燕 霞 蘇小艷 馬 銳 張東升 李 林 齊敦武 李運莉 岳嬋娟 馮 娜 侯 蓉* 劉頌蕊*

(1.成都大熊貓繁育研究基地，四川省瀕危野生動物保護(hù)生物學(xué)重點實驗室，成都，610081；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，長春獸醫(yī)研究所，長春，130122)

大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)是我國特有的旗艦物種[1]，根據(jù)第4次野生大熊貓調(diào)查顯示，全國野生大熊貓種群數(shù)量達(dá)1 864只[2]，截至2019年11月12日，全球圈養(yǎng)大熊貓數(shù)量已達(dá)600只[3]。盡管在中國政府和其他相關(guān)單位的保護(hù)下，大熊貓由瀕危物種(EN)降級為易危(VU)，但其生存狀態(tài)仍受到保護(hù)區(qū)周邊家養(yǎng)犬的威脅。犬可以捕殺本地獵物，包括大型哺乳動物(Mammalia)，目前已發(fā)現(xiàn)其與數(shù)十種物種的滅絕有關(guān)[4]。自由放養(yǎng)的犬在單獨行動時最多可移動30 km，棲息地可達(dá)28.5 km2[5]。與大多數(shù)熊科(Ursidae)動物一樣，大熊貓在歷史上曾被犬獵殺[6]。保護(hù)區(qū)工作人員觀察到有犬在大熊貓保護(hù)區(qū)內(nèi)活動，已經(jīng)證實保護(hù)區(qū)內(nèi)犬的活動會導(dǎo)致大熊貓棲息地破碎化，并嚴(yán)重干擾大熊貓的正常生活節(jié)律[7-8]。

保護(hù)區(qū)內(nèi)大熊貓還易受到犬?dāng)y帶的犬瘟熱(Canine distemper virus，CDV)等病毒性疾病的威脅[9]。早在1994年，在四川臥龍自然保護(hù)區(qū)大熊貓和周邊犬的體內(nèi)檢測到了犬瘟熱病毒和犬冠狀病毒(Canine coronavirus，CCV)抗體[10]。犬常攜帶CDV、細(xì)小病毒(Parvovirus，PV)、輪狀病毒(Rotavirus，RV)和狂犬病病毒(Rabies virus，RABV)，其中CDV、PV和RV能感染并導(dǎo)致大熊貓發(fā)病，甚至造成死亡。2014年12月—2015年4月，陜西省珍稀野生動物搶救飼養(yǎng)研究中心的6只圈養(yǎng)大熊貓相繼感染CDV而發(fā)病，其中5只治療無效死亡[11]。成都和重慶兩動物園的大熊貓血清學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，大熊貓PV感染陽性率達(dá)50%，臨床特征表現(xiàn)為出血性小腸炎[12]。王成東等[13]報道某基地在2001年有17只幼齡大熊貓(5～11月齡)先后感染RV，其中1只6月齡大熊貓在發(fā)病4 d后多器官功能衰竭死亡。2000—2003年，成都大熊貓繁育研究基地的大熊貓源RV病發(fā)病率為64.7%[14]。狂犬病為一種自然疫源性疫病，雖然目前未有大熊貓感染該病的報道，但該病為人畜共患病，一旦發(fā)病，病死率高達(dá)100%。

盡管犬對保護(hù)區(qū)內(nèi)大熊貓等野生動物造成了巨大威脅，但全面捕捉和獵殺保護(hù)區(qū)內(nèi)犬的實際意義不大：一方面放牧和守護(hù)家園需要，村民會繼續(xù)購買犬飼養(yǎng)；另一方面犬可作為示警動物，有助于及時發(fā)現(xiàn)保護(hù)區(qū)內(nèi)犬瘟熱等病毒的流行情況，避免犬瘟熱等病毒給保護(hù)區(qū)內(nèi)大熊貓等野生動物帶來毀滅性的危害。因此，在保護(hù)區(qū)周邊潛在風(fēng)險區(qū)域建立免疫隔離帶是防控病毒病的一個行之有效的辦法。本研究對大熊貓保護(hù)區(qū)潛在風(fēng)險區(qū)域內(nèi)犬的飼養(yǎng)情況(數(shù)量、飼養(yǎng)方式、體重和體長、性別)開展調(diào)查，為大熊貓自然保護(hù)區(qū)制定犬的管控措施提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)；對犬?dāng)y帶的CDV、PV、RV和RABV進(jìn)行監(jiān)測以評估病毒對野生大熊貓和人類健康的影響。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

