勾泓荃， 卞知玄， 孫奮勇

(同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,上海 200072)

既往研究表明，mRNA常在細(xì)胞核中加工完成并出核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，mRNA的生命周期一般持續(xù)到在細(xì)胞質(zhì)中翻譯成蛋白質(zhì)，最后被降解[1]。但最近的研究發(fā)現(xiàn)，mRNA在進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后存在不同的結(jié)局。一部分mRNA被設(shè)定為“立即翻譯”，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后立即合成蛋白質(zhì)并隨之被降解或被儲存。同時(shí)，還有一部分mRNA被設(shè)定為“延遲翻譯”，即進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后暫時(shí)不參與翻譯過程，并被包裝成核糖核蛋白(ribonucleoprotein, RNP)顆粒，直到環(huán)境或某些特定條件激活其蛋白質(zhì)翻譯過程[2]。這些RNP顆粒是各種RNA和蛋白質(zhì)的無膜聚集體，它們存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，由蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和RNA-RNA之間的一系列相互作用形成[3]。RNP顆粒包括一些核顆粒如核仁、Cajal小體等以及一些存在于細(xì)胞質(zhì)的顆粒如應(yīng)激顆粒(stress granules, SGs)和P小體等[4]。

真核生物在面對各種外界脅迫(如熱刺激、氧化應(yīng)激、病毒感染、輻射等)時(shí)會做出特定的反應(yīng)，整體翻譯水平被抑制而應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)因子的表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中翻譯抑制的mRNA水平升高，最終形成被稱為SGs的細(xì)胞質(zhì)凝聚物[5-7]。因此，SGs是真核細(xì)胞在發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時(shí)所形成的凝聚物，它包含許多非翻譯mRNA、翻譯起始的組分和一些影響mRNA功能的蛋白質(zhì)[8]。由于SGs的形成使一些組分在胞質(zhì)中的局部濃度升高，這些組分的相互作用水平會增強(qiáng)以加快反應(yīng)的效率。例如在病毒誘導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)中，細(xì)胞的蛋白質(zhì)翻譯受到抑制，同時(shí)SGs中的真核起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α, eIF2α)激酶可高效激活NF-κB和IRF3這兩個(gè)先天免疫信號通路上的關(guān)鍵分子以招募抗病毒蛋白，啟動(dòng)抗病毒反應(yīng)[9]。了解SGs可以幫助進(jìn)一步理解真核細(xì)胞在應(yīng)對特殊環(huán)境時(shí)的復(fù)雜生物學(xué)過程。本綜述探討了SGs的結(jié)構(gòu)、組分及其形成，并強(qiáng)調(diào)了其與相分離之間的關(guān)系。

