權(quán)帆，王文斌，朱玲麗，方建華，付成麗，崔宏偉，鄭斌麗，吳淑清*

(1.長春大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，長春 130022；2.浙江李子園食品股份有限公司，浙江 金華 321031)

藜麥(ChenopodiumquinoaWilld.)也稱奎藜、灰米、金谷子，是藜科一年生草本開花植物[1]，含有豐富的碳水化合物、蛋白質(zhì)、礦物元素等營養(yǎng)物質(zhì)，同時具有酚類、三萜皂苷、γ-氨基丁酸等多種生物活性成分[2]。因其營養(yǎng)全面、比例均衡的特點，藜麥引起了越來越多的關(guān)注[3]。

藜麥富含其他谷物無法比擬的高品質(zhì)全蛋白[4]，平均含量在12.5%～16.7%[5]。藜麥蛋白是由清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白構(gòu)成的，其中清蛋白和球蛋白含量占總蛋白質(zhì)的44%～77%，谷蛋白和醇溶蛋白相對較少[6]。目前，蛋白質(zhì)提取方法有堿溶酸沉法、酶法、超聲提取法、鹽析法等[7]，以堿溶酸沉法為主要提取方法；對藜麥蛋白的功能特性研究較少，而pH對蛋白的功能特性有顯著影響，直接影響食品的感官品質(zhì)。

本試驗采用堿溶酸沉法從藜麥粉中提取蛋白質(zhì)，通過單因素試驗結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化試驗，確定藜麥蛋白的最佳提取條件，同時研究不同pH值對其功能特性的影響。為利用藜麥蛋白研究開發(fā)新型食品奠定了基礎(chǔ)，也為后期改善特定的功能特性提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藜麥：山西綠色山區(qū)農(nóng)副產(chǎn)品銷售公司；大豆油：益海嘉里食品營銷有限公司。

牛血清蛋白(BSA)、考馬斯亮藍G-250、氫氧化鈉：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；石油醚、無水乙醇：分析純，天津市富宇精細化工有限公司；磷酸：分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；鹽酸：北京市大興區(qū)安定鎮(zhèn)工業(yè)總公司。

1.2 設(shè)備與儀器

HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州天瑞有限公司；721型可見分光光度計 上海菁華科技有限公司；TG16G型高速離心機 金壇區(qū)白塔新寶儀器廠；PHS-3C型pH計 上海浦春計量儀器有限公司；ZIRBUS VaCo 5型冷凍干燥機 吉林省華業(yè)科教儀器設(shè)備有限公司；MF0910P型馬弗爐 華港通科技(北京)有限公司；FSH-2A型可調(diào)高速勻漿機 常州萬合儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藜麥基礎(chǔ)成分的測定

蛋白含量按照GB 5009.5-2016測定；水分含量按照GB 5009.3-2016測定；脂肪含量按照GB 5009.6-2016測定；膳食纖維含量按照GB 5009.8-2014測定；灰分含量按照GB 5009.4-2016測定。

1.3.2 藜麥預(yù)處理

挑選顆粒飽滿、大小均一的藜麥浸泡30 min，于烘箱中45 ℃烘制8 h，冷卻后粉碎，過80 目篩，用石油醚脫脂(藜麥粉∶石油醚為1∶4，g/mL)，攪拌2 h后，靜置12 h過濾，棄掉上清液，于烘箱中45 ℃烘制2 h，將脫脂后的藜麥粉放在通風(fēng)處24 h以揮發(fā)殘留的石油醚，之后置于干燥環(huán)境下保存，備用。

1.3.3 藜麥蛋白提取流程

對預(yù)處理后的藜麥粉加水溶解，按照一定的料液比，用0.5 mol/L NaOH調(diào)溶液至適宜pH，在適宜溫度下提取一定時間后，5000 r/min 離心10 min，收集上清液后，用0.5 mol/L HCl調(diào)pH至4.5，10000 r/min離心15 min，收集沉淀，水洗沉淀，調(diào)pH至中性，經(jīng)真空冷凍干燥后得到藜麥蛋白。

