林 艷， 王福菊， 胡佳貞， 許 嵐， 張 鑫， 張忻佩， 趙蘊(yùn)芝， 樊伯珍

(1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200062； 2. 海軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，上海 200003)

高危型人乳頭瘤病毒(high-risk human papillo-mavirus， HR-HPV)是一組古老的微小無包膜病毒，HR-HPV的持續(xù)感染是導(dǎo)致組織癌變的必要因素[1]。宮頸位于陰道微生態(tài)環(huán)境中，陰道作為抵御病原體入侵及防止下生殖道感染的重要防線，其微生態(tài)的平衡狀態(tài)是防止HR-HPV感染乃至宮頸發(fā)生病變的重要條件[2]。對(duì)于宮頸持續(xù)性HR-HPV感染，西醫(yī)以祛除受染病灶及輔助免疫治療為主。干擾素雖為臨床常用藥物，但其轉(zhuǎn)陰率并不能讓人滿意。中醫(yī)將HR-HPV感染導(dǎo)致的宮頸相關(guān)癥狀歸屬于“帶下病”，局部多表現(xiàn)為濕熱阻滯之象。蜚蠊為血肉有情之品，在清熱利濕、調(diào)暢局部氣血方面效果尤為突出，且相關(guān)藥理學(xué)研究表明，蜚蠊尚有抗病毒、調(diào)節(jié)菌群及免疫應(yīng)答，甚至抗癌之功。本研究在干擾素陰道納入用藥的基礎(chǔ)上加以蜚蠊提取液陰道沖洗對(duì)宮頸持續(xù)性HR-HPV感染患者進(jìn)行治療，觀察分析兩組患者用藥的治療效果、用藥前后陰道微生態(tài)指標(biāo)及宮頸局部細(xì)胞免疫功能的變化情況，試圖探討蜚蠊提取液的療效及作用的可能途徑，為臨床中西醫(yī)結(jié)合治療宮頸持續(xù)性HR-HPV感染提供用藥依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2021年5月—2022年2月在上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院宮頸?？崎T診就診的宮頸持續(xù)性HR-HPV感染患者80例，按1∶1的比例隨機(jī)分配為研究組和對(duì)照組，其中研究組1例復(fù)診時(shí)因拒絕復(fù)查HR-HPV并只要求繼續(xù)用藥而剔除，對(duì)照組1例因離滬失訪，最終共78例完成臨床治療及治療后隨訪。兩組患者在年齡、絕經(jīng)情況、順產(chǎn)次數(shù)及宮頸病變程度方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 研究組和對(duì)照組一般資料比較

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.3 治療方法

對(duì)照組： 患者在月經(jīng)凈后第3天起開始用藥，睡前將重組人干擾素α-2b陰道泡騰膠囊(辛復(fù)寧： 800 000 IU/粒，上海華新生物高技術(shù)有限公司，S20050075)放置在陰道后穹隆，每晚1次，每次1粒，連續(xù)使用10 d為1個(gè)療程，下一個(gè)月經(jīng)周期同法使用，對(duì)于絕經(jīng)患者于每個(gè)月固定同一時(shí)間用藥，共3個(gè)療程。研究組： 受試者干擾素使用方法同對(duì)照組，于第11天開始單獨(dú)使用蜚蠊提取液(100 mL/瓶，四川好醫(yī)生攀西藥業(yè)有限責(zé)任公司，Z51021834)，每次25 mL，加入75 mL生理鹽水混勻后進(jìn)行陰道沖洗，每晚1次，連續(xù)使用10 d，兩藥序貫使用20 d為1個(gè)療程(序貫療法： 按順序連續(xù)治療。此處特指辛復(fù)寧先使用10 d后，立即進(jìn)行蜚蠊提取液10 d治療。)，下一周期同法使用，共3個(gè)療程。研究獲上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院倫理委員會(huì)同意(倫理審查批件號(hào)為PTEC-A-2021-53-1)。

