 h 后，耐藥細(xì)胞的活性開始降低（P＜0.01，圖3A）。此外，細(xì)胞周期實驗結(jié)果顯示，相對于對照組，轉(zhuǎn)染miR-16-5p類似物后，SKBR-3/PR細(xì)胞周期停滯在G0/G1期[（55.61±1.99vs43.06±1.53）%，P＜0.01，圖3B]。細(xì)胞凋亡實驗結(jié)果顯示，相對于對照組，miR-16-5p類似物能夠促進耐藥細(xì)胞凋亡[（10.37±0.23vs3.10±0.97）%，P＜0.01，圖3C]。同時，Transwell 結(jié)果顯示miR-16-5p 類似物組的穿膜細(xì)胞數(shù)較空白對照組明顯減少，細(xì)胞遷移能力被抑制（125.25±6.34vs250.75±20.84，P＜0.01，圖4A）。而在轉(zhuǎn)染了miR-16-5p抑制劑以后，miR-16-5p抑制劑組耐藥細(xì)胞的凋亡率較空白對照組未見明顯變化[（4.66±1.12）%vs（3.47±0.79）%，P=0.31，圖3D]，miR-16-5p 抑制劑組的SKBR-3/PR細(xì)胞的穿膜數(shù)較空白對照組顯著增多（125.25±6.34vs250.75±20.84，P＜0.01，圖4B）。此外，通過Western blot實驗，發(fā)現(xiàn)與空白對照組相比，miR-16-5p類似物不僅能夠上調(diào)SKBR-3/PR細(xì)胞內(nèi)Bax的蛋白水平（1.57±0.35vs1.00±0.07，P＜0.05，圖4C），還能夠下調(diào)SKBR-3/PR細(xì)胞內(nèi)Bcl-2的蛋白水平（0.59±0.16vs1.00±0.12，P＜0.01，圖4C），而miR-16-5p抑制劑能夠逆轉(zhuǎn)miR-16-5p類似物對凋亡蛋白的作用效果，與空白對照組相比，miR-16-5p抑制劑能夠下調(diào)Bax蛋白水平，上調(diào)Bcl-2蛋白水平（0.73±0.05vs1.00±0.06，1.42±0.12vs1.00±0.05，P＜0.01，P＜0.01，圖4D）。

圖3 miR-16-5p對乳腺癌耐藥細(xì)胞周期和凋亡的影響Fig.3 Effect of miR-16-5p mimics and inhibitor on cell cycle and apoptosis of SKBR-3/PR cells.A:Effect of miR-16-5p overexpression on proliferation of SKBR-3/PR cells assessed by CCK-8 assay.B: Effect of miR-16-5p overexpression on cell cycle of SKBR-3/PR cells analyzed by flow cytometry.C,D:Effect of miR-16-5p on proliferation of SKBR-3/PR cells analyzed by flow cytometry.**P＜0.01 vs control,◆P＞0.05 vs control.

圖4 miR-16-5p對乳腺癌耐藥細(xì)胞遷移與凋亡蛋白的影響Fig.4 Effects of miR-16-5p mimics and inhibitor on migration and apoptotic proteins in SKBR-3/PR cells.A,B: Effect of miR-16-5p mimics and inhibitor on migration of SKBR-3/PR cells (Original magnification: ×100).C,D: Effect of miR-16-5p mimics and inhibitor on expressions of Bcl-2 and Bax in SKBR-3/PR cells detected by Western blotting.*P＜0.05 vs control,**P＜0.01 vs control.

