張 榮，凌曉寧，邱 露，李昆太，2*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學 生物科學與工程學院/江西省農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)與利用工程實驗室，江西 南昌 330045；2.廣東海洋大學 食品科技學院，廣東 湛江 524088）

【研究意義】近年來，我國漁業(yè)迅速發(fā)展，魚類加工過程所產(chǎn)生的魚骨、魚皮、魚鱗等副產(chǎn)物也隨之逐年增加。然而這些魚加工副產(chǎn)物的綜合利用水平還較低，除一小部分用于生產(chǎn)魚粉、肥料和魚油，或直接用作水產(chǎn)養(yǎng)殖飼養(yǎng)的原料外，大部分作為廢棄物被丟棄，造成嚴重的資源浪費與環(huán)境污染[1-2]。研究表明，魚骨、魚皮、魚鱗等副產(chǎn)物是一種較為優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源，富含膠原蛋白，具備開發(fā)活性膠原多肽的應用價值，同時也是魚類副產(chǎn)物高值化利用領域的研究熱點之一[3]。【前人研究進展】膠原蛋白分子結(jié)構(gòu)是由3 條多肽鏈相互纏繞形成的三螺旋結(jié)構(gòu)體，普通蛋白酶難以降解，只能被特定的膠原蛋白酶水解[4-5]。膠原蛋白可通過酸堿等方式水解，但該方式存在一定的環(huán)境污染和食品安全隱患，而膠原蛋白酶降解法更為人們所認可和接受。另外，膠原蛋白酶在適宜條件下可以特異性的水解天然膠原蛋白，而不損傷其他蛋白質(zhì)和組織的酶類[6]。在微生物所產(chǎn)膠原蛋白酶作用下，膠原蛋白可轉(zhuǎn)化為小分子生物活性膠原多肽[7]，具有相對分子質(zhì)量小、易吸收、抗氧化、降血壓、增強免疫力等諸多生理功能活性[8-9]。膠原蛋白活性多肽現(xiàn)已廣泛應用于食品工業(yè)、醫(yī)藥和化妝品等領域[10-12]?！颈狙芯壳腥朦c】目前，報道的產(chǎn)膠原蛋白酶微生物菌株有梭菌[13]、短小芽孢桿菌[14]、蠟樣芽孢桿菌[15]、枯草芽孢桿菌[16]、白色念珠菌[17]、放線菌[18]等。微生物可以將膠原蛋白酶分泌到胞外，利于通過發(fā)酵方式規(guī)模化生產(chǎn)[19]。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶水平不僅取決于生產(chǎn)菌種自身特性，而且與發(fā)酵條件密切相關(guān)。其中，培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)時間、pH、溫度、接種量等多個因素都會對微生物產(chǎn)酶過程產(chǎn)生重要影響。因此，分離篩選新的膠原蛋白酶產(chǎn)生菌并開展其發(fā)酵工藝研究，對于實現(xiàn)魚骨、魚皮、魚鱗等副產(chǎn)物的高值化利用具有重要研究價值?！緮M解決的問題】本研究采用課題組前期篩選培育的一株能夠產(chǎn)膠原蛋白酶的Bacillussp.JY-23，通過單因素試驗、Plackett-Burman（PB）設計和響應面法對其產(chǎn)酶發(fā)酵條件和培養(yǎng)基組分進行優(yōu)化，以提高菌株產(chǎn)膠原蛋白酶的能力，為魚類加工副產(chǎn)物高值化開發(fā)生物活性膠原多肽提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗菌株芽孢桿菌JY-23（Bacillussp.JY-23）系本課題組自行分離鑒定，現(xiàn)保存于江西省農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)與利用工程實驗室。

1.1.2 培養(yǎng)基LB 液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、NaCl 10 g/L，pH 7.0，121°C 滅菌20 min?；A發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、CaCl20.05 g/L、K2HPO43H2O 2.50 g/L、NaH2PO42H2O 0.50 g/L、自然pH（pH為6.0左右），121°C滅菌20 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 搖瓶發(fā)酵方法Bacillussp.JY-23 新鮮斜面以10 mL 無菌水刮下菌體，充分搖勻制備菌懸液。吸取1 mL 菌懸液接種于裝量為50 mL/250 mL 三角瓶的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、160 r/min 搖床（全溫振蕩培養(yǎng)箱，DJS-2016R，上海世平實驗設備有限公司）震蕩培養(yǎng)12 h 作為種子液。將培養(yǎng)好的種子液接種于基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖瓶震蕩培養(yǎng)，取樣測定發(fā)酵液的膠原蛋白酶活力。