將與大熊貓自然保護(hù)區(qū)直線距離5 km內(nèi)的村落定義為潛在風(fēng)險區(qū)域。2019年5月21—24日，在2個自然保護(hù)區(qū)潛在風(fēng)險區(qū)域的5個行政村(瓦屋山自然保護(hù)區(qū)的燕遠(yuǎn)村、黑山村、孔雀村和長河村；大相嶺自然保護(hù)區(qū)的發(fā)展村)內(nèi)采集78只犬口腔拭子和55只犬血樣。

1.2 犬的飼養(yǎng)狀態(tài)、體型統(tǒng)計及疫苗免疫

2019年5月21—24日，通過實地走訪和問卷調(diào)查等方式向瓦屋山和大相嶺大熊貓自然保護(hù)區(qū)潛在風(fēng)險區(qū)域內(nèi)的養(yǎng)犬村戶了解犬的飼養(yǎng)方式(拴養(yǎng)或散養(yǎng))，稱量和測量犬的體重和身長，并記錄。參考趙九洲等[15]的研究，定義體重≤4 kg、身長≤25 cm的犬為超小型犬；體重5～10 kg、身長26～40 cm的犬為小型犬；體重11～30 kg、身長41～60 cm的犬為中型犬；體重31～40 kg、身長61～70 cm的犬為大型犬。在村民自愿的原則下，免費為調(diào)查犬提供犬瘟熱、腺病毒2型、副流感和細(xì)小病毒病四聯(lián)活疫苗(以下簡稱犬瘟熱四聯(lián)苗，購自Zoetis公司)。

1.3 引物設(shè)計與合成

CDV引物的設(shè)計和合成參考張煥容等[16]的研究；PV選擇通用引物[17]；從GenBank中下載CRV毒株A79-10/G3P[3](ID：EU708939.1)、CU-1(ID：EU708917.1)、K9(ID：EU708928.1)、RVA/Dog-tc/ITA/RV52-96/1996/G3P[3](ID：HQ661128.1)和GPRV毒株CH-1(ID：GU188284.1)的VP7蛋白全基因序列，通過DNAMAN 8分析各序列保守區(qū)域，利用Oligo7分別設(shè)計針對CRV和GPRV的2對引物(CRV和GPRV1)，并參考雷燕等[18]研究中的GPRV引物(GPRV2)作進(jìn)一步驗證(表1)。以上引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 犬口腔拭子病毒的PCR擴增與檢測

在生物安全柜內(nèi)，將78份口腔拭子棉花頭分別置于1.5 mL離心管內(nèi)，加入700 μL無菌生理鹽水，振蕩30 s，12 000 r/min離心5 min后取液體按照試劑盒說明書提取病毒RNA和DNA(TaKaRa?病毒RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；AXYGEN?病毒DNA提取試劑盒購自康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司)，將病毒RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA(TaKaRa?反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司)。cDNA產(chǎn)物和DNA產(chǎn)物于-20 ℃保存。PCR反應(yīng)體系(25.0 μL)：模板DNA(或cDNA)2.0 μL，TaqMIX(2×)12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，ddH2O 8.5 μL。CDV擴增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。PV擴增條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃終延伸7 min。RV擴增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃終延伸7 min。取擴增產(chǎn)物在110 V條件下，1%瓊脂糖凝膠電泳30 min，PCR陽性產(chǎn)物經(jīng)Qiaquick PCR純化試劑盒(德國QIAGEN有限公司)純化后送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，將測序結(jié)果在NCBI中比對，確定病毒種類。下載不同物種源的病毒基因組序列，使用MEGA 7中Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，分析陽性病毒序列的親緣性。由于運用PCR檢測RABV病原須在生物安全2級實驗室進(jìn)行，而本實驗室未達(dá)標(biāo)準(zhǔn)，故本研究未進(jìn)行RABV病原的PCR擴增與檢測。

