郭思瑋，張馨心，張聰聰，張珈溯，尹寶珍，張洛萌，夏廣軍

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 133002）

畜禽的產(chǎn)仔量、精液品質(zhì)、肌內(nèi)脂肪沉積能力等生產(chǎn)性狀受多基因遺傳因素影響。microRNA（miRNA）是基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控因子，幾乎參與調(diào)控生物整個(gè)生命過程，包括胚胎發(fā)育、染色體結(jié)構(gòu)、細(xì)胞增殖、凋亡、應(yīng)激抵抗、脂肪代謝和干細(xì)胞修復(fù)。單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）是基因組水平上的突變所引起的DNA 序列多態(tài)性，而miRNA 與靶基因結(jié)合位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性已引起研究者的關(guān)注。在畜牧業(yè)生產(chǎn)中，SNP 廣泛用于篩選對(duì)畜禽有利的主效基因以改善相關(guān)性狀，當(dāng)miRNA 序列或其靶位點(diǎn)存在SNP，會(huì)影響miRNA 表達(dá)或其與靶基因的相互作用。營養(yǎng)調(diào)控和分子育種是改良畜禽品種品質(zhì)的兩大手段，在分子育種方面，目前研究較多的遺傳標(biāo)記技術(shù)包括限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增DNA 多態(tài)性（RAPD）、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）、單核苷酸多態(tài)性（SNP）、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）等，但利用miRNA 的調(diào)控作用來提高畜禽產(chǎn)品品質(zhì)方面研究相對(duì)較少。本文總結(jié)了近年來與miRNA 相關(guān)SNP 對(duì)畜禽生產(chǎn)性狀影響的研究進(jìn)展并對(duì)其未來發(fā)展進(jìn)行展望，為培育具有優(yōu)良生產(chǎn)性狀的畜禽品種提供理論基礎(chǔ)。

1 miRNA 生理特性

miRNA 是一類長度約為23 個(gè)核苷酸的非編碼RNA，廣泛分布于病毒、植物、原生生物和動(dòng)物中，其功能是介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默。1993 年，Lee 在秀麗隱桿線蟲中首次發(fā)現(xiàn)miRNA，其在動(dòng)植物基因表達(dá)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。miRNA 的生物發(fā)生是通過RNA 聚合酶II 轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)開始的，首先轉(zhuǎn)錄生成miRNA 的原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物pri-miRNA，pri-miRNA 在核內(nèi)經(jīng)Drosha 酶及其輔因子DGCR8 形成的復(fù)合體作用下，生成長度為60～70 bp 的發(fā)夾狀miRNA 前體，最后形成長度約22 個(gè)核苷酸的雙鏈RNA，雙鏈解旋生成成熟的miRNA。miRNA 與mRNA 結(jié)合對(duì)調(diào)控mRNA和蛋白表達(dá)水平至關(guān)重要，大量的蛋白質(zhì)編碼基因是由miRNA 調(diào)節(jié)，由此可見與miRNA 相關(guān)的SNP 在調(diào)控各種生物功能方面起著重要作用。

2 miRNA 序列及其靶基因結(jié)合位點(diǎn)SNP

SNP 是指由于基因中單個(gè)堿基發(fā)生轉(zhuǎn)換、缺失、插入或者顛換引起基因組DNA 序列的多態(tài)性，普遍存在于各種生物基因中。近10 年來，DNA 分子標(biāo)記的研究和應(yīng)用飛速發(fā)展，一系列DNA 分子標(biāo)記系統(tǒng)相繼形成。在眾多分子標(biāo)記中，SNP 標(biāo)記是當(dāng)前遺傳標(biāo)記研究中應(yīng)用最多，也是最有前景的分子標(biāo)記。miRNA 調(diào)控途徑中的多態(tài)性是動(dòng)物基因組中存在的一類新型功能性多態(tài)，但由于miRNA 生物發(fā)生的復(fù)雜性和miRNA 全基因組的功能效應(yīng)，miRNA SNPs 的生物學(xué)作用仍然難以確定。