1.2.2 發(fā)酵工藝的單因素優(yōu)化以膠原蛋白酶活力為指標，采用單因素試驗分別考察培養(yǎng)時間、溫度、初始pH、接種量、裝液量及外加碳氮源和金屬離子等因素對Bacillussp.JY-23發(fā)酵產(chǎn)膠原蛋白酶的影響。

1.2.3 發(fā)酵工藝的PB實驗設計利用Design-expert軟件設計PB試驗。在單因素試驗基礎上，選取4個發(fā)酵培養(yǎng)基組分（葡萄糖、酵母浸粉、氯化鈉、Fe2+），以及4個發(fā)酵條件（培養(yǎng)時間、接種量、裝液量、溫度）共8個因素作為考察對象。其中，為計算試驗誤差，實際3個虛擬因素，試驗次數(shù)N=12，各因素高低水平分別用1和-1表示，具體因素水平見表1 所示。

表1 PB試驗設計Tab.1 PB expe rimental design

1.2.4 發(fā)酵工藝的響應面中心組合試驗優(yōu)化根據(jù)PB 試驗結(jié)果篩選出對膠原蛋白酶酶活影響顯著的因子，以酶活為響應值，利用中心組合實驗（central composite design，CCD）進行4 因素5 水平共30 組試驗，優(yōu)化獲得Bacillussp.JY-23發(fā)酵產(chǎn)膠原蛋白酶的最佳組合。具體的因素及其水平設置見表2。

表2 中心組合試驗設計Tab.2 Experimental design of central combination

1.2.5 膠原蛋白酶酶活測定方法將培養(yǎng)好的種子液接種于基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃，160 r/min，震蕩培養(yǎng)48 h，發(fā)酵液8 000 r/min，離心20 min，收集上清液，即獲得膠原蛋白粗酶液。膠原蛋白酶酶活采用茚三酮顯色法進行測定[20]。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析使用Excel 2019進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，使用Design-expert 8.0軟件對PB試驗和中心組合試驗進行方差分析，使用Origin 2018對數(shù)據(jù)進行作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)條件的確定

分別考察了培養(yǎng)時間、溫度、培養(yǎng)基初始pH 值、接種量和裝液量等培養(yǎng)條件對Bacillussp.JY-23 發(fā)酵產(chǎn)膠原蛋白酶活的影響（圖1）。

圖1 不同培養(yǎng)條件下Bacillus sp.JY-23所產(chǎn)膠原蛋白酶的相對酶活變化Fig.1 Changes of relative enzyme activity of collagen proteinase produced by Bacillus sp.JY-23 under different culture conditions

由圖1（a）可知，膠原蛋白酶活力隨著發(fā)酵時間的延長先升高后降低，在第36 h時達到最高。36 h后酶活開始下降可能是由于發(fā)酵培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)消耗過多，導致有害代謝物積累所致[21]。因此，Bacillussp.JY-23搖瓶發(fā)酵產(chǎn)膠原蛋白酶的最佳發(fā)酵時間為36 h。

對于微生物來說，溫度是影響菌體生長及其產(chǎn)酶的一個重要因素。由圖1（b）可知，隨著發(fā)酵溫度的上升，膠原蛋白酶的酶活力先升高后降低，在37 ℃時相對酶活達到最大值。因此，Bacillussp.JY-23搖瓶發(fā)酵產(chǎn)膠原蛋白酶的最適溫度為37 ℃。

由圖1（c）可知，隨著發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值的不斷增加，膠原蛋白酶活力先升高后降低。在初始pH值為8.0時，膠原蛋白酶相對酶活達到最大值，因此確定Bacillussp.JY-23發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳初始pH為8.0。

