潘 根，姜 慧*，孫志廣

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 麻類研究所，湖南 長沙 410205；2.江蘇徐淮地區(qū)連云港農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 連云港 222006）

水稻（Oryza sativa）是重要的糧食作物之一，養(yǎng)活了世界上超過一半的人口［1］。干旱是影響水稻等農(nóng)作物生長和產(chǎn)量的主要非生物脅迫因素，嚴(yán)重威脅著糧食安全［2］。在干旱脅迫下，植株內(nèi)部結(jié)構(gòu)、生理指標(biāo)及轉(zhuǎn)錄水平改變，如氣孔閉合、根系形態(tài)結(jié)構(gòu)改變、滲透相關(guān)物質(zhì)積累及抗性基因表達(dá)量改變，這些是應(yīng)對(duì)干旱脅迫的重要策略之一，而植物激素在這個(gè)策略中發(fā)揮了重要作用［3］。

前人研究表明，脅迫相關(guān)激素如脫落酸（ABA）、乙烯（ETH）、茉莉酸（JA）等直接參與了植物的干旱脅迫反應(yīng)。過表達(dá)ABA途徑相關(guān)基因PYL10、SnRK2、OsABA8ox3通過激活A(yù)BA信號(hào)途徑及增加ABA含量來提高水稻植株的耐旱性［4-6］。過表達(dá)乙烯（ETH）響應(yīng)因子JERF1能夠增強(qiáng)水稻的耐旱性，主要通過增加脯氨酸含量、激活脅迫相關(guān)基因的表達(dá)以及降低水分流失［7］。外源噴施茉莉酸（JA）后能夠通過提高水稻SOD、POD等抗氧化酶的活性，從而提高植株的耐旱性，而過表達(dá)茉莉酸信號(hào)抑制子JAZ9能夠增加水稻對(duì)干旱的敏感性［8］。除了ABA、JA、ETH等脅迫相關(guān)激素外，生長素類激素如生長素（IAA）、細(xì)胞分裂素（CK）也被報(bào)道參與了水稻耐旱性的調(diào)控。過表達(dá)生長素信號(hào)相關(guān)基因，如OsPIN3t、OsIAA6等可以通過增加根系數(shù)目來增加水稻對(duì)干旱脅迫的耐性［9-10］。CK可以通過增加植株光合作用即碳同化能力來增強(qiáng)水稻的耐旱性［11］。此外，油菜素內(nèi)酯（BR）也被報(bào)道參與了植株的耐旱反應(yīng)［12］。在植株和小麥中，BR信號(hào)途徑相關(guān)基因BZR1正調(diào)控?cái)M南芥的耐旱性，主要是通過提高滲透來保護(hù)代謝物含量及促進(jìn)脅迫相關(guān)基因表達(dá)來提高植株的存活率［13-14］。與擬南芥、小麥研究結(jié)果相反，在番茄中，過表達(dá)BR受體基因BRI1降低了植株ABA的含量及SOD、POD酶活性，從而負(fù)調(diào)節(jié)植株的耐旱性［15］。但BR在水稻植株耐旱性方面的作用至今未有相關(guān)報(bào)道。為此，本研究通過對(duì)干旱脅迫下外源BL處理水稻植株進(jìn)行耐旱表型鑒定、生理生化指標(biāo)測定及脅迫相關(guān)基因表達(dá)量分析，初步闡明BR在水稻耐旱中的功能及其作用機(jī)理，研究結(jié)果對(duì)水稻抗旱栽培及耐旱新品種培育具有重要的理論和實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物 水稻品種9311來自連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院。

1.1.2 試劑 RNA提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司，表油菜素內(nèi)酯（BL）購自美國Sigma公司，Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒購自湖南艾科瑞生物有限公司，引物由湖南擎科生物科技有限公司合成。

1.2 水稻耐旱表型鑒定

水稻品種9311種子浸種催芽后，當(dāng)出芽長約0.5 cm時(shí)，選擇活力一致的種子播種于直徑為10 cm的黑色營養(yǎng)缽中，每天保持正常澆水，植株培養(yǎng)至3葉1心時(shí)待處理。在BL對(duì)水稻耐旱性影響的研究中，首先將BL溶解于無水乙醇中，并稀釋至BL濃度為1 μmol（乙醇濃度為0.1%）后，再用噴壺對(duì)植株葉片進(jìn)行外源噴施，噴至葉片有水滴落出后停止噴施。處理組為1 μmol BL，對(duì)照組為僅含0.1%乙醇水溶液，噴施1 d后進(jìn)行干旱脅迫處理，7 d后進(jìn)行植株存活率統(tǒng)計(jì)。每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.3 RNA提取及基因定量分析

