蔡 朔，韓疏影，夏浩然，閆郅燁，黃瀟正，趙 明，段金廒*，劉 睿, 3*

·綜 述·

基于特征肽發(fā)現(xiàn)與應用的膠類中藥質量控制

蔡 朔1, 2，韓疏影2，夏浩然2，閆郅燁2，黃瀟正2，趙 明1, 2，段金廒1, 2*，劉 睿1, 2, 3*

1. 南京中醫(yī)藥大學 江蘇省中藥資源產業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，中藥資源產業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心，江蘇 南京 210023 2. 南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇 南京 210023 3. 江蘇省海洋藥用生物資源研究與開發(fā)重點實驗室，江蘇 南京 210023

膠類中藥源于動物的皮、角、甲等組織部位，經(jīng)提取、濃縮、干燥而形成固體膠塊，是極具特色的傳統(tǒng)中藥。近年來，膠類中藥以其獨特的滋補功效愈發(fā)受到消費者青睞，市場需求不斷擴大。然而，膠類中藥原料短缺、有效質量控制方法缺乏，導致偽劣膠類中藥及其產品大行其道，嚴重影響行業(yè)聲譽，危害人民健康安全?；诖?，中藥行業(yè)的學者們圍繞膠類中藥的質量控制研究不斷創(chuàng)新突破，建立了多種高效、靈敏的膠類中藥質量檢測方法，以確保膠類中藥的質量，促進行業(yè)健康發(fā)展。從膠類中藥物質組成、質控方法、基于特征肽發(fā)現(xiàn)與應用的膠類中藥質控方法等方面系統(tǒng)闡述了膠類中藥的質控研究現(xiàn)狀，為進一步構建和完善科學合理的質控體系提供參考，以期推動膠類中藥及行業(yè)健康發(fā)展。

膠類中藥；特征肽；發(fā)現(xiàn)；應用；質量控制；生物標志物

膠類中藥是由動物的皮、骨、角、甲等部位經(jīng)煎煮、濃縮等工藝制成的固體膠塊，具有悠久的應用歷史和鮮明的民族特色。目前，主要的膠類中藥包括《中國藥典》2020年版收載的阿膠、鹿角膠和龜甲膠3種[1]，以及市場上常見的黃明膠、新阿膠、鱉甲膠、鹿皮膠等；此外，以膠類中藥為原料的衍生產品，如復方阿膠漿、阿膠補血膏、烏雞白鳳丸、龜鹿補腎丸、阿膠糕、鹿膠糕等得到廣泛應用。

隨著生活水平提高及大健康理念的普及與推廣，人們對于養(yǎng)生補益類中藥的需求增加，其中膠類中藥以其獨特的滋補功效備受消費者青睞，在中醫(yī)臨床和養(yǎng)生保健方面應用廣泛。然而，需求的不斷增加導致市場上膠類中藥質量參差不齊，摻雜摻假的膠類中藥嚴重擾亂市場良性競爭、危害行業(yè)健康發(fā)展。因此，實現(xiàn)膠類中藥的準確鑒別、進一步完善膠類中藥的質控方法，是亟待解決的問題之一。中藥行業(yè)的學者們圍繞膠類中藥的質量控制研究不斷創(chuàng)新突破，建立了多種高效、靈敏的膠類中藥質量檢測方法。本文從膠類中藥物質組成、基于特征肽發(fā)現(xiàn)與應用的膠類中藥質控方法等方面系統(tǒng)闡述了膠類中藥的質控研究現(xiàn)狀，以期為膠類中藥質控方法提升與行業(yè)健康發(fā)展提供新的思路和策略。

1 膠類中藥的物質組成

膠類中藥含有豐富的蛋白質、肽類、氨基酸、微量元素等，其中蛋白質類成分以膠原蛋白為主。膠原蛋白作為機體的重要功能性物質，遍布于動物組織器官中，是體內相對含量最高、分布最廣的蛋白質。根據(jù)每條肽鏈上的氨基酸序列及交聯(lián)方式，可分為28種不同類型的膠原[2]。膠原的一級結構為多肽鏈的氨基酸序列，遵循甘氨酸（glycine，Gly）-X-Y的排列規(guī)則，其中X、Y常代表脯氨酸（proline，Pro）或羥脯氨酸（hydroxyproline，Hyp），穩(wěn)定的Gly-X-Y重復序列使不同物種的膠原表現(xiàn)出高度的保守特性[3-4]；二級結構代表單條α螺旋的多肽鏈在空間上呈左手螺旋；3條呈左手α螺旋結構的多肽鏈相互纏繞形成右手復合螺旋結構，構成膠原的三級結構，稱為原膠原或膠原分子；膠原分子首尾相接，錯位1/4，按規(guī)則平行排列成束，通過共價鍵搭接交聯(lián)，形成膠原微纖維，并進一步聚集成束形成膠原纖維四級結構[5-6]，見圖1。