1.5 犬血清中狂犬病病毒中和抗體效價檢測

調(diào)查犬在本次采集血樣前均未進(jìn)行RABV疫苗免疫，故檢測調(diào)查犬血清中RABV的抗體水平能大致掌握調(diào)查犬RABV的既往感染史。在長春獸醫(yī)研究所采用中和抗體法檢測調(diào)查犬血清中RABV抗體效價。試驗步驟參考杜曉鵬等[19]的研究，以犬血清RABV中和抗體效價≥0.50 IU/mL為陽性標(biāo)準(zhǔn)，達(dá)到或超過0.50 IU/mL，即對RABV具有有效的保護(hù)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 犬的飼養(yǎng)狀態(tài)、體型統(tǒng)計及疫苗免疫結(jié)果

瓦屋山和大相嶺大熊貓自然保護(hù)區(qū)潛在風(fēng)險區(qū)域家養(yǎng)犬共計178只，其中51.7%(92/178)的犬為自由散養(yǎng)狀態(tài)，48.3%(86/178)的犬為拴養(yǎng)。中型犬占47.2%(84/178)，小型犬占38.8%(69/178)，超小型犬和大型犬分別占10.7%(19/178)和3.3%(6/178)。中型犬和小型犬占比大，合計為86.0%；大相嶺保護(hù)區(qū)潛在風(fēng)險區(qū)域內(nèi)犬的數(shù)量(119只)明顯高于瓦屋山保護(hù)區(qū)(59只)(表2)，對其中158只犬進(jìn)行了犬瘟熱四聯(lián)苗免疫，免疫率達(dá)88.8%(158/178)。

表2 大相嶺和瓦屋山自然保護(hù)區(qū)潛在風(fēng)險區(qū)域家養(yǎng)犬情況

2.2 犬口腔拭子CDV、PV和RV抗原檢測結(jié)果

采用PCR技術(shù)對78份犬口腔拭子樣本進(jìn)行CDV、PV和RV抗原檢測，結(jié)果顯示：CDV和PV均為陰性；采用GPRV1引物擴增，陽性樣品在743 bp出現(xiàn)目的條帶(圖1A)，采用GPRV2引物擴增，陽性樣品在342 bp出現(xiàn)目的條帶(圖1B)，2種引物的陽性樣品具有完全一致性，陽性率均為76.9%(60/78)。對所有GPRV1和GPRV2陽性樣品的PCR產(chǎn)物回收測序后在NCBI中比對，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物與大熊貓源RV同源性最高。隨機選取4份RV陽性樣品構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，分析結(jié)果顯示：陽性RV與大熊貓源RV(GU188284.1)的親緣性最高，與人源、犬源、貓源和豬源RV的親緣性均較低(圖2)。綜上表明，犬?dāng)y帶的RV與大熊貓源RV同源率為100%，為大熊貓源RV。

圖1 部分陽性輪狀病毒樣品的RT-PCR檢測結(jié)果Fig.1 Detection of RT-PCR amplification for part of RV positive samples 注：M.DL5000 DNA Marker；1.生理鹽水作為陰性對照；2.輪狀病毒陽性對照；3～10.部分輪狀病毒陽性樣品 Note：M，DL5000 DNA Marker.l，Normal saline for negative control.2，RV positive control.3-10，Part of RV positive samples

圖2 部分陽性輪狀毒株序列發(fā)育進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree for part of RV positive isolates

2.3 犬血清中狂犬病病毒中和抗體效價結(jié)果

通過中和抗體法對犬血清中RABV抗體效價進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示55份血清中有7份中和抗體效價≥0.50 IU/mL，說明僅12.7%(7/55)的犬?dāng)y帶具有保護(hù)效力的抗體(表3)。