2.4 miR-16-5p能夠靶向調(diào)控YWHAQ的表達

為確定miR-16-5p靶向調(diào)節(jié)的基因，我們首先對4個miRNA數(shù)據(jù)庫（targetscan、starbase、mirdip和mirtarbase）取交集進行分析，發(fā)現(xiàn)有106 個基因與miR-16-5p存在結(jié)合位點（圖5A、B）；其次，通過STRING數(shù)據(jù)庫進行蛋白質(zhì)互作分析后，篩選出4 個潛在靶基因（YWHAQ、RTN4、VEGFA和MFN2）與Bcl-2及Bax存在相互作用關(guān)系（圖5C）；通過生信預(yù)測發(fā)現(xiàn)，靶基因YWHAQ與miR-16-5p之間存在結(jié)合位點（圖5D），而且YWHAQ在乳腺腫瘤中的表達水平較正常組織偏高（P＜0.01，圖5E），乳腺癌患者中YWHAQ高表達者的預(yù)后較差（P＜0.01，圖5F、G）。最后，通過雙熒光素酶活性實驗，發(fā)現(xiàn)YWHAQ-WT（野生型質(zhì)粒）與miR-16-5p類似物共同轉(zhuǎn)染組的熒光素酶信號比YWHAQ-WT 和miRNA陰性對照（NC）共同轉(zhuǎn)染組的顯著降低（0.59±0.01vs1.00±0.04，P＜0.01，圖6A），而YWHAQ-MUT（突變型質(zhì)粒）與miR-16-5p類似物共同轉(zhuǎn)染組的熒光素酶信號與YWHAQ-MUT和miRNA陰性對照（NC）共同轉(zhuǎn)染組相比無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（0.96±0.03vs1.00±0.02，P=0.13，圖6A)；qRT-PCR實驗結(jié)果顯示，SKBR-3/PR細(xì)胞中YWHAQ表達水平高于SKBR-3（P＜0.05，圖6B）。此外，相比于空白對照組，轉(zhuǎn)染miR-16-5p類似物能夠下調(diào)耐藥細(xì)胞中YWHAQ的蛋白水平（0.11±0.04vs1.00±0.11，P＜0.01，圖6C），而miR-16-5p 抑制劑能夠上調(diào)YWHAQ 的蛋白水平（1.93±0.85vs1.00±0.27，P＜0.01，圖6D）。

圖5 生物信息學(xué)分析預(yù)測miR-16-5p的靶基因Fig.5 Bioinformatics analysis for predicting the target gene of miR-16-5p.A:Target gene prediction map of miR-16-5p.B: Network diagram of miR-16-5p and target gene.C:Analysis of protein-protein interaction (PPI) between the target gene and Bcl-2 and Bax.D: Potential binding sites of miR-16-5p and YWHAQ in targetscan database.E: Differential expression of YWHAQ in tumor tissue and normal tissue in TCGA database and GTEx database.F,G: Kaplan-Meier survival curves of breast cancer patients with high and low expressions of YWHAQ.***P＜0.001.

圖6 miR-16-5p直接靶向調(diào)節(jié)YWHAQ表達Fig.6 miR-16-5p directly targets YWHAQ.A:Double luciferase reporter gene assay for verification of YWHAQ as the target gene of miR-16-5p.B: Expression of YWHAQ in SKBR-3 and SKBR-3/PR cells detected by qRT-PCR.C,D: Effect of miR-16-5p mimics and inhibitor on expression of YWHAQ protein in SKBR-3/PR cells detected by Western blotting.**P＜0.01 vs control,#P＜0.05 vs SKBR-3.

2.5 miR-16-5p通過靶向調(diào)節(jié)YWHAQ調(diào)控乳腺癌耐藥細(xì)胞的凋亡和轉(zhuǎn)移能力

為深入研究YWHAQ對乳腺癌耐藥細(xì)胞的作用機制，本研究構(gòu)建了YWHAQ的小干擾片段，通過qRTPCR技術(shù)檢測，構(gòu)建得到的3 條小干擾片段均能夠降低SKBR3/PR 細(xì)胞中YWHAQ 的表達水平（P＜0.01，圖7A）。我們選取敲低效果最好的YWHAQ homo1進行后續(xù)實驗。Western blot 結(jié)果顯示，相對于空白對照組，YWHAQ干擾組Bax蛋白表達量增加（P＜0.01，圖7B、C），YWHAQ和Bcl-2的蛋白表達量減少（P＜0.01，圖7B、C）；將YWHAQ干擾片段與miR-16-5p類似物聯(lián)合轉(zhuǎn)染時，相對于類似物組，聯(lián)合組對各個蛋白的作用效果都更顯著（圖7B、C）。細(xì)胞凋亡實驗與Transwell實驗表明，YWHAQ干擾組耐藥細(xì)胞凋亡率增加、遷移能力減弱（圖8），在與miR-16-5p類似物聯(lián)合作用時，聯(lián)合組耐藥細(xì)胞的凋亡率與遷移抑制率被進一步上升（P＜0.01，圖8）。

圖7 敲低YWHAQ 對乳腺癌耐藥細(xì)胞蛋白的影響Fig.7 Effect of YWHAQ knockdown on protein expression in drug-resistant breast cancer cells.A:Effect of YWHAQ knockdown on expressions of YWHAQ in SKBR-3/PR cells detected by qRTPCR.B,C: Effect of YWHAQ knockdown on expressions of YWHAQ,Bcl-2 and Bax in SKBR-3/PR cells detected by Western blotting.**P＜0.01 vs control,#P＜0.05 vs miR-16-5p mimics,##P＜0.01 vs miR-16-5p mimics.