常見膠類中藥的膠原蛋白成分主要源于Ⅰ型膠原、II型膠原及III型膠原[7-8]，I型膠原主要存在于骨、真皮、肌腱、韌帶等多種組織中，是動物中含量最豐富且研究最為廣泛的膠原蛋白；II型膠原主要存在于軟骨、玻璃體及髓核中；III型膠原則主要存在于皮膚、血管壁和網(wǎng)狀纖維組織中[9]。以動物皮、角、骨、甲等為原料的膠類中藥在制備過程中，膠原蛋白發(fā)生非特異性降解，形成一系列復雜的膠原降解產物，加之膠類中藥生產過程中添加的輔料，使膠類中藥物質組成異常復雜。

圖1 各級膠原的結構特點

Fig. 1 Structural characteristics of collagen at different levels

進一步研究發(fā)現(xiàn)，羥基化、脫酰胺化等翻譯后修飾（post-translational modifications，PTMs）[10]存在于膠原蛋白或發(fā)生于膠類中藥加工過程中。Pro與賴氨酸（lysine，Lys）經(jīng)羥基化后轉變?yōu)镠yp與羥賴氨酸（hydroxylysine，Hyl）；天門冬酰胺（asparagine，Asn）與谷氨酰胺（glutamine，Gln）脫乙酰化后則轉變?yōu)樘於彼幔╝spartate，Asp）與谷氨酸（glutamic acid，Glu）；此外，Hyl還會進一步發(fā)生糖基化修飾，形成半乳糖基化或葡萄糖-半乳糖基化結構[8]，而這些不同修飾情況對膠原蛋白的理化性質及結構穩(wěn)定性均具有影響。研究表明，Hyp、Hyl的形成有利于維持膠原蛋白的螺旋結構[11]，糖基化的Hyl則與I型膠原纖維分子間共價交聯(lián)密切相關[12]，故羥基化修飾、糖基化修飾與膠原蛋白的結構成型及穩(wěn)定性之間關聯(lián)較大。本課題組前期研究對比生鹿皮與經(jīng)熬制提取的鹿皮膠中蛋白修飾位點的類型及數(shù)量，發(fā)現(xiàn)鹿皮經(jīng)過加工提取制成鹿皮膠后，羥基化與脫酰胺修飾位點數(shù)量明顯增加，這2種修飾均可形成羥基基團，一定程度上可改善膠原成分的水溶性[13]。研究表明，Hyp的含量與膠原蛋白的熱穩(wěn)定性呈正相關[14]，且含有羥基化位點的多肽已被證實存在多種生物活性[15-16]。因此，進一步探明膠原蛋白的“修飾信息”對深入研究其結構特點及性質功能具有重要意義。

2 膠類中藥的質控方法

膠類中藥通常為經(jīng)過多道工序加工制成的塊狀固體，在外觀、顏色、氣味等方面沒有明顯差異，為建立科學合理的膠類中藥質量評價方法，很多研究從膠類的組成成分、理化性質出發(fā)，采用多種方法進行檢測分析，主要有凝膠電泳法、紅外光譜法、元素分析法、氨基酸指紋圖譜法、DNA分子標記法。

2.1 凝膠電泳法

李鋒等[17]對7種常見膠類中藥及雜皮膠進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒別，發(fā)現(xiàn)不同來源膠類中藥的電泳圖譜差異明顯，且偽品膠與正品膠的譜帶數(shù)目及泳動率均存在較大差異；古今等[18]使用十二烷基硫酸鈉-不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳法對不同廠家的阿膠、鹿角膠及龜板膠進行鑒別，結果發(fā)現(xiàn)3種膠的電泳圖譜具有各自的特征鑒別帶，所以凝膠電泳法對鑒別膠類中藥具有一定的應用價值。

2.2 紅外光譜法

許長華等[19]采用傅里葉變換紅外光譜法（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）和二維紅外光譜技術（two-dimensional infrared vibrational echo spectroscopy，2D-IR）對阿膠、黃明膠及偽品阿膠進行對比鑒別，結果表明FT-IR光譜圖無法區(qū)分，而2D-IR可依據(jù)蛋白質成分及含量差異直觀反映出三者紅外光譜圖的區(qū)別，從而加以鑒別區(qū)分；Li等[20]采用近紅外光譜指紋圖譜技術和化學計量學方法，建立了東阿阿膠相似度匹配模型，可特異性識別東阿阿膠，說明紅外光譜法在膠類中藥的真?zhèn)舞b別與品牌維護上具有良好的應用價值。