與miRNA 相關(guān)的多態(tài)性可分為兩類：miRNA轉(zhuǎn)錄過程中的SNP（初始miRNA 和miRNA 前體的SNP）和miRNA 靶基因結(jié)合位點(diǎn)的多態(tài)性。一般來說，在miRNA 轉(zhuǎn)錄過程中，包括初始miRNA（pri-miRNA）、miRNA 前體（pre-miRNA）和成熟的miRNA 在內(nèi)都有可能發(fā)生序列變化，這種多態(tài)性可能影響數(shù)百個(gè)基因和通路的表達(dá)，并且廣泛影響miRNA 功能以及miRNA的加工或靶位點(diǎn)的選擇。根據(jù)miRNA 序列中的SNPs，有3 種干擾miRNA 功能的渠道：pri-miRNA 或pre-miRNA 的突變可能會(huì)影響miRNA 穩(wěn)定性或轉(zhuǎn)錄效率；在pri-miRNA 啟動(dòng)子區(qū)域的突變可能會(huì)影響轉(zhuǎn)錄速率；成熟miRNA 序列改變會(huì)破壞其與mRNA 靶位點(diǎn)的互相作用。與miRNA 轉(zhuǎn)錄過程中的多態(tài)性相比，靶基因3'UTR 區(qū)的序列變化在人類基因組中更為豐富。3'UTR 區(qū)是一個(gè)關(guān)鍵的控制區(qū)域，具有調(diào)節(jié)mRNA 穩(wěn)定性、翻譯和定位的能力。而miRNA 靶位點(diǎn)內(nèi)的SNP僅影響靶mRNA 及其下游效應(yīng)物，因此更具特異性。

miRNA 通常通過靶向mRNA3'UTR 區(qū)的部分互補(bǔ)序列來抑制基因表達(dá)，然而這種結(jié)合可能受到miRNA靶位點(diǎn)的SNP 影響，SNP 會(huì)破壞或產(chǎn)生新的結(jié)合位點(diǎn)。Luo 等證明位于基因3'UTR 區(qū)microRNA-7結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)的單核苷酸多態(tài)性（1010A/G），主要通過microRNA-7 的差異結(jié)合活性和與單核苷酸多態(tài)性相關(guān)的mRNA 穩(wěn)定性影響基因在膀胱癌中的表達(dá)。hsa-miR-422a 靶基因在其靶位點(diǎn)3'UTR 的SNP rs12607853 與海洛因成癮顯著相關(guān)，hsa-miR-1270以等位基因特異性方式與SNP 位點(diǎn)的等位基因結(jié)合來抑制熒光素酶活性、與該基因3'UTR 中的SNP 結(jié)合來抑制基因的產(chǎn)生，還可通過靶向包含rs241456的T 等位基因的認(rèn)知序列來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。探索與miRNA 相關(guān)的SNP 及其與表型性狀間的關(guān)聯(lián)有助于深入了解miRNA 的調(diào)控機(jī)制與功能。

3 miRNA 靶基因結(jié)合位點(diǎn)SNP 對(duì)畜禽生產(chǎn)性狀的影響

3.1 miRNA 靶基因結(jié)合位點(diǎn)SNP 對(duì)肉質(zhì)性狀的調(diào)控 氧化低密度脂蛋白1（OLR1）是一類可以結(jié)合氧化低密度脂蛋白的受體，1997 年，Sawamura在牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)基因，屬于C 型血凝素家族。有研究表明，基因參與脂質(zhì)代謝與牛肉品質(zhì)調(diào)控。張傳生等研究發(fā)現(xiàn)bta-miR-370 靶標(biāo)基因3'UTR 區(qū)存在1 個(gè)SNP 位點(diǎn)（A8232C），在奶牛基因3'UTR 發(fā)現(xiàn)bta-miR-370 因堿基不能互補(bǔ)配對(duì)而導(dǎo)致靶標(biāo)缺失。李托研究發(fā)現(xiàn)秦川牛基因A>C 的突變導(dǎo)致bta-miR-370 的靶標(biāo)缺失，抑制了其與基因mRNA 3'UTR 區(qū)結(jié)合且引起眼肌面積等肉質(zhì)性狀的變異。