1 SGs的結(jié)構(gòu)與組分

近幾年的研究證實(shí)RNA顆粒的積累依賴于液-液相分離(liquid-liquid phase separations, LLPS)模式，mRNA與具有低復(fù)雜性結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)結(jié)合所形成的復(fù)合物在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生相變而形成液滴[10]。這些在應(yīng)激條件下在局部形成的液滴細(xì)胞器，增加了RNA和蛋白質(zhì)的局部濃度，從而有利于下游通路的相互作用[11]并發(fā)揮不同功能，如DNA修復(fù)[12]，跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[13]等，并在應(yīng)激條件停止時(shí)溶解[14]。有研究指出SGs的形成也是一種相分離過程，由于任何大于二聚體的組裝都需要多價(jià)相互作用才能形成，而SGs是通過翻譯沉默的mRNP交聯(lián)形成的，組分之間的多價(jià)相互作用通過相分離得以形成高階結(jié)構(gòu)[7]。SGs的這種高階內(nèi)部結(jié)構(gòu)又被分為兩部分，一是通過顯微鏡技術(shù)發(fā)現(xiàn)的中心具有更高濃度的蛋白質(zhì)與mRNA區(qū)域的“核心”結(jié)構(gòu)，二是核心結(jié)構(gòu)周圍環(huán)繞著的略顯松散但更富有動(dòng)態(tài)性的“外殼”結(jié)構(gòu)[7,15]。SGs在初形成時(shí)可能先通過LLPS以多價(jià)的、弱的相互作用形成一個(gè)動(dòng)態(tài)的“外殼”結(jié)構(gòu)。隨著時(shí)間的推移，低復(fù)雜性結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)在內(nèi)部持續(xù)過飽和，一個(gè)乏動(dòng)態(tài)、更穩(wěn)定的第二相會成熟，從而產(chǎn)生SGs的“核心”結(jié)構(gòu)[7,16]。在“外殼”結(jié)構(gòu)中的組分可以與所在的環(huán)境組分快速交換，因此更為動(dòng)態(tài)，見圖1。而“核心”結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定，在這一結(jié)構(gòu)中，G3BP蛋白被認(rèn)為是SGs核心網(wǎng)絡(luò)中最高中心性的蛋白質(zhì)，并且G3BP1在存在游離RNA的情況下，強(qiáng)烈自發(fā)相分離，并促進(jìn)了細(xì)胞中SGs的組裝[17-18]。相似的，在與神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)的SGs中發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì)濃度依賴性相分離驅(qū)動(dòng)SGs的組裝，并且該蛋白質(zhì)濃度存在最低閾值[19]。由此可見，相分離在SGs的組裝中承擔(dān)了重要的角色。

圖1 SGs內(nèi)部結(jié)構(gòu)的形成Fig.1 Formation of SGs internal structure

2 SGs的組裝與解聚是一種相分離過程

2.1 相分離的概念

就像水里的油一般，細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)可以被分離成一個(gè)個(gè)液滴，而這開創(chuàng)了細(xì)胞生物學(xué)的新紀(jì)元[20]。Brangwynne等[21]于2009年發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)顆粒會像液體那樣融合，并以一種特殊的方式讓細(xì)胞內(nèi)的特定分子聚集起來，從而在“混亂”的細(xì)胞內(nèi)部創(chuàng)造“秩序”。從分子角度可以更好地理解相分離，大分子與大分子以及與溶液間普遍存在著弱的、低親和力的、缺乏特異性的相互作用。當(dāng)大分子間的相互作用弱于大分子與溶質(zhì)之間的相互作用時(shí)，則意味著大分子可與任何濃度的溶液混溶，即該溶液是該大分子的良好溶劑。反之亦然，當(dāng)大分子間的相互作用強(qiáng)于大分子與溶質(zhì)之間的相互作用時(shí)，則意味著大分子溶解度有限，傾向于發(fā)生相分離[22]。在這樣的體系中，當(dāng)大分子與大分子在獲得對其有利的能量后便可克服溶液保持均勻混合的熵趨勢，然后發(fā)生相分離現(xiàn)象。因此在一個(gè)大分子與溶劑的混合體系中將會分成兩相: 大體積、低濃度的“稀釋相”和小體積、高濃度的“濃縮相”。這樣的相分離狀態(tài)將會保持平衡，兩相中的化學(xué)勢能相等，因此在體系中會存在持續(xù)的濃縮隔室，形成液滴[23]。這些大分子凝聚形成的濃縮隔室提供了一個(gè)高濃度的“濃縮相”反應(yīng)條件，提供了一個(gè)獨(dú)特的細(xì)胞生化反應(yīng)環(huán)境，起到催化作用。例如Strulson等[24]通過建立體外細(xì)胞隔室調(diào)控RNA局部濃度，使核酶裂解活性增加了約70倍；Lu等[25]認(rèn)為相分離是控制轉(zhuǎn)錄與RNA加工的樞紐。