1.3.4 藜麥蛋白提取率的測定

1.3.4.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別吸取0.0，0.06，0.12，0.24，0.48，0.72 mL的0.1 mg/mL蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL試管中，對應(yīng)加入1，0.94，0.88，0.76，0.52，0.28 mL蒸餾水，再分別加入5 mL考馬斯亮藍G-250溶液，充分混勻，靜置2 min。用蒸餾水作空白對照，在595 nm處測其吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到方程y=0.5753x+0.0075(R2=0.996)。

提取液蛋白含量測定：吸取1 mL提取液，再加入5 mL的考馬斯亮藍G-250溶液，充分混勻，靜置2 min。用蒸餾水作對照組，于595 nm處測其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算提取液的蛋白質(zhì)含量。

樣品蛋白含量測定：按照GB 5009.5-2016進行。

1.3.4.2 提取率的測定

藜麥蛋白質(zhì)提取率(%)=提取液蛋白質(zhì)含量/樣品蛋白含量×100%。

1.3.5 單因素試驗

藜麥蛋白提取基本條件：料液比1∶10，pH 10.5，溫度 45 ℃，提取時間 2 h。研究料液比(1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16，g/mL)、提取時間(1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h)、提取溫度(35，40，45，50，55 ℃)、pH 值(9.0，9.5，10.0，10.5，11.0)對蛋白提取率的影響。以蛋白提取率為指標(biāo)，每個水平進行3次重復(fù)試驗取平均值。

1.3.6 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計

在單因素試驗基礎(chǔ)上，對料液比、提取時間、提取溫度及pH值進行優(yōu)化，以藜麥蛋白提取率為響應(yīng)值，設(shè)計響應(yīng)面試驗因素水平表，見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平

1.3.7 藜麥蛋白純度的測定

精確稱取適量藜麥蛋白粉并記錄質(zhì)量，按照GB 5009.5-2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》，重復(fù)3次試驗取平均值得蛋白純度。

1.3.8 藜麥蛋白功能特性研究

1.3.8.1 溶解性研究

參照高艷慧[8]的方法并略作調(diào)整，稱量0.1 g藜麥蛋白粉充分溶于10 mL蒸餾水中，用0.5 mol/L的HCl和NaOH分別調(diào)節(jié)樣品溶液pH值至2，4，6，8，10，12，于磁力攪拌器中攪拌30 min，8000 r/min離心10 min，用考馬斯亮藍法測所得上清液的蛋白質(zhì)含量。

溶解性(%)=上清液蛋白含量/樣品蛋白含量×100%。

1.3.8.2 乳化性與乳化穩(wěn)定性研究

a.乳化性

參照呂凱波等[9]的方法并略作調(diào)整，稱量0.1 g藜麥蛋白粉溶解于10 mL蒸餾水中，用0.5 mol/L的HCl和NaOH分別調(diào)節(jié)樣品溶液pH值至2，4，6，8，10，12，分別加入等體積的大豆油，快速攪拌1 min后以2000 r/min離心10 min。

乳化性(%)=乳化后高度/離心管樣液總高度×100%。

b.乳化穩(wěn)定性

將上述離心后的樣品溶液于80 ℃恒溫水浴30 min，待樣液完全冷卻后以2000 r/min離心10 min。

乳化穩(wěn)定性(%)=乳化后高度/乳化前高度×100%。

1.3.8.3 起泡性和泡沫穩(wěn)定性研究

參照張思思[10]的方法并略作調(diào)整，稱取一定量的藜麥蛋白粉，配制1%的蛋白溶液,用0.5 mol/L的HCl和NaOH分別調(diào)節(jié)樣品溶液pH值至2，4，6，8，10，12，用高速勻漿機以15000 r/min攪打2 min，隨后倒入離心管中，記錄上層泡沫體積，靜置30 min后，再次記錄上層泡沫的體積。計算蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性。