2.3 元素分析法

黃必勝[21]使用原子吸收分光光度法測定了阿膠、鹿角膠、龜膠中鋅、銅、鐵、錳4種微量元素的含量，并認為這些微量元素含量差異與不同膠類中藥性味歸經(jīng)、滋補功效存在內在聯(lián)系；王文靜等[22]采用X射線熒光光譜法測定了不同產地阿膠樣品中元素種類及含量，并繪制元素特征譜，通過與阿膠對照品元素特征譜的對比分析，認為可以簡便快速地鑒別阿膠真?zhèn)巍?/p>

2.4 氨基酸指紋圖譜法

李婉斯等[23]采用柱前衍生化法檢測了10批阿膠中的氨基酸成分，并對阿膠中17種氨基酸成分進行了相似度分析及聚類分析，建立了具有一定專屬性的阿膠指紋圖譜；周芳妍等[24]測定了鹿角膠中18種氨基酸，建立了鹿角膠的氨基酸成分指紋圖譜，為鹿角膠的質控提供了一種參考方法。

2.5 DNA分子標記法

近年來，DNA技術已廣泛應用于膠類中藥的原料鑒別[25-26]，但在膠類中藥制品的鑒別中無法成為普適性方法，其原因在于成品膠塊經(jīng)過加工提取后，物種特定DNA片段存量低，聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增后容易產生假陽性或假陰性檢測結果[27-28]。Zhang等[29]采用TaqMan探針方法將特異性探針引入實時定量PCR，分析阿膠中驢源DNA特性并尋找潛在摻假物如馬、牛、豬源DNA，證明此改進方法可用于鑒定阿膠中驢源DNA的純度以及摻假情況。

2.6 基于特征肽發(fā)現(xiàn)與應用的質控方法

《中國藥典》2020年版中阿膠、鹿角膠及龜甲膠鑒別項下采用了液相色譜串聯(lián)三重四級桿質譜法，在多重反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式下，對特征離子進行檢測以鑒別樣品真?zhèn)?。基于?質聯(lián)用技術（liquid chromatograph-mass spectrometry，LC-MS）檢測物種特征肽的方法，憑借高專屬性優(yōu)勢，成為近年來膠類中藥鑒別的研究熱點[30-32]。Cheng等[33-34]結合多元統(tǒng)計學分析方法，尋找鹿角膠、龜甲膠、阿膠、牛皮膠及豬皮膠的特征離子及其對應的特征肽段，驗證了特征肽段的物種專屬性并形成了相關質量檢測標準；Li等[35]基于生物信息學方法比較了驢、馬、牛、豬的膠原蛋白序列中的潛在物種差異肽段，并通過實驗確定了4種動物的特征肽，可用于阿膠的真?zhèn)舞b別及馬、牛、豬雜皮源的檢測。

凝膠電泳法、紅外光譜法等集中于分析膠類中藥主要成分（膠原蛋白等）的理化性質差異，但由于動物膠原蛋白的高度同源性，極大地限制了此類鑒別方法的準確性與普適性。元素、氨基酸分析法等以組成成分的種類及含量差異建立指紋圖片以圖鑒別真?zhèn)?，但膠類中藥與其偽劣膠產品之間成分組成相似，以元素、氨基酸等非專屬性成分為檢測指標均難以準確鑒別真?zhèn)??；谔卣麟陌l(fā)現(xiàn)的分析策略已逐漸成為目前膠類中藥鑒別的主流方法，其檢測原理是基于不同物種間的同源肽段氨基酸序列之間的差異，此差異在LC-MS中表現(xiàn)為同源肽段母離子與子離子在質荷比上的不同，通過檢測這些肽段的MRM信息，可實現(xiàn)不同來源膠類中藥的鑒別?；谔卣麟陌l(fā)現(xiàn)的分析策略應用于膠類中藥的質控，具有較高專屬性及較好普適性，其主要研究思路與方法包括特征肽的發(fā)現(xiàn)和在質量控制中的應用等方面。

2.6.1 特征肽發(fā)現(xiàn)的方法與策略

（1）基于化學物質組與多元統(tǒng)計學結合分析發(fā)現(xiàn)特征肽（圖2-A）：Cheng等[33]采用超高效液相色譜-高分辨飛行時間質譜（ultra performance liquid chromatography-quadrupole time of flight-mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS）得到了鹿角膠、龜甲膠、阿膠、牛皮膠及豬皮膠的胰酶酶解物總離子流圖，使用多元數(shù)學統(tǒng)計方法對5種膠原肽圖進行了主成分分析（primary component analysis，PCA），結合正交偏最小二乘法比較出各個物種的差異性特征離子，并通過Mascot網(wǎng)絡檢索這些物種的特征離子進而歸屬肽段，分別得到1個鹿源、3個龜源、4個驢源、4個牛源及3個豬源特征肽序列，進一步通過合成特征肽驗證了其專屬性。此方法基于酶解物中大量特征離子的數(shù)據(jù)信息，采用多元統(tǒng)計的分析方法，從大量數(shù)據(jù)中提取出關鍵離子信息以發(fā)現(xiàn)特征肽，因此要求有足夠的樣本量以保證特征肽離子的準確性；同時，部分特征離子由于序列尚未被數(shù)據(jù)庫收載，特征肽序列信息的準確性有待確證，一定程度上限制了這些特征離子在膠類中藥專屬性鑒別方面的應用[34]。