1.4 觀察指標(biāo)及獲取數(shù)據(jù)方法

分別在治療前后對(duì)觀察指標(biāo)宮頸感染HR-HPV陽(yáng)性數(shù)、陰道微生態(tài)各評(píng)價(jià)指標(biāo)、宮頸局部細(xì)胞免疫水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及測(cè)定，治療前標(biāo)本收集： 在月經(jīng)凈后3～7 d間或絕經(jīng)患者就診時(shí)取樣，治療后標(biāo)本收集： 在3療程結(jié)束后第一次行經(jīng)凈后3～7 d間或絕經(jīng)患者用藥后1周取樣，取樣前3 d內(nèi)應(yīng)避免性生活、陰道灌洗和(或)陰道用藥。

1.4.1 樣本HR-HPV DNA載量測(cè)定采用美國(guó)FDA批準(zhǔn)的第二代基因雜交捕獲法(HCⅡ)檢測(cè)，載量≥1.0 pg/mL視為HR-HPV陽(yáng)性。

1.4.3 宮頸局部細(xì)胞免疫功能測(cè)定 患者取截石位，采集者將窺陰器輕柔置于陰道，擴(kuò)張以充分暴露宮頸。先取1支棉拭子清除宮頸口分泌物后，再用一次性采樣拭子輕柔插入宮頸口，朝同一方向旋轉(zhuǎn)5圈后停留片刻，而后將其緩慢取出。將采樣拭子加入4 mL無菌生理鹽水中混勻后4 ℃下離心(離心半徑10 cm，1 000 r/min，5 min)，分離上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)對(duì)CD4+T、CD8+T、TNF-α、IL-4及IL-6載量進(jìn)行檢測(cè)，試劑盒由上海研聆生物科技有限公司提供，操作參照說明書進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 治療后宮頸HR-HPV轉(zhuǎn)陰率

研究組宮頸感染HR-HPV轉(zhuǎn)陰率為61.54%(轉(zhuǎn)陰24例)，對(duì)照組轉(zhuǎn)陰率為33.33%(轉(zhuǎn)陰13例)，研究組轉(zhuǎn)陰率高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.221，P=0.013)。

2.2 陰道微生態(tài)評(píng)價(jià)指標(biāo)

分別對(duì)治療前后兩組顯微鏡下及干化學(xué)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，內(nèi)容主要包括陰道微生態(tài)失衡、LBG異常、加德納菌/擬桿菌、形似動(dòng)彎桿菌、革蘭陰性短桿菌、革蘭陽(yáng)性球菌、pH值異常、H2O2陽(yáng)性、LE陽(yáng)性、SNA陽(yáng)性、BV、AV檢出情況。

2.2.1 顯微鏡下比較 兩組治療前比較，陰道微生態(tài)失衡、LBG異常、加德納菌/擬桿菌、形似動(dòng)彎桿菌、革蘭陰性短桿菌、革蘭陽(yáng)性球菌、BV、AV檢出情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；研究組治療前后比較，陰道微生態(tài)失衡(χ2=6.642，P=0.010)、LBG異常(χ2=6.271，P=0.012)、革蘭陰性短桿菌(χ2=7.508，P=0.006)、革蘭陽(yáng)性球菌(χ2=8.419，P=0.004)及AV檢出(χ2=4.255，P=0.039)等方面治療后明顯改善，與治療前存在顯著性差異；對(duì)照組治療前后比較以上指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。研究組與對(duì)照組治療后比較，研究組微生態(tài)失衡情況的改善明顯優(yōu)于對(duì)照組(χ2=4.446，P=0.035)，見表2。

表2 研究組和對(duì)照組陰道微生態(tài)顯微鏡下比較

2.2.2 干化學(xué)比較 兩組治療前比較，在pH值異常、H2O2陽(yáng)性、LE陽(yáng)性、SNA陽(yáng)性方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩組治療后，以上指標(biāo)差異仍無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。研究組治療前后比較，pH值異常(χ2=4.198，P=0.040)、H2O2陽(yáng)性(χ2=5.769，P=0.016)治療后明顯改善(P<0.05)；對(duì)照組治療前后比較僅pH值異常有改善(χ2=7.429，P=0.006)，見表3。