分散在細(xì)胞質(zhì)或核質(zhì)(“稀釋相”)中的RNA分子與蛋白質(zhì)分子通過相分離組裝形成RNP顆粒(“濃縮相”)[19,26]。這些RNP顆粒中的驅(qū)動(dòng)蛋白通常包含內(nèi)在無序區(qū)域(intrinsically disordered region, IDR)，這些IDR與多價(jià)相互作用驅(qū)動(dòng)的相分離蛋白形成有關(guān)[23,26]。SGs中的RNA結(jié)合蛋白(RNA-binding proteins, RBPs)上的多個(gè)IDR與SGs發(fā)生LLPS密切相關(guān)。Saito等[27]證明了RNA解旋酶DDX3X(DEAD-box helicase 3 X-linked)的N端IDR區(qū)域乙酰化會阻礙SGs的相分離過程。這些無序區(qū)域的翻譯后修飾(posttranslational modifications, PTMs)可以調(diào)控相分離蛋白的組裝與分解，因此IDR在SGs形成中具有重要作用[23]。此外，已有不少研究發(fā)現(xiàn)相分離與疾病密切相關(guān)，如一些神經(jīng)退行性疾病[28-32]、腫瘤[31,33-37]、感染性疾病[38-39]、遺傳性疾病[40-41]等都存在異常的相分離過程。

2.2 SGs的組裝

當(dāng)細(xì)胞內(nèi)整體翻譯水平受到抑制時(shí)，非翻譯的mRNP相互交聯(lián)聚集，形成SGs[7]。多項(xiàng)研究證明，G3BP是SGs蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)中的核心，其在SGs組裝中作為關(guān)鍵分子發(fā)揮作用[17,42-43]。G3BP是一種含有3個(gè)IDR的蛋白，由4個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其中主要由核轉(zhuǎn)運(yùn)因子2(nuclear transport factor 2, NTF2)樣和RNA識別區(qū)(RNA recognition motif，RRM)這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)了其向SGs中募集[44]。NTF2結(jié)構(gòu)域可介導(dǎo)與自身的相互作用，其通過與內(nèi)源性G3BP相結(jié)合而被招募到SGs中[45]。RRM結(jié)構(gòu)可憑借其與RNA的結(jié)合能力被募集至具有高濃度RNA的SGs中[46]。Yang等[17]證明G3BP1在SGs的組裝中起到分子開關(guān)的作用，G3BP1通過響應(yīng)胞內(nèi)RNA濃度的升高，誘導(dǎo)RNA依賴性相分離發(fā)生從而啟動(dòng)SGs的組裝。在正常的生理環(huán)境中，細(xì)胞質(zhì)中游離的非翻譯mRNA濃度較低，G3BP蛋白呈緊湊的“關(guān)閉”構(gòu)象，抑制其激活相分離的功能。在應(yīng)激條件誘導(dǎo)的整體翻譯停滯和多核糖體解離時(shí)，RNA會與G3BP結(jié)合引起G3BP的構(gòu)象轉(zhuǎn)變成“開放”構(gòu)象，從而允許其參與其他蛋白質(zhì)-RNA或蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用[47]。缺乏G3BP的細(xì)胞無法響應(yīng)eIF2α而無法形成SGs，但在滲透壓應(yīng)激中這類細(xì)胞仍然具有形成SGs的能力，這暗示存在其他的SGs組裝途徑[43]。Yang等[65]在葡萄糖缺乏的應(yīng)激條件下于酵母中發(fā)現(xiàn)Pbp1(PolyA binding protein-binding protein 1)可促進(jìn)SGs的組裝，但在熱休克應(yīng)激期間抑制SGs的形成。這提示SGs在不同的環(huán)境條件下可通過不同的途徑進(jìn)行組裝，但這都與可發(fā)生LLPS的蛋白密切相關(guān)。