3.2 miRNA 靶基因結(jié)合位點(diǎn)SNP 對(duì)產(chǎn)仔量的調(diào)控 干細(xì)胞因子（KITLG）是基因的配體，在原始生殖細(xì)胞的生長發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用?；蛲ㄟ^觸發(fā)其受體酪氨酸激酶，在生物的發(fā)育過程中具有多種生物學(xué)功能。An 等通過DNA 測(cè)序在山羊基因3'UTR 中發(fā)現(xiàn)3 個(gè)SNP 位點(diǎn)（c.1389C>T、c.1457A>C 和c.1520G>A），其中c.1457A >C 與山羊產(chǎn)仔數(shù)顯著相關(guān)。熒光素酶檢測(cè)結(jié)果證實(shí)chi-miR-204-5p 和chi-miR-211 與基因存在靶向關(guān)系，當(dāng)?shù)任换駽 存在時(shí)，chi-miR-204-5p 和chi-miR-211與基因結(jié)合被抑制，進(jìn)而影響表達(dá)水平，這一發(fā)現(xiàn)有助于了解基因在山羊中的表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制。

CDC42 是Rho GTPases 家族的一員，在控制細(xì)胞功能方面起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。Liu 等發(fā)現(xiàn)豬基因3'UTR 區(qū)存在一個(gè)SNP 位點(diǎn)rs55618224（T>C），PCR-MnII-RFLP 檢測(cè)顯示在母豬胎盤中，CC 基因型基因mRNA 表達(dá)水平顯著高于TT基因型。熒光素酶結(jié)果證實(shí)該位點(diǎn)是基因與miR-18a 結(jié)合位點(diǎn)，rs55618224 不僅影響miR-18a 與基因結(jié)合且與豬窩產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)，這一研究結(jié)果為探索豬胎盤發(fā)育與改良母豬繁殖性狀提供了新的思路。

An 等在山羊基因中發(fā)現(xiàn)g.151435C>T、g.151454A>G、g.173057T>C 3 個(gè)SNP 位點(diǎn)，g.151435C>T和g.173057T>C 與山羊產(chǎn)仔數(shù)顯著相關(guān)。此外，g.173057T>C 多態(tài)位點(diǎn)可調(diào)控bta-miR-302a 與基因的結(jié)合活性，熒光素酶結(jié)果也證實(shí)該位點(diǎn)突變破壞了bta-miR-302a 與基因的結(jié)合。g.151435C>T與g.173057T>C 位點(diǎn)均可作為遺傳標(biāo)記，對(duì)山羊的遺傳育種具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

3.3 miRNA 靶基因結(jié)合位點(diǎn)SNP 對(duì)產(chǎn)奶性狀的調(diào)控 5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）是一種來自氧化還原酶類的酶，參與調(diào)節(jié)同型半胱氨酸濃度，MTHFR 是同型半胱氨酸再甲基化為蛋氨酸的必要原料。Hou以山羊?yàn)檠芯繉?duì)象，在基因3'UTR區(qū)檢測(cè)到2 個(gè)SNP 位點(diǎn)（g.2244A>G；g.2264A>G），這兩處多態(tài)性與山羊的產(chǎn)奶性狀相關(guān)。生物信息學(xué)分析與熒光素酶結(jié)果表明，hsa-miR-1266、hsa-miR-1289、hsa-miR-505 和hsa-miR-616 可以與基因3'UTR區(qū)結(jié)合，且2244A →G 突變可增加hsa-miR-1266 與基因3'UTR 的結(jié)合活性；2264A →G 突變可降低hsa-miR-616 與基因3'UTR 的結(jié)合活性。

Mahmoudi 等通過測(cè)序發(fā)現(xiàn)基因3'UTR 存在T14280C 突變。對(duì)3'UTR 區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和SSCP 檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)顯著提高奶牛產(chǎn)后第5 天-羥基丁酸水平、體況評(píng)分以及牛奶中蛋白質(zhì)含量。生物信息學(xué)分析顯示，基因3'UTR 區(qū)存在mir-423-5p 靶位點(diǎn)，T14280C 突變使mir-423-5p 的靶標(biāo)失活，而mi-423-5p 是在牛乳腺、肝臟和腎臟中表達(dá)最高的microRNA 之一，這一發(fā)現(xiàn)為mi-423-5p 在調(diào)節(jié)荷斯坦奶牛細(xì)胞代謝、代謝紊亂和牛奶品質(zhì)方面有重要作用提供了科學(xué)依據(jù)。