表3 研究組和對(duì)照組陰道微生態(tài)干化學(xué)比較

2.3 宮頸局部細(xì)胞免疫

兩組治療前比較，在CD4+T、CD8+T、CD4/CD8、TNF-α、IL-4及IL-6方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；兩組治療后，研究組比對(duì)照組在CD4(t=-4.741，P<0.001)、CD8(t=-4.725，P<0.001)、CD4/CD8比值(Z=-5.022，P<0.001)、TNF-α(t=-4.912，P<0.001)、IL-4(t=-2.162，P=0.034)方面差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；研究組治療前后比較，CD4(t=-8.874，P<0.001)、CD8(t=7.246，P<0.001)、CD4/CD8比值(Z=-5.261，P<0.001)、TNF-α(t=11.213，P<0.001)、IL-4(t=4.945，P<0.001)及IL-6(t=2.533，P=0.016)方面差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對(duì)照組治療前后比較，CD4(t=-4.11，P<0.001)、CD4/CD8比值(Z=2.679，P=0.007)、TNF-α(t=-4.885，P<0.001)方面差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 研究組和對(duì)照組宮頸局部細(xì)胞免疫功能比較

3 討 論

宮頸在中醫(yī)中被稱作“子門”，是連接陰道和子宮的通道，對(duì)于通暢上下氣血、阻礙病邪入侵具有重要意義。根據(jù)臨床研究統(tǒng)計(jì)[4]，宮頸HR-HPV持續(xù)感染者的體質(zhì)以濕熱質(zhì)最甚，并極大比例表現(xiàn)為濕熱內(nèi)蘊(yùn)證候。HR-HPV對(duì)宮頸的持續(xù)感染實(shí)際上為濕熱瘀阻子門的一種特殊狀態(tài)。宮頸HR-HPV的持續(xù)感染目前已被證實(shí)與宮頸癌的發(fā)生有直接聯(lián)系[5]。因此，預(yù)防及治療宮頸HR-HPV的持續(xù)感染對(duì)防止宮頸癌的發(fā)生意義重大。目前對(duì)HR-HPV感染的預(yù)防臨床已有疫苗可以使用，但仍不能覆蓋所有高危型HPV，且普及尚有時(shí)日。而西醫(yī)治療包括免疫、藥物及局部手術(shù)，免疫治療雖是目前抗病毒的重點(diǎn)[6]，但無論是治療性疫苗還是免疫佐劑，其研發(fā)應(yīng)用仍有待漫長(zhǎng)的時(shí)日，現(xiàn)有的抗病毒藥物的治療作用有限，局部消融及手術(shù)僅能做到對(duì)受染組織的部分祛除，而對(duì)于散在分布的游離病毒卻束手無策。干擾素作為人體內(nèi)重要的細(xì)胞因子，可通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能以發(fā)揮抗病毒及抑制細(xì)胞異常增殖的作用，是目前用于宮頸HR-HPV持續(xù)感染的局部治療的主要藥物，但治療后HR-HPV的轉(zhuǎn)陰率較低，故干擾素在臨床常作為基礎(chǔ)用藥使用，并輔以其他藥物或物理治療以提高對(duì)病毒的清除效果[7]。本研究在對(duì)宮頸HR-HPV持續(xù)感染患者采用干擾素納陰的基礎(chǔ)上加以蜚蠊提取液陰道沖洗，經(jīng)3個(gè)療程治療后，較單用干擾素的對(duì)照組病毒轉(zhuǎn)陰率明顯提高(61.54%vs33.33%)，提示兩者的協(xié)同或蜚蠊提取液增強(qiáng)了干擾素對(duì)持續(xù)性HR-HPV感染的治療作用。蜚蠊提取液以蟲類中藥蜚蠊為主要成分，是清利濕熱，活血解毒之品?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》載蜚蠊：“主血瘀，癥堅(jiān)，寒熱。破積聚，喉咽閉，內(nèi)寒無子?！币蚱錇檠?，故尤適用于女性。在宮頸HR-HPV持續(xù)感染早期，患者多以帶下黃稠等局部濕熱證候?yàn)橹?，而尚未見明顯的全身證候。蜚蠊性味咸寒，有清利、活血之功，又因其生于陰濕之地，故可主帶下病之寒熱，恰適用于宮頸HR-HPV的早期感染。目前，蜚蠊提取液因其良好的創(chuàng)面修復(fù)作用[8]而廣泛應(yīng)用于臨床，這種對(duì)黏膜的修復(fù)作用可預(yù)防HR-HPV經(jīng)受損陰道黏膜入侵基底層上皮細(xì)胞，從而阻斷感染的發(fā)生。此外，蜚蠊提取液尚被報(bào)道具有抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)甚至抗癌之效能[9]。過去已有將蜚蠊提取液用于抗宮頸HR-HPV感染的隨機(jī)對(duì)照研究[10-11]，并顯示出較好的HR-HPV轉(zhuǎn)陰效果，但其觀察指標(biāo)多集中于療效及全身免疫功能的觀察，卻較少對(duì)陰道微生態(tài)改善情況及宮頸局部細(xì)胞免疫功能做出相關(guān)分析。