2.3 SGs的解聚

雖然已經(jīng)有大量研究關(guān)注于細(xì)胞在各種壓力條件下的SGs組裝機(jī)制，但是對于SGs的解聚過程關(guān)注較少。Wheeler等[16]利用活細(xì)胞成像觀察亞砷酸鈉處理60 min后置于正常培養(yǎng)基中SGs的變化，發(fā)現(xiàn)較大的SGs被分解為較小的顆粒，隨后這些小顆粒發(fā)生解聚或被清除。SGs的外殼會首先消散，邊緣出現(xiàn)絲狀結(jié)構(gòu)，隨后其核心部分被分解或清除[16]。許多伴侶蛋白可影響SGs的解聚。Walters等[48]發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白70(heat shock protein 70， HSP70)和熱休克蛋白40(heat shock protein 40， HSP40)這兩類伴侶蛋白均在SGs中積累，這些蛋白的缺陷可能導(dǎo)致SGs的分解和清除減少。但HSP40的兩種不同的折疊(Ydj1蛋白和Sis1蛋白)在SGs解聚中的功能存在差異。Ydj1促進(jìn)SGs的分解和細(xì)胞整體翻譯水平的恢復(fù)，而Sis1蛋白促進(jìn)SGs的靶向自噬清除[48]。這揭示了SGs中不同結(jié)構(gòu)可以導(dǎo)致SGs不同的結(jié)局。

此外，SGs的命運(yùn)及其解聚機(jī)制也取決于其形成的原因和組裝的持續(xù)時(shí)間。例如通過慢性壓力或疾病突變產(chǎn)生的顆粒，會被自噬依賴性降解清除。而短時(shí)間刺激形成的顆粒會迅速分解以回收組分。研究報(bào)道在熱休克的情況下，SGs中的G3BP1發(fā)生泛素化修飾，解聚時(shí)，泛素化G3BP1退出顆粒核心并降解，SGs網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的驅(qū)動(dòng)力降低到相分離的滲透閾值以下，促使細(xì)胞分解SGs并在消除應(yīng)激后重新啟動(dòng)正常的細(xì)胞活動(dòng)[5]。SGs的清除異常會使胞內(nèi)蛋白質(zhì)異常凝聚。Marmor-Kollet等[49]利用基于工程抗壞血酸過氧化物酶(engineered ascorbate pero-xidase, APEX)的距離依賴性標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，通過對SGs解聚的時(shí)間軸分析揭示了9號染色體開放閱讀框72(chromosome 9 open reading frame 72, C9orf72)對SGs解聚的影響以及其對于肌萎縮側(cè)索硬化癥發(fā)病的影響。這也提示了SGs的解聚或清除異?？赡軙?dǎo)致某些疾病。

3 相分離與SGs的研究方法

研究SGs的方法多樣，有研究利用亞砷酸鹽誘導(dǎo)人骨肉瘤細(xì)胞U2OS細(xì)胞中SG的組裝，使用小干擾RNA(small interfering RNAs, siRNA)篩選的方法鑒定了101個(gè)與SG組裝有關(guān)的人類基因[50]。也可以采用親和層純化的方法(如通過GFP標(biāo)記G3BP)與質(zhì)譜分析結(jié)合使用，以確定SG中所富集的蛋白質(zhì)[15]。相似的，Goodier等[51]利用酵母雙雜交系統(tǒng)通過與SGs蛋白LINE-1 ORF1p(long inte-rspersed element-1 open reading frame 1 protein)進(jìn)行免疫共沉淀確定了幾種RBPs和SGs相關(guān)蛋白質(zhì)。然而，最直接的研究方法是基于顯微鏡成像的觀察方法，活細(xì)胞和固定細(xì)胞成像都可以提供相分離和SGs的最直接證據(jù)。如Markmiller等[52]在亞砷酸鈉和熱休克誘導(dǎo)的應(yīng)激中利用高通量顯微鏡確定了150種先前未知的SGs。隨著技術(shù)的革新，Wheeler等[53]對觀察方式加以改進(jìn)，將CRISPR-Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-asso-ciated protein 9)技術(shù)、微筏陣列以及高內(nèi)涵成像結(jié)合，開發(fā)了新技術(shù)“Craft-ID”(CRISPR-based microRaft followed by guide RNA identification)。該技術(shù)通過分離含有大于12 000條的單個(gè)導(dǎo)向RNA(single-guide RNA, sgRNA)的基因克隆微筏確定了影響SGs組裝的RBPs。