起泡性(%)=攪拌停止時泡沫體積/蛋白溶液體積×100%。

泡沫穩(wěn)定性(%)=30 min后泡沫體積/起初泡沫體積×100%。

1.3.8.4 持水性研究

參照楊希娟等[11]的方法并略作調(diào)整，用蒸餾水配制濃度為10 mg/mL的藜麥蛋白溶液，用0.5 mol/L的HCl和NaOH分別調(diào)節(jié)樣品溶液pH值至2，4，6，8，10，12，常溫靜置1 h后，以4000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，除去上清液，稱取離心管和沉淀物的質(zhì)量。

持水性(g/g)=(離心管沉淀物質(zhì)量-樣品質(zhì)量)/樣品質(zhì)量。

1.3.8.5 持油性研究

參照Mohammed等[12]的方法并略作調(diào)整，稱量0.1 g藜麥蛋白粉加入10 mL大豆油，用0.5 mol/L的HCl和NaOH分別調(diào)節(jié)樣品溶液pH值至2，4，6，8，10，12后靜置1 h，以4000 r/min離心10 min，棄去上清液后，稱量樣品的質(zhì)量。

持油性(g/g)=(離心管沉淀物質(zhì)量-樣品質(zhì)量)/樣品質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 藜麥基本營養(yǎng)成分的測定

藜麥基本營養(yǎng)成分的測定見表2。

表2 藜麥基本營養(yǎng)成分測定表

2.2 單因素試驗

2.2.1 料液比對藜麥蛋白提取率的影響

由圖1可知，隨著料液比的增加，蛋白提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，料液比為1∶12 (g/mL)時，藜麥蛋白提取率達到最大。當(dāng)料液比為1∶8～1∶12 (g/mL)時，隨著料液比的增加，藜麥蛋白提取率顯著上升；當(dāng)料液比為1∶14～1∶16 (g/mL)時，藜麥蛋白提取率基本不變。這是由于料液比過小時，藜麥溶解不充分，不利于蛋白質(zhì)的溶出；增大料液比，藜麥粉與水充分溶解，有利于蛋白分子溶出；但料液比過大時，蛋白溶出量達到飽和，藜麥蛋白提取率變化不大。因此，選擇料液比1∶10～1∶14 (g/mL)進行響應(yīng)面試驗。

圖1 料液比對藜麥蛋白提取率的影響

2.2.2 提取時間對藜麥蛋白提取率的影響

由圖2可知，在提取時間為2.5 h時，藜麥蛋白提取率達到最大；當(dāng)提取時間為1.0～2.5 h時，隨著提取時間的增加，藜麥蛋白提取率顯著上升。這是由于溶液長時間攪拌，藜麥蛋白溶解更加完全，蛋白質(zhì)溶出量增加；當(dāng)提取時間大于2.5 h時，藜麥蛋白提取率略微下降，可能是因為提取時間過長，增加了非蛋白物質(zhì)浸出，進一步影響蛋白質(zhì)的沉淀和純度[13]，同時耗能增加，生產(chǎn)成本也隨之增加。因此，選擇提取時間2.0～3.0 h進行響應(yīng)面試驗。

圖2 提取時間對藜麥蛋白提取率的影響

2.2.3 提取溫度對藜麥蛋白提取率的影響

由圖3可知，蛋白提取率隨著提取溫度的增加呈先上升后下降的趨勢，在45 ℃時達到最大。當(dāng)提取溫度為35～45 ℃時，隨著提取溫度的增加，藜麥蛋白提取率顯著上升；當(dāng)提取溫度為45～55 ℃時，藜麥蛋白提取率下降。這是由于升溫使蛋白質(zhì)分子運動加劇，有利于蛋白質(zhì)的溶解；但溫度過高，蛋白質(zhì)的內(nèi)部疏水基團會產(chǎn)生反應(yīng)，從而影響蛋白質(zhì)的提取率[14]。因此，選擇提取溫度40～50 ℃進行響應(yīng)面試驗。