（2）基于生物信息學比較分析發(fā)現(xiàn)特征肽（圖2-B）：Li等[35]基于生物信息學分析了阿膠的潛在特征肽，并進行了實驗篩選驗證。首先通過鳥槍法蛋白質鑒定分析驢、馬、牛、豬皮中主要膠原蛋白類型，基于蛋白質數(shù)據(jù)庫獲取各物種相應類型膠原蛋白的序列信息后，使用BioEdit序列比對編輯器軟件尋找不同動物序列中的差異氨基酸位點，并以含差異位點的胰蛋白酶酶切肽段為潛在的目標特征肽，通過LC-MS/MS對這些潛在特征肽進行檢測，以序列長短、檢測專屬性為標準篩選，最終獲得了具有良好專屬性的6條不同物種的特征肽。王芳等[36]基于生物信息學分析結合UPLC-QTOF-MS檢測到與預測結果匹配的1條驢皮特征肽，可用于阿膠與豬皮、牛皮膠的鑒別區(qū)分。生物信息學分析比較是基于已知的物種蛋白質序列發(fā)現(xiàn)特征肽的方法，可行性與準確度較高，但是基于已知序列的分析并未包含特征肽的PTM信息，因而仍可能缺失部分特征肽信息。此外，生物信息分析獲得的理論存在的特征肽，可能由于樣品前處理、肽段穩(wěn)定性、離子化效率等方面影響，并不能在樣品中檢出，從而限制了此方法的實際應用。

（3）基于多肽組與數(shù)學集合比較分析發(fā)現(xiàn)特征肽：Liu等[37]采用數(shù)學集合理論解釋了不同物種與目標物種酶解多肽之間的關系，建立了一種新的特征肽發(fā)現(xiàn)策略（圖2-C）：基于非靶向質譜方法分析目標動物膠與其他偽品膠的酶解肽圖譜，取不同批次目標樣品肽段的交集設為集合I，取其他各偽品、各批次樣品中肽段的并集為集合II。集合I與集合II的交集部分為正品與偽品物種的共有肽段，不具有特異性，故將集合I中此交集部分肽段去除后，集合I中的剩余肽段即構成了具有潛在特征肽的目標差異集合，進一步分析差異集合中的特征肽并進行靶向質譜驗證，確立了可用于專屬性鑒別的2條鹿源特征肽的氨基酸序列，及6條含有不同PTM組合的特征肽。進一步通過同源肽段序列比對，確定了驢、馬、牛、豬中的同源肽亦可作為識別相應物種的特征肽。此方法較生物信息學預測步驟更為簡便，基于實際樣品酶解肽圖的數(shù)學集合分析，通過排除法去除非特異性肽段，確定的特征肽段還包含了不同的PTM信息，可最大限度的發(fā)現(xiàn)特征肽，且發(fā)現(xiàn)的特征肽段均可在真實樣品中被檢測到，因此具有更高的可行性與可信度。

A-多元統(tǒng)計學分析 B-生物信息學預測 C-數(shù)學集合分析 D-LFQ篩選

（4）基于定量多肽組與修飾組結合比較分析發(fā)現(xiàn)特征肽：在實現(xiàn)不同物種來源膠原鑒別的基礎上，Han等[38]基于非標記定量（label-free quantification，LFQ）多肽組學結合糖基化位點分析方法，篩選了含量差異特征肽，如圖2-D所示。首先采用納升液相-串聯(lián)質譜法（nano-LC-MS/MS）全面檢測并定量了鹿角膠及鹿皮膠的酶解肽段，結合PCA、火山圖和熱圖對比尋找具有潛在差異的糖基化肽段，通過質譜的MRM模式篩選并確證了4條含有糖基化修飾位點的，且相對含量存在顯著性差異的鹿角特征肽，根據(jù)特征肽的相對含量差異可區(qū)分鹿角與鹿皮樣品，從而可實現(xiàn)相同基原不同部位來源的鹿角、鹿皮膠原產品的鑒別區(qū)分和相對摻偽定量，為進一步提高膠類中藥的精準鑒別和質量評價提供了一種新的研究思路。