鑒于SGs與相分離之間的緊密關(guān)系，利用SGs的相分離特性可進(jìn)一步挖掘其組分。如Kato等[54]利用生物素化的異噁唑誘導(dǎo)細(xì)胞裂解物內(nèi)的LLPS，通過物理方法分離沉淀和上清液以此分析RNA和蛋白質(zhì)的組成。Molliex等[19]通過在SGs中引入hnRNPA1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1)，促進(jìn)SGs的相分離以觀察SGs的組裝和其在疾病中的機(jī)制。而近幾年興起的生物信息學(xué)預(yù)測手段，拓寬了研究思路，開啟了對基因與蛋白研究的新認(rèn)識。Boncella等[55]利用應(yīng)激誘導(dǎo)的RNP顆粒氨基酸組成成分預(yù)測朊病毒樣結(jié)構(gòu)域(prion-like domains, PrLD)組裝傾向，挖掘PrLD對SGs的定位。Yang等[56]利用距離依賴性生物素分析方法繪制了基于距離的高密度互作圖譜，揭示了1 792種蛋白質(zhì)的7 424種近距離相互作用并定義了114種SGs中的核心組分。Kuechler等[57]分析了近期發(fā)表的來自酵母與哺乳動(dòng)物SGs的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)定義了一種哺乳動(dòng)物顆粒z分?jǐn)?shù)(mammalian granule z-score, MaGS)，該分?jǐn)?shù)可以用于預(yù)測某種蛋白相分離進(jìn)入SGs的可能性。

4 SGs的相分離與疾病

SGs的異常相分離與組裝會為細(xì)胞創(chuàng)造不利于增殖的環(huán)境，從而導(dǎo)致疾病狀態(tài)。如Schneider等[58]發(fā)現(xiàn)突變的RBM20(RNA-binding motif protein-20)會促進(jìn)心肌細(xì)胞中SGs的相分離形成，阻止細(xì)胞增殖，最大限度地減少能量消耗并停止所有非必要的細(xì)胞功能，從而導(dǎo)致先天性擴(kuò)張型心肌病。相似的，在肌萎縮側(cè)索硬化癥的患者中肉瘤蛋白(fused in sarcoma, FUS)的蛋白甲基化缺失會促進(jìn)FUS的相分離，增強(qiáng)其與SGs的結(jié)合并抑制TNPO1(transportin-1)這一抑制FUS異常相分離的細(xì)胞質(zhì)伴侶，從而導(dǎo)致FUS融合蛋白的大量積累[59-64]。而并非所有突變均會增強(qiáng)相分離而導(dǎo)致疾病狀態(tài)，Yang等[65]發(fā)現(xiàn)青霉素結(jié)合蛋白1(penicillin-binding protein 1, Pbp1)的突變會減弱其相分離作用而導(dǎo)致線粒體功能障礙，并使細(xì)胞在營養(yǎng)應(yīng)激期間的適應(yīng)能力降低。

SGs也與腫瘤密切相關(guān)，腫瘤細(xì)胞應(yīng)對與適應(yīng)壓力的能力對腫瘤進(jìn)展具有重要作用，腫瘤細(xì)胞會遇到以缺氧、高滲、營養(yǎng)缺乏等特征為敵的腫瘤微環(huán)境，此時(shí)這些應(yīng)激狀態(tài)都有可能觸發(fā)SGs的形成[66]。尤為重要的是，SGs是腫瘤細(xì)胞應(yīng)對放化療所產(chǎn)生的一種反應(yīng)[6]，SGs常常是為了增強(qiáng)細(xì)胞的生存能力而產(chǎn)生的，因此這種顆粒的產(chǎn)生可能會無意中影響腫瘤的治療[67]。如Shi等[68]在前列腺癌中發(fā)現(xiàn)斑點(diǎn)型鋅指結(jié)構(gòu)蛋白(speckle-type POZ protein, SPOP)突變會上調(diào)SGs的組裝以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的存活率和對多西他賽的耐藥性。而Li等[69]發(fā)現(xiàn)MG53[又稱TRIM72(tripartite motif containing 72)]可通過調(diào)節(jié)非小細(xì)胞肺癌中的G3BP2活性抑制腫瘤中SGs的形成，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對順鉑治療的敏感性。因此，抑制SGs在腫瘤細(xì)胞中的組裝或許可以成為一種新的腫瘤治療方式。