由圖1（d）可知，隨著接種量的增加，膠原蛋白酶活力先升高后降低。當接種量為4%時，膠原蛋白酶活力最大。一般而言，接種量偏小會導致菌體延滯期拉長，進而影響菌體正常代謝[22-23]；當菌種接種量過高時，菌體生長過快，培養(yǎng)基營養(yǎng)成分更多用于菌體生長[24]，反而不利于膠原蛋白酶的產(chǎn)生。因此，Bacillussp.JY-23 搖瓶發(fā)酵產(chǎn)膠原蛋白酶的最佳接種量為4%。

由圖1（e）可知，隨著裝液量的增加，膠原蛋白酶活力先升高后降低。當裝液量較少時，發(fā)酵液中溶氧量較大，致使營養(yǎng)物質(zhì)消耗過快，反而不利于產(chǎn)生膠原蛋白酶；隨著裝液量的增加，發(fā)酵液中溶氧量過低，限制菌體正常生長，進而影響到菌體產(chǎn)酶。因此，Bacillussp.JY-23搖瓶發(fā)酵產(chǎn)膠原蛋白酶的最適裝液量為50 mL。

2.2 培養(yǎng)基組分的確定

分別考察了不同氮源種類對Bacillussp.JY-23 產(chǎn)酶的影響，圖2（a）表明該菌株可以利用多種氮源，其中最佳氮源為酵母浸粉。隨后對酵母浸粉濃度做進一步的優(yōu)化，圖2（b）顯示25 g/L 酵母浸粉添加量下的膠原蛋白酶相對酶活達到最大。

圖2 發(fā)酵培養(yǎng)基組分單因素篩選結(jié)果Fig.2 Single factors screening of the components in fermentation medium

碳源是微生物產(chǎn)酶必需的營養(yǎng)成分，能夠為菌體的生長及產(chǎn)物合成提供必要的能量和物質(zhì)基礎。在初始培養(yǎng)基中，分別加入10 g/L 的不同碳源，由圖2（c）可知，當葡萄糖作為碳源時，相對酶活達到最高。接著對葡萄糖的濃度做進一步優(yōu)化，由圖2（d）可知，葡萄糖的最佳濃度為15 g/L。

在初始培養(yǎng)基中，分別加入不同種類的金屬離子。由圖2（e）可知，Al3+、Mg2+、Mn2+、Fe2+對產(chǎn)酶均有促進作用，其中Fe2+的促進作用最為顯著，其相對酶活達到最高。接下來對Fe2+濃度進行優(yōu)化，由圖2（f）可知，隨著Fe2+濃度的增加，膠原蛋白酶活呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，F(xiàn)e2+的最適濃度為0.5 mmol/L。由圖2（g）可知，NaCl 濃度對菌體產(chǎn)酶也有顯著影響，當NaCl 濃度為10 g/L 時，相對酶活達到最大值，因此確定NaCl濃度為10 g/L。

2.3 PB試驗分析

PB試驗設計與結(jié)果見表3，利用Design-expert 8.0軟件對結(jié)果進行方差分析，結(jié)果見表4。模型的P值在95%的置信區(qū)間內(nèi)小于0.05，其決定系數(shù)R2=0.991 6，校正系數(shù)為0.954 3，證明此模型合理。由表4 可知，酵母浸粉、葡萄糖、接種量、Fe2+的P值小于0.05，差異顯著，因此選擇酵母浸粉、葡萄糖、接種量、Fe2+作為顯著因素進行后續(xù)優(yōu)化。

表3 PB試驗設計與結(jié)果Tab.3 PB design and results

表4 PB試驗方差分析Tab.4 Analysis of variance for the PB design

2.4 響應面中心組合試驗分析

經(jīng)PB試驗篩選的酵母浸粉（X1）、葡萄糖（X2）、接種量（X3）、Fe2+（X4）進行了四因素五水平共30組的中心組合試驗，具體實驗設計與結(jié)果如圖表5所示。

表5 CCD法實驗設計及對應的響應值Tab.5 CCD design variable/leves with butanol production as response

以膠原蛋白酶的酶活為響應值，對中心組合試驗結(jié)果進行多元回歸擬合，得到膠原蛋白酶的二次回歸模型方程為：Y=+20.80+3.39X1+1.88X2-0.15X3+0.55X4+2.59X1X2+0.041X1X3+0.020X1X4-0.61X2X3+0.016X2X4-0.75X3X4-0.20X12-0.50X22-0.47X32-0.89X42。回歸模型方差分析和系數(shù)顯著性結(jié)果如表6 所示。