2.6.2 特征肽在膠類中藥質量控制中的應用 特征肽作為具有物種差異性的生物標志物，可以有效解決膠類中藥真?zhèn)舞b別問題。相比其他利用理化性質差異區(qū)分正品與偽品的鑒別方法，基于質譜檢測的特征肽技術具有一個顯著優(yōu)勢即可同時設定多個物種特征肽離子信息作為檢測指標，在實現(xiàn)真?zhèn)舞b別的同時，可進一步準確判定摻偽成分并對摻偽成分相對定量?！吨袊幍洹?020年版規(guī)定了阿膠、鹿角膠及龜甲膠中必須檢出相應的物種特征離子，并頒布了偽品添加如豬皮、牛皮的特征肽補充檢驗方法；也有許多研究采用不同類型的偽品作為陰性對照，以篩選可用于膠類中藥鑒別的特征肽段。本文整理了部分具有代表性的特征肽信息，見表1。

（1）基于特征肽判別膠類中藥真?zhèn)闻c摻假情況：以物種專屬的特征肽“有”或“無”作為指標，可對膠類中藥的真?zhèn)芜M行判別。如在鑒別阿膠樣品時，設定驢源特征肽離子對用于檢測樣品是否來源于驢皮，同時可設定多個偽品物種同源特征肽離子對，如牛、馬、豬、羊等的特征肽離子對，正品阿膠僅可檢測出驢源特征肽，若未檢出驢源特征肽，則為偽品；若在檢出驢源特征肽的同時檢測到其他物種的特征肽，則為摻偽品?；谔卣麟臋z測的方法適用于各種膠類中藥的鑒別，可有效判別膠類中藥的真?zhèn)渭皳郊偾闆r。

表1 代表性膠類中藥特征肽信息

Table 1 Characteristic peptide information of representative gelatinous Chinese materia medica

類別特征肽序列特征離子m/z文獻 阿膠GPTGEPGKPGDK380.7 → 374.830,35 GPpGAAGPpGpR 539.8 → 612.4，539.8 → 923.834,39 HGDRGEpGPVGSVGPVGAVGPRGpSGPQGVRGDK**645.5 → 659.840-41 GPTGEPGK371.7 → 487.340-41 HGDRGEpGPVGSVGPVGAVGPR691.0 → 809.4 42 GPTGEpGKPGDK578.3 → 714.4，578.3 → 900.443 GppGAAGPPGLR 539.8 → 924.5，539.8 → 612.343 SGQPGTVGPAGVR591.8 → 910.5，591.8 → 455.843 GPAGPTGPVGK469.3 → 783.4，469.3 → 655.343 GPPGPVGppGLAGpPGESGR600.9 → 958.5，600.9 →772.443 SGDRGEAGPAGPAGPIGPVGAR649.7 → 955.4，649.7 → 556.343 GEAGPAGPAGPIGPVGAR765.9 → 1 048.6，765.9 → 991.643 GDGGPpGVTGFpGAAGR751.4 → 849.4，751.4 → 608.343 GEPGpVGSVGPVGAVGPR535 6 → 809.5，535 6 → 556.343 GLPGVAGSLGEpGpLGIAGpPGAR716.0 → 641.3，716.0 → 570.343 DGTSGHPGPIGPPGPR519.6 → 596.3，519.6 → 442.444 GPPGESGAAGPAGPIGSR517.6 → 586.3，517.6 → 797.344 PGEAGPPGPPGPAGEK731.8 → 1 035.5，731.8 → 300.144 GPPGPMGPPGIAGPPGESGR595.6 → 756.4，595.6 → 699.344 GPNGEPGSTGPAGPPGIR825.9 → 1 195.6，825.9 → 837.544 DGTLGHPGPIGPPGPR514.3 → 596.3，514.3 → 442.244 GEQGPAGPPGFQGIPGPAGTAGEVGKPGER940.8 → 474.2，940.8 → 756.444 TGPPGPSGISGPPGPPGAAGK602.0 → 767.4，602.0 → 689.944 PGPTGLEGPPGER640.3 → 741.4，640.3 → 511.344 GPAGPTGPVGK469.3 → 783.4，469.3 → 712.444 GIPGVAGSIGEPGPIGIAGPPGAR715.7 → 641.3，715.7 → 570.344 GIPGPAGAAGATGAR620.3 → 602.3，620.3 → 715.444 GPPGPVGPPGIAGPPGESGR893.0 → 1 264.6，893.0 → 1 207.644 GIPGVAGSIGEPGPIGIAGPPGAR1 073.1 → 513.3，1 073.1 → 416.244 GEPGPVGSVGPVGAVGPR802.9 → 809.5，802.9 → 1 052.644 GPAGPNGIPGEK555.8 → 446.2，555.8 → 885.444 GAPGAVGAPGPAGANGDRGEAGAAGPAGPAGPR914.4 → 1 073.5，914.4 → 1 137.544 GEPGPTGLPGPPGER733.3 → 741.4，733.3 → 640.344 GETGPSGPAGPTGAR656.3 → 967.5，656.3 → 870.444 SGDRGEAGPAGPAGPIGPVGAR649.3 → 766.5，649.3 → 955.444 IGAPGIIGIPGSR620.4 → 535.3，620.4 → 731.444 GLTGPIGPPGPAGAPGDKGETGPSGPAGPTGAR961.8 → 1 173.6，961.8 → 1 145.144 VGPPGPSGNAGPPGPPGPVGK614.6 → 837.4，614.6 → 667.444 GSPGGPGAAGFPGAR652.3 → 580.8，652.3 → 691.444 EGSPGAEGSPGR566.7 → 430.2，566.7 → 859.444