圖8 YWHAQ對乳腺癌耐藥細(xì)胞生物活性的影響Fig.8 Effect of miR-16-5p overexpression and YWHAQ knockdown on biological activity of drug-resistant breast cancer cells.A,C:Effect of miR-16-5p overexpression and YWHAQ knockdown on apoptosis of SKBR-3/PR cells analyzed by flow cytometry.B,D: Effect of miR-16-5p overexpression and YWHAQ knockdown on migration of SKBR3/PR cells(×100).*P＜0.05 vs control,＊＊P＜0.01 vs control,##P＜0.01 vs miR-16-5p mimics.

3 討論

乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性生命健康的全球性問題，微小RNA（miRNA）因其高度的特異性、可重復(fù)性和準(zhǔn)確性，被廣泛認(rèn)為是惡性實體瘤的生物標(biāo)志物和預(yù)后指標(biāo)。本研究通過對乳腺癌病理樣本進行檢測發(fā)現(xiàn)，miR-16-5p在腫瘤組織中表達水平偏低，表明miR-16-5p在乳腺癌的惡性轉(zhuǎn)變中可能扮演著抑癌的角色。結(jié)合當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)，miR-16-5p在多種腫瘤中表達量發(fā)生異常變化，而且與多種重要的細(xì)胞生物學(xué)過程調(diào)控有關(guān)，比如細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和血管生成［14］。miR-16-5p在膀胱癌細(xì)胞中能夠通過調(diào)控癌細(xì)胞自噬誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡［15］。還發(fā)現(xiàn)miR-16-5p與HIF-α和VEGFA的表達呈負(fù)相關(guān)，提示miR-16-5p 對血管生成有抑制作用［16］。此外，miR-16-5p的差異表達影響臨床惡性腫瘤的放化療敏感性，研究報道m(xù)iR-16-5p可通過調(diào)節(jié)糖酵解和介導(dǎo)代謝重編程來增強宮頸癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性［17］，還能通過調(diào)節(jié)CyclinD1/E1-pRb-E2F1 通路提升前列腺癌細(xì)胞對放療的敏感性［18］；當(dāng)在肝癌細(xì)胞中抑制了miR-16-5p 的表達水平后，肝癌細(xì)胞對索拉非尼（SOR）的耐藥性顯著增加［5］。在乳腺癌細(xì)胞中，當(dāng)下調(diào)miR-16-5p表達后，癌細(xì)胞基因合成速率加快，其增殖能力變強，與此同時，上調(diào)的miR-16-5p則能夠降低裸鼠模型中乳腺癌肺轉(zhuǎn)移率［19］。但目前尚無研究報道m(xù)iR-16-5p對乳腺癌耐藥的影響與作用機制。

細(xì)胞凋亡是腫瘤治療研究中的熱點，腫瘤的惡化、轉(zhuǎn)移和耐藥都與癌細(xì)胞凋亡過少有關(guān)［20］。促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白之間的平衡決定是否啟動細(xì)胞凋亡，癌細(xì)胞中過表達的抗凋亡蛋白Bcl-2 蛋白使平衡失衡，利于癌細(xì)胞存活并對抗放化療藥物的治療效果［21］。而Bax蛋白是常見的促凋亡蛋白，能夠拮抗Bcl-2蛋白的效果。研究發(fā)現(xiàn)，對乳腺癌細(xì)胞使用抗腫瘤藥物處理后，細(xì)胞Bax表達水平和Bax/Bcl-2比值都顯著升高［22,23］。通過本課題組的前期研究，我們發(fā)現(xiàn)，相對于乳腺癌親本細(xì)胞，乳腺癌耐藥細(xì)胞中Bax蛋白表達量降低，Bcl-2蛋白表達量升高，Bax/Bcl-2比值降低［13］。所以細(xì)胞凋亡與乳腺癌耐藥形成過程關(guān)系密切。