表3 犬血樣中狂犬病病毒抗體效價

3 討論

近年來，野生大熊貓的棲息地破碎化嚴(yán)重，部分大熊貓種群仍然面臨生存風(fēng)險[20]，而放牧家畜已成為大熊貓生境中最主要的干擾因素[21-23]。我國大熊貓保護(hù)區(qū)多地處中西部山區(qū)，由于歷史和地理因素的限制，保護(hù)區(qū)內(nèi)仍有村民居住，村民散養(yǎng)犬較多，幾乎不進(jìn)行防疫。犬因食物匱乏，自由覓食，活動地區(qū)常與野生大熊貓活動地區(qū)重疊[24]。進(jìn)入保護(hù)區(qū)的犬有可能大幅減少大熊貓有效棲息地面積，Callan等[7]2020年對栗子坪自然保護(hù)區(qū)大熊貓棲息地普查，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)大熊貓(86.0%)的活動地點都集中在偏遠(yuǎn)的“無犬區(qū)”；滕繼榮等[8]對甘肅白水江國家級自然保護(hù)區(qū)林緣社區(qū)飼養(yǎng)犬只對大熊貓時空節(jié)律產(chǎn)生的影響展開調(diào)查，發(fā)現(xiàn)犬活動范圍與大熊貓潛在棲息地存在28.2%的區(qū)域重疊，犬給大熊貓的活動節(jié)律帶來顯著影響。本研究發(fā)現(xiàn)，2個自然保護(hù)區(qū)潛在風(fēng)險區(qū)域內(nèi)的散養(yǎng)犬居多，以中型犬和雄犬為主，家養(yǎng)犬大多未做常規(guī)疫苗免疫。筆者通過紅外相機發(fā)現(xiàn)犬進(jìn)入保護(hù)區(qū)的現(xiàn)象，保護(hù)區(qū)潛在風(fēng)險區(qū)域內(nèi)犬對大熊貓等野生動物構(gòu)成了威脅。大相嶺保護(hù)區(qū)潛在風(fēng)險區(qū)域內(nèi)家養(yǎng)犬119只，比瓦屋山保護(hù)區(qū)多50.4%，以散養(yǎng)為主，由此推測大相嶺自然保護(hù)區(qū)內(nèi)大熊貓等野生動物受周圍犬的干擾更大。

犬是雜食動物，不僅會捕殺野生動物，與野生動物競爭獵物，還可能將自身感染的疾病傳播給野生動物。犬?dāng)y帶的常見病原，如CDV、PV和RV都可感染大熊貓。CDV的自然宿主從最初的犬科(Canidae)動物不斷擴大至貓科(Felidae)、鬣狗科(Hyaenidae)、浣熊科(Procyonidae)、熊科和小熊貓科(Ailuridae)等[25-26]。1983年就有關(guān)于大熊貓死于CDV繼發(fā)細(xì)菌病的報道[27]；李金中等[28]于1999年用特異性CDV引物從死亡大熊貓肝臟中檢測出陽性樣本，經(jīng)基因序列對比分析進(jìn)一步證實了大熊貓能夠感染CDV。臨床發(fā)現(xiàn)，大熊貓一旦感染上CDV，致死率幾乎高達(dá)100%，已成為威脅大熊貓和小熊貓(Ailurusfulgens)種群數(shù)量的主要烈性傳染病[29-30]。PV感染后可引發(fā)動物感染病毒性腸炎和幼崽心肌炎[31]，常見的有犬、狐、貂和貓等。據(jù)文獻(xiàn)報道，有大熊貓因自然感染PV而發(fā)生腸炎的情況[12]。本試驗所測樣本表明，2019年5月瓦屋山和大相嶺自然保護(hù)區(qū)潛在風(fēng)險區(qū)域內(nèi)的家養(yǎng)犬均未攜帶CDV和PV，由于未進(jìn)行血清抗體檢測，犬是否曾經(jīng)感染過這2種病毒需進(jìn)一步研究。