續(xù)表1

續(xù)表1

類別特征肽序列特征離子m/z文獻 鱉甲膠GETGPVGVTGSVGPAGAR784.9 → 872.5，784.9 → 1 028.651 GLpGQpGDSGPAGK635.3 → 801.1，635.3 → 516.252 DGEAGAQGPPGAAGPAGER832.9 → 979.5，832.9 → 1 036.550 GEVGPQGAIGPAGSSGPAGPIGAAGPAGSR834.1 → 743.4，834.1 → 953.550 牛皮膠GEGGPQGPR427.8 → 668.335 GPPGESGAAGPTGPIGSR 790.934 IGQpGAVGPAGIR 604.8 34 SGETGASGPpGFVGEK746.9 → 846.542 GYpGDAGPVGAAGApGPQGPVGPVGK755.0 → 553.442 GETGPAGPAGPIGPVGAR780.931 GEAGPSGPAGPTGAR641.3 → 726. 2，641.3 → 783.333,39 豬皮膠GPTGPAGVR406.6 → 556.835 AGVMGPPGSR473.0 → 718. 2，473.0 → 586.332 GEPGPTGVQGPPGPAGEEGK 925.4 → 832.6，925.4 → 1 011.534,53 TGETGASGPpGFAGEK739.9 → 818.542 GYpGNPGPAGAAGApGPQGAVGPAGK736.0 → 526.442 GETGPAGPAGPVGPVGAR 774.5 → 977.8，774.5 → 752.534,39 馬皮膠GASGPAGVR**386.3 → 499.3，386.3 → 643.335,54 GPSGEPGKPGDK**563.2 → 416.2，563.2 → 698.435,54 LSVEADIDGLR594.331 ISGEWYSIFLASDVK857.931 HGHRGEpGPVGSVGPVGAVGPRGpSGPQGVRGDK**649.7 → 670.840 GPSGEPGK364.7 → 487.340 HGHRGEpGPVGSVGPVGAVGPR698.3 → 809.442 羊皮膠TGEPGAAGPPGFVGEK751.9 → 903.5，751.9 → 846.632 GPAGPTGPAGK455.2 → 684.4，455.2 → 755.4，455.2 → 627.355 GFpGSDGVAGPK553.0 → 450.9，553.0 → 787.556

p-羥脯氨酸 k-羥賴氨酸*肽段為鹿皮膠與鹿角膠共有特征肽△肽段用于區(qū)分鹿皮膠與鹿角膠**肽段為騾皮膠共有特征肽

p-hydroxyproline k-hydroxylysine*peptides are shared by deer-skin gelatin and deer-horn gelatin△peptides are used to distinguish deer-skin gelatin and deer-horn gelatin**peptides are shared by mule-skin gelatin

（2）基于特征肽相對含量判別膠類中藥摻偽比例：僅以物種特征肽的“有”或“無”作為指標并不能全面評價膠類中藥質量，市場上的膠類中藥可能因多種原因混入偽品原料而生產出摻有偽品的膠類產品。因此，《中國藥典》2020年版補充檢驗方法結合市場調研與檢測方法的差異，將雜皮含量不超過5%限度的膠類中藥產品視為合格品[57]。在真?zhèn)舞b別的基礎上，應進一步對特征肽進行定量分析，建立科學合理的摻偽比例測定方法，實現(xiàn)膠類中藥產品的“優(yōu)劣評價”。

《中國藥典》2020年版中阿膠含量測定項下對2種驢源多肽設立限度要求，采用液質聯(lián)用儀檢測不同濃度驢源多肽的對照品溶液，以對照品峰面積對濃度建立標準曲線，計算樣品中的多肽含量。但是，具有不同序列的肽段在離子化效率上存在差異，質譜響應與肽段豐度并不直接相關[58]。目前多種標記和非標記方法被開發(fā)應用于蛋白質定量組學，根據(jù)目的要求可分為絕對定量和相對定量方法，其中常用的同位素標記法多用于小分子蛋白、多肽的絕對定量，方法穩(wěn)定可靠、重現(xiàn)性高，但同位素標記成本過高，因此，針對特征肽的準確、簡便的定量方法仍需進一步探索。