脂肪酸去飽和酶2（FADS2）是參與長鏈多不飽和脂肪酸合成的限速酶。Li 等發(fā)現(xiàn)SNP 位點(diǎn) c.1571G>A 通過破壞miR-744 與基因的結(jié)合能力，提高ω-6 長鏈多不飽和脂肪酸的合成，該位點(diǎn)是改善牛奶品質(zhì)的潛在遺傳標(biāo)記。

3.4 miRNA 靶基因結(jié)合位點(diǎn)SNP 對(duì)精液品質(zhì)的調(diào)控編碼轉(zhuǎn)化蛋白2（TNP2）與精子活力與精液品質(zhì)相關(guān)，參與精子發(fā)生過程中核糖體的清除與精子細(xì)胞核的初始凝結(jié)。Gao 等在中國荷斯坦?；虬l(fā)現(xiàn)3個(gè)SNP 位 點(diǎn)（g.269 G.A,g.480 C.T,g.1536 C.T），關(guān)聯(lián)分析表明3 個(gè)SNP 位點(diǎn)與中國荷斯坦牛精液品質(zhì)性狀顯著相關(guān)。生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)，基因3'UTR中的g.1536 C.T 位點(diǎn)位于bta-miR-154 結(jié)合區(qū)域。熒光素酶檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)，bta-miR-154 靶向調(diào)節(jié)基因，而基因3'UTR 中的SNP（g.1536 C.T）破壞了基因與bta-miR-154 的結(jié)合，可作為哺乳動(dòng)物精液質(zhì)量與生育能力的輔助標(biāo)記選擇。

過渡核蛋白（TNPs）是濃縮精子細(xì)胞染色質(zhì)中的主要蛋白質(zhì)，Zhang 等發(fā)現(xiàn)基因3'UTR 區(qū)發(fā)現(xiàn)中2 個(gè)SNP 位點(diǎn)（g.442 A.G、g.528 G.A）與中國荷斯坦牛精液品質(zhì)顯著相關(guān)，生物信息學(xué)分析顯示兩個(gè)位點(diǎn)分別位于bta-miR-204 和bta-miR-532 與TNP1 結(jié)合區(qū)，熒光素酶結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)其靶向關(guān)系，這一發(fā)現(xiàn)對(duì)中國荷斯坦牛精液品質(zhì)性狀的選擇有重要意義。

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1（PCK1）是一種多功能酶，在生殖生理過程中發(fā)揮重要作用。Huang 等研究發(fā)現(xiàn)基因的miRNA 結(jié)合位點(diǎn)上的SNP（c.+2183 G>T）與荷斯坦牛射精量、新鮮精子活力、壽命的基因組估計(jì)育種值、綜合指數(shù)和產(chǎn)犢難易度的下降有關(guān)。熒光素酶檢測(cè)結(jié)果顯示，bta-miR-26a 抑制?；虻谋磉_(dá)，證實(shí)了bta-miR-26a 與的靶向關(guān)系，而多態(tài)位點(diǎn)可能通過破壞二者的結(jié)合對(duì)荷斯坦牛的精液質(zhì)量產(chǎn)生影響。

3.5 miRNA 靶基因結(jié)合位點(diǎn)SNP 對(duì)其他生產(chǎn)性狀的調(diào)控 胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白2（IGFBP2）屬于IGFBPs 家族?；蛟诟闻K、脂肪細(xì)胞、生殖系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)，對(duì)動(dòng)物脂肪細(xì)胞的發(fā)育和脂質(zhì)代謝有顯著影響。Leng 等發(fā)現(xiàn)雞體內(nèi)基因3'UTR 區(qū)存在1 個(gè)SNP 位點(diǎn)（1196C>A）。于瑩瑩等通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)雞體內(nèi)基因是gga-miR-456-3p 的靶基因，其3'UTR區(qū)的SNP（1196C>A）影響gga-miR-456-3p 對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。