圖3 提取溫度對藜麥蛋白提取率的影響

2.2.4 pH值對藜麥蛋白提取率的影響

由圖4可知，當(dāng)pH值為9.0～10.5時，藜麥蛋白的提取率顯著增加；當(dāng)pH值大于10.5時，藜麥蛋白的提取率增加緩慢。這是由于隨著pH的升高，帶負電荷的蛋白質(zhì)使分子間排斥力增強，增加蛋白質(zhì)溶出量；但pH過高可能會使蛋白分子間的氫鍵、離子鍵及空間結(jié)構(gòu)遭到破壞，使部分蛋白質(zhì)變性[15]。綜合考慮，選擇pH 10.0～11.0進行響應(yīng)面試驗。

圖4 pH值對藜麥蛋白提取率的影響

2.3 響應(yīng)面試驗

2.3.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

對料液比、提取時間、提取溫度、pH值進行優(yōu)化，以藜麥蛋白提取率為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。利用 Design Expert V8.0.6.1軟件設(shè)計試驗，結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

2.3.2 回歸模型擬合及方差分析

對表3結(jié)果進行回歸方程擬合，得到響應(yīng)面回歸方程：Y=+78.05+0.41A+0.57B+1.20C+2.03D+0.33AB+0.60AC-0.13AD+0.93BC+0.34BD+0.83CD-7.00A2-5.18B2-6.49C2-5.44D2。

回歸模型方差分析見表4。

表4 回歸模型方差分析

續(xù) 表

由表4可知，該模型的P值<0.0001，失擬項不顯著(P=0.0659>0.05)，相關(guān)系數(shù)R2=0.9934，說明模型極其顯著，可較好地反映藜麥蛋白提取中各因素與響應(yīng)值的關(guān)系并預(yù)測最佳提取條件。由P值大小可知，C、D影響極顯著，A影響顯著，B影響較顯著。由F值可知，影響藜麥蛋白提取率的因素主次順序為pH值>提取溫度>提取時間>料液比。

2.3.3 響應(yīng)面分析

利用Design Expert V8.0.6.1軟件，得到AC、BC和CD的交互作用對藜麥蛋白提取率影響的等高線圖及3D響應(yīng)面圖，見圖5。

圖5 AC、BC和CD交互作用對藜麥蛋白提取率的影響

由圖5可知，AC、BC和CD交互作用的等高線圖均變化較明顯，且BC和CD等高線呈橢圓形，說明AC、BC和CD的交互作用對藜麥蛋白提取率的影響較顯著；3D圖中，AC、BC和CD交互作用的曲線較陡峭，且隨著因素水平的增加，藜麥蛋白提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。

2.3.4 驗證試驗

分析響應(yīng)面試驗結(jié)果，得到藜麥蛋白的最佳提取條件為：料液比1∶12.07 (g/mL)、提取時間2.54 h、提取溫度45.56 ℃、pH 10.60，預(yù)測蛋白提取率為78.35%。在實際操作過程中，將最佳提取條件調(diào)整為：料液比1∶12.0 (g/mL)、提取時間2.5 h、提取溫度46 ℃、pH 10.5，進行3次驗證試驗，得到蛋白提取率為(78.86±0.79)%，與預(yù)測值接近，說明該模型能夠較好地反映藜麥蛋白提取率。采用凱氏定氮法對藜麥蛋白粉的純度進行測定，結(jié)果為87.58%。

2.4 藜麥蛋白功能特性的研究

2.4.1 溶解性

溶解性是蛋白質(zhì)的重要功能特性之一，與其乳化性、持水性、起泡性等多項功能特性有關(guān)。由圖6可知，當(dāng)pH值為4時，溶解性最差，僅為35.11%；當(dāng) pH值大于4時，溶解性顯著提高。這是因為溶液在堿性環(huán)境中蛋白遠離等電點，可能是較高的pH值導(dǎo)致蛋白質(zhì)內(nèi)部因靜電排斥而造成分子伸展，進而提高了蛋白溶解性[16]。