研究表明，摻偽樣品中偽品物種特征肽相對含量與偽品摻入量呈線性相關，可用于摻偽比例的相對定量[42,59]。如檢測鹿皮膠中偽品牛皮的摻入量時，以牛皮及鹿皮特征肽為指標，檢測不同濃度比例的牛皮膠與鹿皮膠的混合酶解液，以偽品牛皮特征肽相對峰面積（牛皮特征肽/鹿皮特征肽）對牛皮摻偽比值（牛皮/鹿皮）建立標準曲線，如圖3-A所示，可用于測定鹿皮膠樣品中牛皮的摻雜量。研究證明，特征肽相對含量（偽品特征肽/正品特征肽）與偽品摻入比例（偽品/正品）線性關系良好，適用于膠類中藥中偽品摻入比例的測定。Han等[38]利用鹿角膠、鹿皮膠中的差異性鹿角特征肽，同樣建立了鹿角膠中鹿皮膠的摻入比例測定方法。以鹿角特征肽Pep-G1的峰面積除以內參肽Pep-R的峰面積，計算不同鹿皮膠摻入量情況下的鹿角膠樣品中鹿角特征肽Pep-G1的相對含量，即Pep-G1/Pep-R，并以鹿角特征肽相對含量為縱坐標，摻偽量為橫坐標建立標準曲線，如圖3-B所示，結果線性關系良好，可用于鹿角膠中鹿皮膠摻入比例的測定。

圖3 特征肽相對含量與摻偽比例的線性關系

（3）PTM在特征肽檢測中的應用：特征肽檢測應用于膠類中藥的質量控制，首先應以正品特征肽的“有”和偽品特征肽的“無”為評價標準，判斷真?zhèn)吻闆r或摻偽情況；再對存在摻偽的膠類產品進一步評價，通過測定特征肽的相對含量計算摻偽比例；最終根據(jù)結果是否符合《中國藥典》2020年版中特征肽的檢測要求、含量限度要求及雜皮偽品含量限度要求評判產品質量是否合格，進而實現(xiàn)較為全面的質量評價。針對在應用中尚未解決的問題，仍需在發(fā)展和創(chuàng)新中不斷結合實際、完善質量控制體系。

在特征肽的發(fā)現(xiàn)和尋找過程中，含有修飾位點的氨基酸序列值得關注。Hyp為具羥基化修飾的Pro，在除膠原蛋白外的其他蛋白中較少見，因此選擇含有Hyp的肽段作為動物膠原鑒別的特征肽更具有特異性。另外，由于羥基化修飾與膠原的熱穩(wěn)定性呈正相關，因此在經(jīng)過高溫熬制的膠類中藥產品中，含Hyp的特征肽相對穩(wěn)定性較高，更適用于鑒別檢測，而含有甲基化、磷酸化、谷氨酸-末端環(huán)化等不穩(wěn)定修飾的肽段則不被考慮[55]。

修飾位點的存在也豐富了可用于鑒別及含量測定的特征肽指標，Liu等[37]在鹿皮膠特征肽尋找過程中發(fā)現(xiàn)，在序列不同位點發(fā)生PTM但氨基酸序列相同的特征肽段，均可認為是鹿皮膠的特征肽。在實際檢測中發(fā)現(xiàn)，基本序列為GYPGNA GPVGTAGAPGPQGPVGPTGK的鹿源特征肽中的Pro、Asn、Gln均存在修飾，不同的修飾組合均可認為是鹿源特征肽，如不同組合PTM的肽段有GYP（＋15.99）GNAGPVGTAGAP（＋15.99）GPQGPVGPTGK、GYP（＋15.99）GN（＋0.98）AGPVGTAGAP（＋15.99）GPQGPVGPTGK、GYP（＋15.99）GN（＋0.98）AGPV GTAGAP（＋15.99）GPQ（＋0.98）GPVGPTGK，其中＋15.99表示羥基化修飾，＋0.98表示脫酰胺化修飾，上述3個肽段均為鹿源特征肽，可用于鹿皮膠的專屬性檢測。這個發(fā)現(xiàn)在后續(xù)研究中也得到證實：鹿皮膠樣品中均可檢測到上述3條肽段，且在其他動物膠原中未檢出[42]。由此可見，在特征肽的尋找發(fā)現(xiàn)過程中，不同PTM增加了可檢測的特征肽種類，對膠類中藥質控方法的提升是有益的幫助與補充。

3 結語與展望

結合高分辨率質譜檢測物種特征肽，已被證明可實現(xiàn)物種的準確溯源?！吨袊幍洹?020年版在阿膠、鹿角膠、龜甲膠鑒別項下，均規(guī)定采用基于串聯(lián)質譜MRM模式下檢測專屬性離子對的方法，而含量測定項下阿膠以2個驢源多肽以及Hyp、Pro、Gly、丙氨酸的含量為指標，鹿角膠、龜甲膠僅以這4種氨基酸的含量為指標。物種特征肽段的質譜檢測方法已經(jīng)被《中國藥典》2020年版收載，表明以特征肽鑒別膠類中藥的方法是可行的，但基于特征肽絕對定量的膠類中藥質量評價方法尚需要進一步豐富與完善，這是未來膠類中藥質量控制研究的方向之一。