RV臨床上以腹瀉為特征，主要發(fā)生在幼犬中，成年犬一般不表現(xiàn)癥狀或癥狀輕微，目前尚無有效疫苗[32]。大熊貓源RV主要感染幼齡大熊貓(5～11月齡)，引起幼齡大熊貓腹瀉甚至死亡。由于成年大熊貓感染RV多為隱性經(jīng)過，并持久地向外界排毒，RV對環(huán)境因子和許多常見消毒劑有較強的抵抗力，導(dǎo)致某一地區(qū)發(fā)病后會連續(xù)發(fā)病[14]，這給大熊貓的繁育、健康及野化放歸帶來重大威脅。YAN等[33]前期對栗子坪自然保護(hù)區(qū)周邊犬只開展疾病調(diào)查也發(fā)現(xiàn)犬的血清中含有RV抗體。本研究根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中犬源RV和大熊貓源RV序列均設(shè)計了引物，以雷燕等[18]研究中的大熊貓源RV引物作了進(jìn)一步驗證，電泳和親緣關(guān)系分析結(jié)果均表明保護(hù)區(qū)潛在風(fēng)險區(qū)域內(nèi)犬?dāng)y帶的RV并非犬源RV，而是大熊貓源RV，推測可能是散養(yǎng)犬進(jìn)入大熊貓保護(hù)區(qū)內(nèi)感染了大熊貓源RV，將病毒帶回潛在風(fēng)險區(qū)域內(nèi)，造成了犬的大面積感染。由于缺少野生大熊貓相關(guān)樣本，這種推測無法得到驗證。眾所周知，野生大熊貓為獨居動物，自身攜帶的病毒在大熊貓間相互傳染的概率相對較低，但是犬為群居動物，在保護(hù)區(qū)內(nèi)大范圍活動，由犬?dāng)y帶的病毒可在野生大熊貓種群中擴散，威脅野生大熊貓種群的健康，這一問題需要引起關(guān)注。保護(hù)區(qū)潛在風(fēng)險區(qū)域內(nèi)的家養(yǎng)犬有可能進(jìn)一步將自身攜帶的RV回傳給大熊貓，因此，建立免疫隔離帶和勸導(dǎo)村民拴養(yǎng)犬，對保障大熊貓種群健康具有十分重要的意義。

狂犬病是RABV所致的急性傳染病，由犬傳播，目前尚缺乏有效的治療手段，人患狂犬病后的病死率近100%，故應(yīng)加強預(yù)防措施[34]。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，部分犬(12.7%)具有有效的狂犬病保護(hù)性抗體，而當(dāng)?shù)剡@些犬基本上未接種過狂犬病疫苗，說明該地區(qū)的犬曾接觸過RABV。雖暫未發(fā)現(xiàn)大熊貓感染狂犬病的病例，但其作為一種人獸共患性傳染病，威脅了當(dāng)?shù)鼐用窈腿苿游锏慕】?，?yīng)倡導(dǎo)村民對家養(yǎng)犬接種狂犬病疫苗，減低患病及傳染風(fēng)險。

犬接種疫苗可有效預(yù)防犬瘟熱等疾病，目前市場上成熟的犬用疫苗產(chǎn)品很多，但尚無大熊貓用疫苗產(chǎn)品。本研究在村民自愿的前提下，對保護(hù)區(qū)潛在風(fēng)險區(qū)域內(nèi)的158只家養(yǎng)犬接種了犬瘟熱四聯(lián)苗，在大熊貓自然保護(hù)區(qū)潛在風(fēng)險區(qū)域建立犬瘟熱和細(xì)小病毒的免疫隔離帶。劉小斌等[24]通過接種疫苗在佛坪大熊貓保護(hù)區(qū)建立犬瘟熱免疫隔離帶，取得了較好的效果。本研究會在后期持續(xù)調(diào)查免疫犬的抗體水平，并每年進(jìn)行疫苗免疫接種。

綜上所述，野生大熊貓在人類等相關(guān)活動的影響下，生存空間逐步縮小且面臨各種疾病的威脅，需定時對保護(hù)區(qū)周邊犬開展流行病學(xué)調(diào)查、疫苗免疫和建立免疫隔離帶，可有效阻斷犬瘟熱等疾病的傳播。同時，聯(lián)系當(dāng)?shù)乇Ｗo(hù)區(qū)管理局，加強犬的科學(xué)飼養(yǎng)宣傳，減輕對大熊貓等野生動物的干擾和影響。

致謝：感謝滎經(jīng)縣大相嶺自然保護(hù)區(qū)管理局和大熊貓國家公園眉山管理分局工作人員及地方政府工作人員對本研究開展犬調(diào)查、犬免疫接種及采樣等工作的支持和幫助；感謝保護(hù)區(qū)周邊養(yǎng)犬村民的大力配合；感謝本部門同事向波、陳麗和李雯靜進(jìn)行文明養(yǎng)犬的科普宣傳工作。