由此可見，SGs可以作為一種潛在的治療靶點(diǎn)，通過清除或降解這些異常積累的蛋白以治療疾病，而在一些研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)異常的SGs被靶向至溶酶體降解，這或許可以成為一種潛在的治療方式[70-71,80]。Fang等[72]通過利用具有芳香基團(tuán)的平面分子抑制TDP-43(TAR-DNA binding protein 43)在肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)和額顳葉癡呆(frontotemporal dementia, FTD)中的累積，并以此調(diào)控了SGs相關(guān)分子的招募，而TDP-43被證明在ALS和FTD等腦病中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[60]，這也提示了SGs作為靶點(diǎn)在臨床治療中的可行性。近年來，納米材料已被證明是一種新興的疾病診療手段，可以利用其選擇性結(jié)合以及其獨(dú)特的細(xì)胞膜滲透作用，起到靶向治療的作用[73-74]。Dittrich等[75]利用CD3ac肽基質(zhì)、由Flutax-2一種癌癥治療藥物分子構(gòu)成的包埋貨物和一個(gè)標(biāo)記有Alexa Fluor 568熒光染料的鐵蛋白冠(Tfn-AF568)組裝成一種可以被細(xì)胞攝取并利用相分離機(jī)制將藥物輸送至細(xì)胞中的納米顆粒(nano particle, NP)。也有研究表明，許多不同材料構(gòu)成NP都可以與參與RNA加工機(jī)制的蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，同時(shí)在與這些NP相關(guān)蛋白質(zhì)組中，觀察到了許多IDR結(jié)構(gòu)，與天然SGs蛋白質(zhì)組存在密切的相關(guān)性[76]。相似的，Klein等[77]發(fā)現(xiàn)基于二氧化硅制備的NP與IDR和RBPs之間具有高親和力并且可捕獲一些與SGs相關(guān)的RBPs，諸如多聚腺苷酸結(jié)合蛋白[poly(A)-binding protein，PABP1]、RNA結(jié)合蛋白肉瘤融合/脂肪肉瘤轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及真核轉(zhuǎn)錄起始因子3(eukaryotic initiation factor, eIF3)，它們均被證明在SGs組裝中發(fā)揮重要作用[62,78-79]。這些證據(jù)表明，可以通過NP與IDR及RBPs等相關(guān)蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)胞內(nèi)的相分離行為，從而干預(yù)諸如SGs等生物分子聚集體的組裝與解聚，或許可以為疾病的診療提供新的思路。

5 總結(jié)與展望

細(xì)胞內(nèi)調(diào)控蛋白質(zhì)的合成以適應(yīng)不斷變化的外界條件對細(xì)胞的生長和生存至關(guān)重要，此過程需要對mRNA翻譯進(jìn)行快速協(xié)調(diào)及特異和局部化的重編程。盡管現(xiàn)在已對這種調(diào)控的機(jī)制有所了解，但由于SGs的動(dòng)態(tài)性以及其缺乏細(xì)胞膜的特性，很難直接對其進(jìn)行研究。因此，今后可從分析不同應(yīng)激條件下SGs中的特征性蛋白組或基因組入手，挖掘其與其他蛋白的相互作用關(guān)系，探究其發(fā)生相分離的啟動(dòng)因素。同時(shí)也可以針對SGs對于細(xì)胞的生存影響，尋找SGs潛在的治療靶點(diǎn)，或許可以成為一種全新的治療手段。