在本研究中，研究組的病毒轉(zhuǎn)陰率與陰道微生態(tài)平衡的恢復(fù)同步提升，提示蜚蠊提取液可能通過其清利濕熱，活血解毒之功效，促進(jìn)陰道微生態(tài)的功能修復(fù)，同時(shí)提示陰道微生態(tài)失衡與HR-HPV持續(xù)感染的高度相關(guān)性。陰道微生態(tài)由陰道菌群、局部免疫、內(nèi)分泌及解剖結(jié)構(gòu)四部分組成，其中又以菌群結(jié)構(gòu)及免疫功能表現(xiàn)出較大的可變性。乳桿菌作為正常陰道中的主要優(yōu)勢(shì)菌種，其數(shù)量與HR-HPV載量[12]及宮頸上皮內(nèi)病變進(jìn)展[13]呈負(fù)相關(guān)。Antonio等[14]通過比較不同乳桿菌的H2O2分泌能力發(fā)現(xiàn)，分泌H2O2能力強(qiáng)的加氏乳桿菌所主導(dǎo)的菌群結(jié)構(gòu)具有更快的病毒清除率，提示了HPV感染風(fēng)險(xiǎn)的增加與H2O2分泌不足存在關(guān)聯(lián)。本組資料中，干擾素加用蜚蠊提取液治療后，隨著HR-HPV的被清除，陰道內(nèi)H2O2陽(yáng)性數(shù)明顯低于治療前，也佐證了這一觀點(diǎn)。另一方面，在正常的內(nèi)分泌環(huán)境下，乳桿菌分解細(xì)胞內(nèi)糖原產(chǎn)生乳酸，通過降低局部pH值以維持正常陰道酸性環(huán)境。若乳桿菌的質(zhì)量下降，或是優(yōu)勢(shì)菌的地位受到動(dòng)搖，則將導(dǎo)致陰道菌群紊亂并由此引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)。根據(jù)現(xiàn)有研究報(bào)道，HR-HPV感染者以BV及AV為最常見的菌群失調(diào)狀態(tài)，同時(shí)也是乳桿菌質(zhì)量下降的另一種表現(xiàn)形式[15]。近期有研究顯示，AV的發(fā)生或許較BV在宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌的進(jìn)展中更為重要[16]。本研究中，HR-HPV感染者擁有很高的陰道微生態(tài)失衡率(76.92%，84.61%)，其中LBG為Ⅱb或Ⅲ級(jí)者達(dá)半數(shù)以上(58.97%，56.41%)，pH異常占61.54%及66.67%，提示了極其糟糕的陰道乳桿菌結(jié)構(gòu)及功能。且在治療前患者陰道中革蘭陰性短桿菌擁有很高的檢出率(71.79%，66.67%)，AV感染接近半數(shù)(53.85%，48.72%)，表現(xiàn)出明顯的需氧菌傾向，提示了其可能為宮頸HR-HPV持續(xù)感染的有利條件，也為臨床精準(zhǔn)治療提供了依據(jù)。王璐等[17]使用陰道乳桿菌制劑聯(lián)合干擾素治療宮頸HR-HPV感染，結(jié)果不僅出現(xiàn)陰道微生態(tài)失衡狀態(tài)的好轉(zhuǎn)，且其病毒轉(zhuǎn)陰率也遠(yuǎn)高于單用干擾素組，提示通過恢復(fù)以乳桿菌為優(yōu)勢(shì)菌的陰道微生態(tài)環(huán)境對(duì)HR-HPV清除的可行性。一項(xiàng)針對(duì)HR-HPV感染的薈萃分析顯示，局部應(yīng)用乳桿菌制劑或?qū)⑹且环N可行的促進(jìn)HPV清除的介入性方法[18]。研究組在使用蜚蠊提取液與干擾素治療后，這類指標(biāo)較單用干擾素治療得到明顯改善，不排除蜚蠊提取液清利濕熱，活血解毒的藥物特性，通過改善陰道內(nèi)正常優(yōu)勢(shì)乳桿菌的菌群結(jié)構(gòu)及功能而發(fā)揮作用的可能性，但由于研究樣本數(shù)及觀察時(shí)間的不足，對(duì)其確切發(fā)揮作用的途徑尚難明確。