分別將供試材料浸種催芽，當(dāng)種子出芽長約0.5 cm時(shí)，選擇活力一致的種子播種于直徑為10 cm的黑色營養(yǎng)缽中，每個(gè)營養(yǎng)缽播種25粒，每天保持正常澆水，待植株培養(yǎng)至3葉1心時(shí)停止?jié)菜謩e于停止?jié)菜畷r(shí)、停止?jié)菜蟮?、2及4天取植株根系組織冷凍后存儲(chǔ)于-80 ℃冰箱中待用。

用RNA提取試劑盒提取干旱處理植株根系組織總RNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性和純度，用Nano Drop 2000超微量分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific，USA）檢測其濃度和純度。

使用Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑預(yù)混液將總RNA反轉(zhuǎn)為cDNA。選用OsActin為內(nèi)參基因，在CFX96熒光定量PCR儀（Bio-Rad，USA）上以SYBR Green I為熒光染料，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。用于基因定量表達(dá)分析的引物如表1所示。

表1 qRT-PCR所用引物

1.4 脅迫相關(guān)生理指標(biāo)測定

分別提取干旱脅迫第2、第4天水稻品種9311的根系用于POD酶活性、SOD酶活性及MDA含量測定。POD、SOD酶活性及MDA含量測定具體方法參考南京建成生物有限公司生產(chǎn)的POD、SOD及MDA試劑盒說明書。葉片相對(duì)含水率測定步驟如下：首先剪取0.1 g水稻幼苗葉片，用錫箔紙包好后稱重記為鮮重FW，并將樣品置于烘箱100 ℃殺青1 h，然后80 ℃恒溫烘24 h后稱重，記為干重DW。每個(gè)處理3次重復(fù)。植物含水率公式為：

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖表繪制，利用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行干旱處理BR和ABA途徑相關(guān)基因表達(dá)量、外源BL處理與對(duì)照間存活率、鮮重及生理指標(biāo)的差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對(duì)BR途徑相關(guān)基因表達(dá)量的影響

為了探究BR在干旱脅迫響應(yīng)中的作用，對(duì)干旱脅迫處理下水稻品種9311根系組織中BR途徑相關(guān)基因進(jìn)行了表達(dá)量分析。OsBRD2、OsD2、OsD11為BR合成途徑相關(guān)基因，OsBRI1、OsBZR1為BR信號(hào)途徑相關(guān)基因。如圖1所示，干旱脅迫下，BR途徑相關(guān)基因表達(dá)量呈現(xiàn)出不同程度的下降趨勢，且在干旱脅迫處理第2、第4天，基因表達(dá)量顯著下降，特別在第4天的表達(dá)量最低，其表達(dá)量不到干旱脅迫處理前的一半。研究結(jié)果表明，干旱脅迫抑制了BR途徑相關(guān)基因的表達(dá)。

2.2 外源噴施BL對(duì)植株干旱脅迫的影響

鑒于BR途徑相關(guān)基因表達(dá)受到了干旱脅迫的抑制，為了進(jìn)一步探究BR在水稻干旱脅迫響應(yīng)中的作用，本文研究了外源BL噴施對(duì)水稻植株耐旱性的影響。如圖2所示，干旱脅迫第7天，外源噴施1 μmol BL處理植株存活率低于10%，而對(duì)照的存活率接近80%（圖2b）。研究還發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫7 d后，對(duì)照植株的鮮重顯著高于BL處理的（圖2c）。這些結(jié)果表明，外源噴施BL增加了植株對(duì)干旱脅迫的敏感性。

2.3 干旱脅迫下外源BL對(duì)植株SOD活性、POD活性、MDA含量及相對(duì)含水率的影響

為了探究BR負(fù)調(diào)控水稻耐旱性的生理機(jī)制，測定了干旱脅迫2和4 d后BL處理及其對(duì)照的植株脅迫相關(guān)生理指標(biāo)。如圖3所示，干旱脅迫處理2 d后，BL處理植株根系中POD活性顯著低于未處理植株的，其活性約為未處理植株的50%，而MDA含量顯著高于對(duì)照植株的；干旱脅迫處理4 d后，BL處理植株根系中POD活性、SOD活性及相對(duì)含水率均顯著低于對(duì)照植株，而MDA含量顯著高于對(duì)照，約為未處理植株的1.8倍。