圖6 pH值對藜麥蛋白溶解性的影響

2.4.2 乳化性與乳化穩(wěn)定性

乳化性是指蛋白質(zhì)在單位質(zhì)量下能維持油水界面的面積；乳化穩(wěn)定性是指蛋白質(zhì)維持穩(wěn)定狀態(tài)且與水或油混合不產(chǎn)生兩相分層不穩(wěn)定現(xiàn)象的特性。由圖7可知，隨著pH的增加，藜麥蛋白的乳化性與乳化穩(wěn)定性均為先下降后上升，當(dāng)pH為4時達到最小。這是由于蛋白在等電點處的溶解度最低，導(dǎo)致溶液不能迅速固定在油與水界面上；之后隨著pH值增加，蛋白表面的負電荷增加，使其排斥作用增強，致使蛋白水化層厚度也增加，從而增加了蛋白的乳化穩(wěn)定性[17]。

圖7 pH值對藜麥蛋白乳化性與乳化穩(wěn)定性的影響

2.4.3 起泡性與泡沫穩(wěn)定性

蛋白質(zhì)的起泡性是指蛋白質(zhì)起泡的能力，泡沫穩(wěn)定性是指維持穩(wěn)定泡沫的能力。由圖8可知，當(dāng)pH為4時，起泡性與泡沫穩(wěn)定性都達到最低；之后隨著pH的增加，起泡性與泡沫穩(wěn)定性都有不同程度的增加。這是因為在堿性環(huán)境中，蛋白質(zhì)的凈電荷增加，減弱了疏水相互作用力，使得蛋白質(zhì)容易分散到水與空氣界面，使界面得以加強，促進泡沫的形成和穩(wěn)定[18]。

圖8 pH值對藜麥蛋白起泡性與泡沫穩(wěn)定性的影響

2.4.4 持水性

蛋白質(zhì)持水性是指蛋白質(zhì)截留水、阻止水滲出的能力。由圖9可知，當(dāng)pH為4時，持水性達到最低，為1.84 g/g；當(dāng)pH為4～10時，蛋白的持水性明顯升高，之后趨于平穩(wěn)。這是由于當(dāng)pH值處于等電點時，蛋白質(zhì)分子總電荷為零，分子間相互作用最大，使蛋白質(zhì)締合和收縮，呈現(xiàn)最低的膨脹和水化，pH值增加，蛋白質(zhì)膨脹和水化性能也增加，使持水能力變強[19]。

圖9 pH值對藜麥蛋白持水性的影響

2.4.5 持油性

持油性是指蛋白質(zhì)結(jié)合脂質(zhì)的能力。由圖10可知，pH為4時持油性最低；隨著pH的增加，蛋白的持油性升高。這是由于當(dāng)pH在蛋白等電點附近時，蛋白容易聚集沉淀，持油性最?。浑S著pH的升高，蛋白分子發(fā)生伸展、解離，內(nèi)部非極性鍵暴露，進而增加與油脂結(jié)合能力[20]，使蛋白持油性提高。

圖10 pH值對藜麥蛋白持油性的影響

3 結(jié)論

通過單因素試驗并結(jié)合Box-Behnken試驗設(shè)計的方法，得到藜麥蛋白最佳提取條件為：料液比1∶12.0 (g/mL)、提取時間2.5 h、提取溫度46 ℃、pH 10.5，此時蛋白提取率為(78.86±0.79)%，純度為87.58%。此外，藜麥蛋白有較好的溶解性和起泡性，一定的持水(油)性和乳化穩(wěn)定性，較差的乳化性。pH值對藜麥蛋白的功能特性有顯著影響，即當(dāng)溶液pH在藜麥蛋白等電點附近時，蛋白的溶解性、乳化性、乳化穩(wěn)定性均較差；當(dāng)pH偏離等電點時，上述功能特性均得到不同程度的提高，該研究對藜麥相關(guān)產(chǎn)品的加工或貯藏過程有著重要作用，可增加藜麥蛋白利用率。