宮頸與陰道本為一體，因處于同一微生態(tài)環(huán)境中，故宮頸局部免疫雖與陰道免疫相區(qū)別但又存在極大的相似性，皆與陰道菌群存在相互關(guān)聯(lián)。以T淋巴細(xì)胞為主導(dǎo)的細(xì)胞免疫是宮頸局部免疫的重要組成部分，主要分為CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞兩大類。CD4/CD8平衡的保持對(duì)抑制宮頸腫瘤發(fā)生具有重要意義，研究顯示[19]，CD4+T細(xì)胞減少及CD4/CD8比值的下降常預(yù)示著宮頸病變進(jìn)展甚至癌變等不良結(jié)局。CD8+T細(xì)胞主要介導(dǎo)細(xì)胞毒性作用；而CD4+T細(xì)胞通過分化為輔助T(Th)細(xì)胞1、Th2及調(diào)節(jié)性T(Treg)細(xì)胞進(jìn)一步調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。Th1/Th2作為衡量免疫功能的又一對(duì)重要指標(biāo)[20]，二者的分子程序具有相互對(duì)立性，其平衡的偏移意味著機(jī)體免疫功能的紊亂。其中Th1細(xì)胞可通過分泌IL-2、IFN-γ等多種細(xì)胞因子以增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能。IL-4作為Th2分泌的重要免疫因子，對(duì)正常的免疫應(yīng)答具有阻斷作用；TNF-α可介導(dǎo)嗜酸性細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，IL-6則進(jìn)一步趨化中性粒細(xì)胞，使得局部炎癥損傷程度進(jìn)一步加重。也有研究顯示陰道菌群可與宮頸局部免疫功能相互作用，保護(hù)宿主免受病毒感染，從而減少宮頸癌的發(fā)生[21]。本研究結(jié)果顯示，研究組CD4+T細(xì)胞、CD4/CD8較前明顯上升，CD8+T細(xì)胞、TNF-α、IL-4、IL-6則明顯下降，而對(duì)照組僅在CD4+T細(xì)胞、CD4/CD8及TNF-α方面較治療前有所改善。兩組比較，研究組免疫調(diào)節(jié)作用顯著優(yōu)于對(duì)照組，且陰道微生態(tài)環(huán)境得到明顯改善，提示了蜚蠊提取液對(duì)宮頸細(xì)胞免疫功能的改善作用，這種宮頸免疫應(yīng)答的修復(fù)有助于對(duì)持續(xù)性HR-HPV感染的清除，這或許是蜚蠊提取液其發(fā)揮抗病毒作用的重要機(jī)制。

綜上所述，宮頸持續(xù)性HR-HPV感染者多伴隨明顯的陰道微生態(tài)失衡，主要表現(xiàn)為乳桿菌質(zhì)與量的下降及由此引發(fā)的陰道微生態(tài)指標(biāo)異常及宮頸細(xì)胞免疫功能紊亂。蜚蠊提取液以其清利濕熱，活血解毒功效，與干擾素聯(lián)用可顯著提高對(duì)宮頸持續(xù)性HR-HPV感染的清除效果，同時(shí)較好地改善了陰道菌群紊亂狀態(tài)及宮頸局部細(xì)胞免疫功能，促進(jìn)了宮頸陰道微生態(tài)的恢復(fù)。但由于臨床觀察時(shí)間較短，藥物的遠(yuǎn)期療效還需要進(jìn)一步隨訪，以及實(shí)驗(yàn)室條件限制，沒對(duì)HR-HPV做詳細(xì)分型治療效果分析。也由于受到倫理的限制，本研究未能單獨(dú)使用蜚蠊提取液對(duì)宮頸持續(xù)性HR-HPV感染治療做出相應(yīng)指標(biāo)的觀察，有待后續(xù)進(jìn)一步研究。