2.4 干旱脅迫下BR對(duì)ABA途徑相關(guān)基因表達(dá)量的影響

據(jù)報(bào)道ABA能夠正向提高植物的耐旱性［4］。為了探究BR負(fù)調(diào)節(jié)水稻耐旱性的作用機(jī)制，對(duì)外源BL處理植株進(jìn)行了ABA途徑相關(guān)基因表達(dá)量的測定。由圖4可知，干旱脅迫處理4 d后，BL處理植株根系中OsNCED5、OsABI5、OsABI3及OsbZIP23基因表達(dá)量均顯著低于對(duì)照植株，其中OsABI5、OsABI3及OsbZIP23的表達(dá)量約為對(duì)照植株的1/3。研究結(jié)果表明，BR負(fù)調(diào)控水稻的耐旱性可能與ABA途徑相關(guān)基因下調(diào)表達(dá)量有關(guān)。

3 討論

BR是一類生長素類激素，被廣泛報(bào)道參與了植物的生長和發(fā)育的調(diào)控［16］。前人研究也表明，BR參與了植物耐旱性的調(diào)控。外源噴施BL能夠提高擬南芥、番茄的耐旱性，過表達(dá)BR信號(hào)基因BZR也能夠提高小麥、擬南芥的耐旱性，這些研究表明BR能夠正向調(diào)控植物的耐旱性［13-14，17-18］。與之相反，在干旱脅迫下，BR合成及信號(hào)關(guān)鍵基因突變后，其植株存活率提高，暗示了BR能負(fù)調(diào)控植物的耐旱性［19-21］。本研究中，干旱脅迫抑制了BR途徑相關(guān)基因的表達(dá)，外源BL處理后增加了水稻植株對(duì)干旱的敏感性，表明BR能負(fù)調(diào)控水稻植株耐旱性，這與Northey等［22］的研究結(jié)果類似。

干旱脅迫能導(dǎo)致活性氧積累，使植物體內(nèi)發(fā)生氧化脅迫，從而增加了膜脂過氧化物MDA的含量。作為植物耐旱的主要策略之一，植株通過SOD酶和POD酶清除植株體內(nèi)多余的活性氧，從而減輕對(duì)植株的損傷［23］。番茄過表達(dá)BR受體基因BRI1后，植株SOD和POD酶活性下降，MDA含量上升，從而提高了植株對(duì)干旱的敏感性［15］。本研究也發(fā)現(xiàn)，BL處理植株中SOD和POD酶活性低于對(duì)照植株的，表明外源BL處理減弱了植株的抗氧化能力，同時(shí)MDA含量的上升也表明其植株受到比對(duì)照更嚴(yán)重的氧化損傷。

Nolan等［12］研究表明，BR主要通過與ABA相互作用來調(diào)控植物的耐旱性。本研究發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下，ABA途徑相關(guān)基因在BL處理植株中的表達(dá)量均低于對(duì)照植株，通過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，BR對(duì)OsABI3和OsABI5的表達(dá)量影響最為顯著（圖4）。研究結(jié)果表明，OsABI3和OsABI5可能對(duì)BR負(fù)調(diào)節(jié)水稻耐旱性起到了關(guān)鍵作用。Liu等［24］研究表明，BR可以通過轉(zhuǎn)錄因子BZR直接結(jié)合OsABI5的啟動(dòng)子區(qū)域來抑制基因的表達(dá)量，從而負(fù)調(diào)控植物的耐旱性，在水稻中BR是否通過這條路徑來負(fù)調(diào)節(jié)水稻耐旱性還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

在干旱脅迫下，BR信號(hào)途徑相關(guān)基因的表達(dá)量受到抑制，外源BL處理降低了根系中SOD和POD酶活性，抑制了ABA途徑相關(guān)基因的表達(dá)量，導(dǎo)致根系中MDA含量的升高，葉片相對(duì)含水量降低，從而增加了植株對(duì)干旱脅迫的敏感性。本研究初步明確了BR在水稻耐旱性中的功能及作用機(jī)制，為水稻的抗旱栽培及育種研究奠定了理論基礎(chǔ)。