基于已被研究證實具有物種高度專屬性的特征肽，本文提出建立膠類中藥的多維評價體系：（1）根據(jù)檢測膠類中藥產品中目標正品特征肽和各種偽品特征肽的“有無”判斷其真?zhèn)渭皳絺吻闆r，分為正品、摻偽品、純偽品。（2）根據(jù)特征肽相對含量關系測定摻偽品的摻偽比例，進一步判斷產品質量的“優(yōu)劣”情況。（3）根據(jù)對膠類中藥特征肽建立的檢測要求及含量限度要求最終評判產品質量是否合格。該體系的核心在于選擇的特征肽應具有高度的物種專屬性和檢測穩(wěn)定性。本文綜合論述了幾種發(fā)現(xiàn)、確定特征肽的方法策略，并介紹了修飾位點在特征肽確立及檢測中的重要作用，為發(fā)現(xiàn)更多可用于質量檢測的物種特征肽提供了新的思路。

穩(wěn)定的物種特異性是特征肽最重要的特性，將其作為質量檢測的生物標志物可解決動物膠原蛋白高度同源性的區(qū)分難題。基于特征肽檢測建立科學、全面的膠類中藥質量評價方法研究，可從以下方向進一步展開：（1）深入研究膠原蛋白中廣泛存在的不同修飾類型與數(shù)量，關聯(lián)特征肽序列中可能具有的各種修飾，豐富物種專屬性鑒別、不同部位特征區(qū)分及含量測定的標志成分。（2）針對含有膠類中藥的多種處方制劑及保健食品中特征肽標志物含量可能較低的情況，探索建立微量標志成分的檢測方法。（3）多方面考察質譜檢測中特征肽響應的影響因素，完善特征肽含量測定方法學驗證，建立便捷穩(wěn)定、可重復性高的特征肽絕對定量測定方法，有利于進一步評價膠類產品質量以及優(yōu)化制膠工藝。隨著科學技術的持續(xù)發(fā)展和相關理論研究的不斷深入，結合先進技術和創(chuàng)新理念用于膠類中藥的質控研究，才能更好地促進產品的質量提升和市場有序發(fā)展，進一步保障人民群眾的健康安全。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Research progress on quality control of gelatinous traditional Chinese medicine based on discovery and application of specific peptides

CAI Shuo1, 2, HAN Shu-ying2, XIA Hao-ran2, YAN Zhi-ye2, HUANG Xiao-zheng2, ZHAO Ming1, 2, DUAN Jin-ao1, 2, LIU Rui1, 2, 3

1. Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization, and National and Local Collaborative Engineering Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization and Formulae Innovative Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 3. Jiangsu Key Laboratory of Research and Development in Marine Bio-resource Pharmaceutics, Nanjing 210023, China

Gelatinous traditional Chinese medicine (TCM), as a valuable characteristic TCM in China, is derived from the skin, horn, shell and other tissues of animals, and it forms solid blocks after extraction, concentration and drying. Recently, gelatinous TCMs have been increasingly favored by consumers because of its unique nourishing effect, and its market demand has been expanded continuously. However, the shortage of raw materials and the lack of effective quality control methods lead to the widespread use of fake and inferior gelatinous TCMs and their products, which seriously affect the reputation of the industry and endanger health and safety of people. Therefore, in order to ensure the quality of gelatinous TCMs and promote the healthy development of the industry, investigators have made continuous innovations and breakthroughs around the quality control research of gelatinous TCMs, and established a variety of efficient and sensitive quality detection methods. Research status of quality control of gelatinous TCMs was systematically reviewed from substance composition and quality control method based on discovery and application of characteristic peptide in this paper, in order to provide reference for further constructing and perfecting scientific and reasonable quality control system, and to promote the healthy development of gelatinous TCMs and industry.

gelatinoustraditional Chinese medicine; specific peptide; discovery; application; quality control; biomarkers

R284.191

A

0253 - 2670(2022)21 - 6888 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.21.028

2022-08-08

國家自然科學基金面上項目（81973450）；國家重點研發(fā)計劃資助項目（2018YFC1706100）；江蘇省高校“青藍工程”中青年學術帶頭人；江蘇省第六期“333高層次人才培養(yǎng)工程”第三層次培養(yǎng)對象

蔡 朔，男，在讀本科，研究方向為中藥資源與開發(fā)。E-mail: Caisure1999@163.com

段金廒，教授，博士生導師，研究方向為中藥資源化學與資源循環(huán)利用。E-mail: dja@njucm.edu.cn

劉 睿，教授，碩士生導師，研究方向為中藥動物藥資源化學。E-mail: liurui@njucm.edu.cn

[責任編輯 崔艷麗]