而在本實驗研究中，我們證實了miR-16-5p在耐藥細(xì)胞中表達量降低，說明其可能參與乳腺癌耐藥誘導(dǎo)調(diào)控。為了能夠進一步了解miR-16-5p對乳腺癌耐藥細(xì)胞的影響，我們通過轉(zhuǎn)染miR-16-5p 的類似物，上調(diào)SKBR-3/PR細(xì)胞中miR-16-5p的表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-16-5p能夠?qū)KBR-3/PR細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞生長。CCK-8實驗與Transwell實驗還顯示miR-16-5p能夠有效的抑制耐藥細(xì)胞的增殖和遷移能力。不僅如此，miR-16-5p類似物能夠上調(diào)乳腺癌耐藥細(xì)胞凋亡蛋白Bax/Bcl-2的比值。通過流式細(xì)胞技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)在耐藥細(xì)胞過表達miR-16-5p后，細(xì)胞凋亡率顯著升高。所以，miR-16-5p能夠通過上調(diào)Bax/Bcl-2比值促進乳腺癌耐藥細(xì)胞凋亡。

為了能夠深入闡明miR-16-5p在乳腺癌耐藥細(xì)胞中的作用機制，本研究通過對4個miRNA數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)取交集，從中挑選出了106個潛在的miR-16-5p靶基因，并通過與受miR-16-5p調(diào)控的Bax與Bcl-2蛋白共同構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，我們發(fā)現(xiàn)YWHAQ可能是miR-16-5p的潛在靶基因。結(jié)合生物信息數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)YWHAQ在乳腺癌中高表達。結(jié)合雙熒光素酶實驗的結(jié)果，miR-16-5p類似物與YWHAQ野生型質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞時，熒光活性比值降低，而與YWHAQ突變型質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞時，熒光活性比值無明顯變化，證實在乳腺癌耐藥細(xì)胞中YWHAQ受到miR-16-5p的直接調(diào)控。miR-16-5p/YWHAQ調(diào)節(jié)軸在乳腺癌耐藥中有很大可能起著關(guān)鍵性作用。

YWHAQ屬于14-3-3家族，14-3-3蛋白幾乎能夠在所有真核細(xì)胞中被檢測到，由7 個不同的基因編碼（YWHAB，YWHAE，YWHAG，YWHAH，YWHAQ，YWHAZ 和SFN），參與生命中幾乎所有的生理過程，如調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、凋亡和細(xì)胞信號傳遞［24］。YWHAQ主要通過磷酸化依賴性相互作用與靶蛋白結(jié)合，在多種細(xì)胞生物學(xué)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。過表達YWHAQ能夠抑制由RFX5敲低誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞的凋亡［25］，還能夠抑制由他莫昔芬誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞生長停滯現(xiàn)象［26］。本研究通過對Kaplan Meier-plotter數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)進行分析發(fā)現(xiàn)，高表達的YWHAQ與乳腺癌患者的不良預(yù)后有著很大的相關(guān)性。此外，Hodgkinson 等［27］還提出YWHAQ具有作為乳腺癌新輔助化療耐藥預(yù)測生物標(biāo)志物的巨大潛能。通過本實驗研究，我們發(fā)現(xiàn)在乳腺癌耐藥細(xì)胞SKBR-3/PR中YWHAQ表達水平變高。為能夠更好的研究YWHAQ對乳腺癌耐藥細(xì)胞的影響，我們構(gòu)建了YWHAQ的干擾片段，從而達到降低SKBR-3/PR細(xì)胞內(nèi)YWHAQ表達水平的效果。實驗結(jié)果證明，在下調(diào)YWHAQ的水平后，耐藥細(xì)胞內(nèi)的Bax/Bcl-2比值隨之升高，細(xì)胞的遷移能力減弱，凋亡率隨之增加，說明YWHAQ在乳腺癌耐藥細(xì)胞內(nèi)擁有著十分關(guān)鍵的作用。在SKBR-3/PR細(xì)胞內(nèi)過表達miR-16-5p的同時，繼續(xù)干擾YWHAQ的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)耐藥細(xì)胞的遷移抑制率以及細(xì)胞凋亡率再一次升高，Bax/Bcl-2比值也隨之變得更大，結(jié)果進一步提示miR-16-5p是通過調(diào)節(jié)YWHAQ表達來改變Bcl-2和Bax蛋白水平，從而調(diào)控乳腺癌耐藥細(xì)胞的生物學(xué)活性。

綜上所述，本研究證實在乳腺癌耐藥誘導(dǎo)發(fā)展中，耐藥細(xì)胞中miR-16-5p 下調(diào)而YWHAQ 蛋白上調(diào)；miR-16-5p/YWHAQ調(diào)節(jié)軸能夠通過改變Bcl-2和Bax的表達以抑制乳腺癌耐藥細(xì)胞的增殖和遷移能力。因此，miR-16-5p/YWHAQ調(diào)節(jié)軸極有可能成為治療乳腺癌耐藥的突破點及耐藥評估的生物標(biāo)志物。