由表6 可知，該模型P值小于0.01，極顯著，由此可見該模型對膠原蛋白酶具有較好的預測；并且失擬項p值為0.283 4，不顯著，說明方差擬合良好，可以用此數(shù)學模型推測試驗的結(jié)果。根據(jù)F值大小，影響膠原蛋白酶的因素由大到小依次為酵母浸粉（X1）、葡萄糖（X2）、Fe2+（X4）、接種量（X3）。

表6 CCD試驗方差分析Tab.6 Analysis of variance for the CCD

2.5 最佳產(chǎn)酶條件的確定及驗證試驗

從圖3 可知，膠原酶活力響應值存在最大值，由回歸方程求得的酶活力達到最大值時的最優(yōu)組合為：葡萄糖19.60 g/L、酵母浸粉25.80 g/L、接種量2.97%、Fe2+0.75 mmol/L，此時預測的最大酶活力為27.84 U/mL。為檢驗試驗結(jié)果的可靠性，采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基進行3 次驗證試驗。膠原蛋白酶活平均值為（28.13±0.66）U/mL，非常接近模型的預測值，表明試驗得到的模型可以用于預測實際值，而且與優(yōu)化前的酶活（5.94±0.22）U/mL 相比提高了4.73倍。

圖3 不同因素之間對膠原蛋白酶活性影響的響應圖Fig.3 Curves of response between different factors affecting collagenase activity

3 結(jié)論和討論

優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組分以及發(fā)酵條件，是提高微生物產(chǎn)酶能力的有效手段。李文靜等[25]篩選到一株耐鹽的蛋白酶產(chǎn)生菌Bacillus subtilis，經(jīng)響應面優(yōu)化其發(fā)酵條件，蛋白酶活力比優(yōu)化前提高了6.15 倍；Yang 等[26]采用PB 設計和響應面法對膠原蛋白酶產(chǎn)生菌Pseudoalteromonassp.SJN2 的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，使得膠原蛋白酶產(chǎn)量增加了2.2倍。

本研究通過對Bacillussp.JY-23產(chǎn)膠原蛋白酶的發(fā)酵培養(yǎng)基進行單因素篩選，得出葡萄糖為最適碳源，與李茂琳[27]在研究側(cè)孢短芽孢桿菌AL-13產(chǎn)膠原蛋白酶的最適碳源一致；篩選出最適氮源為酵母浸粉，與宋立立等[28]對枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的最適氮源一致。而李星碩等[29]等在利用胰蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、明膠這4種氮源分別誘導Bacillus cereus產(chǎn)酶時，發(fā)現(xiàn)以胰蛋白胨作誘導時的膠原蛋白酶活性高于其它條件，推測可能不同的菌株有各自最適的誘導條件。筆者進一步通過PB試驗和響應面設計等方法優(yōu)化Bacillussp.JY-23 產(chǎn)膠原蛋白酶的發(fā)酵工藝，所得最適條件為葡萄糖19.60 g/L、酵母浸粉25.80 g/L、接種量2.97%、Fe2+0.75 mmol/L。在此優(yōu)化條件下，Bacillussp.JY-23 膠原蛋白酶的酶活達到28.13 U/mL，較未優(yōu)化前提高了4.95倍，而且顯著高于Bhagwat等[30]篩選出的Pseudomonassp.SUK膠原蛋白酶酶活（13.81 U/mL）。

本研究采用單因素、PB設計、響應面設計對Bacillussp.JY-23產(chǎn)膠原蛋白酶的發(fā)酵培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件逐級優(yōu)化，大幅提高了產(chǎn)酶水平，研究結(jié)果可為該菌株工業(yè)化發(fā)酵產(chǎn)膠原蛋白酶提供基礎和參考。

致謝：江西省研究生創(chuàng)新專項資金資助項目（YC2020-S234），廣東省普通高校重點領域?qū)ｍ棧ň幪?021ZDZX4010）同時對本研究給予了資助，江西農(nóng)業(yè)大學生物科學與工程學院彭帥英老師對研究給予了幫助，謹致謝意!