熱休克轉(zhuǎn)錄因子1（）基因在熱應(yīng)激反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。Li 等在中國荷斯坦奶牛基因3'UTR 區(qū)發(fā)現(xiàn)了1 個(gè)SNP 位點(diǎn)（g.4693G>T），該突變位點(diǎn)與中國荷斯坦奶牛的耐熱性相關(guān)。熒光素酶分析表明，bta-miR-484 靶向調(diào)節(jié)基因，但由于多態(tài)性的存在與bta-miR-484 的結(jié)合活性受到抑制且對(duì)荷斯坦奶牛的耐熱性產(chǎn)生影響。

綜上所述，畜禽體內(nèi)microRNA 靶基因結(jié)合位點(diǎn)的SNP 通過使其靶標(biāo)缺失，靶基因不再受miRNA 調(diào)控，進(jìn)而對(duì)各種生產(chǎn)性狀產(chǎn)生影響。

4 miRNA 轉(zhuǎn)錄過程中的多態(tài)性對(duì)畜禽生產(chǎn)性狀的影響

Wu 等通過Sanger 測(cè)序在3 個(gè)雞品種的PCR 產(chǎn)物上發(fā)現(xiàn)初級(jí)miR-26a-5p 中的10 個(gè)SNP 位點(diǎn)，其中rs316365438（C>T）位點(diǎn)與首次卵齡和32 周產(chǎn)蛋總數(shù)相關(guān)。Wang 等發(fā)現(xiàn)位于miR-1666 前體區(qū)域內(nèi)的突變位點(diǎn)rs14120863（C>G）與雞8 周齡的胴體重、內(nèi)臟重、胸肌重、腿部肌肉重顯著相關(guān)，對(duì)成熟miR-1666 的生成也有顯著影響。Li 等鑒定了位于雞miRNA-1606前體的1 個(gè)SNP 位點(diǎn)，該位點(diǎn)與雞第10 周、第12 周體重以及第8 周雞腿長度、胸深以及體斜長顯著相關(guān)，且改變了pre-mir-1606 的第二結(jié)構(gòu)，成熟miRNA 在CA 基因型和AA 基因型之間的相對(duì)表達(dá)量在腿肌中也發(fā)生顯著變化。

Cardoso 等在Nelore 牛不同miRNA 序列中（btamiR-2419-3p、bta-miR-193a-2 和bta-miR-1291）鑒定了3 個(gè)與脂肪酸組成顯著相關(guān)的SNP 位點(diǎn)，其中位于bta-miR-1291 序列的多態(tài)位點(diǎn)與不同ω6 脂肪酸、多不飽和脂肪酸以及多不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比值相關(guān)，另外2 個(gè)miR-SNPs 分別與月桂酸、順式11-油酸以及6 亞麻酸、脂肪酸6/3 相關(guān)。

綜上所述，miRNA 轉(zhuǎn)錄過程中的SNP 也會(huì)對(duì)畜禽的生產(chǎn)性狀產(chǎn)生影響，可能成為動(dòng)物育種中潛在的遺傳標(biāo)記用于分子輔助選擇。

4 總結(jié)與展望

利用分子遺傳標(biāo)記技術(shù)改良畜禽生產(chǎn)性狀已成為畜禽種質(zhì)提升的重要手段，但目前對(duì)于miRNA 及其靶基因結(jié)合位點(diǎn)多態(tài)性的研究大多集中在醫(yī)學(xué)方面，關(guān)于miRNA 序列及其靶基因結(jié)合位點(diǎn)對(duì)畜禽生產(chǎn)性狀影響的研究也尚處起步階段?，F(xiàn)有對(duì)miRNA 及其靶位點(diǎn)的多態(tài)性與畜禽生產(chǎn)性狀的研究局限在多態(tài)位點(diǎn)與生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)性分析及其與miRNA 相互作用，在今后的研究中應(yīng)深入探索miRNA 及其靶位點(diǎn)多態(tài)性的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和其復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制，找到與改進(jìn)生產(chǎn)性狀相關(guān)的分子機(jī)理，為培育具有優(yōu)良生產(chǎn)性狀的畜禽品種提供科學(xué)依據(jù)。