趙 婧， 李 倩， 吳乾渝

(1. 同濟(jì)大學(xué)附屬第一婦嬰保健院婦科，上海 201204； 2. 同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院婦科，上海 200120)

子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma, EC)為婦科常見(jiàn)三大惡性腫瘤之一，2020年國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)發(fā)布的報(bào)道，EC在全球185個(gè)國(guó)家新發(fā)病例達(dá)417 367例,僅次于宮頸癌[1]。目前有關(guān)EC的具體發(fā)病機(jī)制尚不明確。遺傳性乳腺癌-卵巢癌綜合征(hereditary breast and ovarian cancer, HBOC)與乳腺癌易感基因(breast cancer susceptibility gene, BRCA)的突變密切相關(guān)，然而近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)BRCA1基因突變者發(fā)生EC的風(fēng)險(xiǎn)同樣增加，尤其是侵襲性的漿液性EC的風(fēng)險(xiǎn)最高[2-4]。目前認(rèn)為對(duì)BRCA基因突變的患者，尤其是在使用他莫西芬治療的患者行子宮切除術(shù)可以預(yù)防EC[5-6]。G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled estrogen receptor， GPER)或G蛋白偶聯(lián)受體30(G-protein-coupled receptor 30, GPR30)，被認(rèn)為是與經(jīng)典核受體不同的一種新型雌激素受體，GPER可與雌激素及其相關(guān)化合物直接結(jié)合，介導(dǎo)快速的非基因組效應(yīng)，同時(shí)激活細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)傳導(dǎo)通路： ERK、PI3K/Akt、cAMP/PKA，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展[1,7]。與傳統(tǒng)ER不同，GPER可以獨(dú)立發(fā)揮作用，并負(fù)責(zé)快速激活雌激素非基因組效應(yīng)，研究提示它莫西芬可作為GPER的激動(dòng)劑，直接與其結(jié)合發(fā)揮其在子宮內(nèi)膜病變中的促生長(zhǎng)作用[8]。BRCA基因參與DNA雙鏈斷裂的修復(fù)、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡，有研究報(bào)道BRCA1突變提示EC風(fēng)險(xiǎn)增加[9]。Beiner等[10]報(bào)道了BRCA攜帶者EC風(fēng)險(xiǎn)增加的主要原因是他莫昔芬的使用。選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑他莫昔芬作為GPER的配體具有直接激動(dòng)GPER的活性。GPER在接受他莫西芬治療的患者中表達(dá)更高[11]。在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系中，他莫昔芬可以通過(guò)GPER來(lái)促進(jìn)細(xì)胞遷移[12]。本團(tuán)隊(duì)通過(guò)前期生信研究發(fā)現(xiàn)BRCA1和GPER可能通過(guò)MAPK、DDIT、EGF信號(hào)通路發(fā)生交互作用。并利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)BRCA1和GPER在癌與癌旁組織中的mRNA表達(dá)量有顯著差異。雌激素在免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，但關(guān)于GPER激活在癌癥環(huán)境中的調(diào)節(jié)作用的信息很少。因此本研究團(tuán)隊(duì)推測(cè)BRCA1基因突變?nèi)笔Э赡芡ㄟ^(guò)相關(guān)信號(hào)通路導(dǎo)致GPER活化，從而發(fā)揮其雌激素快速非基因組效應(yīng)，導(dǎo)致EC發(fā)生發(fā)展。本研究將通過(guò)探討B(tài)RCA1、GPER在EC中的表達(dá)水平及預(yù)后分析為探討EC發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)，為EC臨床診斷、治療、手術(shù)方式選擇、判斷預(yù)后提供新參考。

1 資料與方法

1.1 組織樣本資料

1.2 標(biāo)本采集與處理

1.2.1 免疫組化 取約2 cm×1 cm×1 cm的組織，制成石蠟包埋組織。切片，脫蠟，抗原修復(fù)，3%的H2O2蒸餾水溶液，一抗(GPR30抗體： abcam型號(hào)39742;BRCA1抗體： abcam型號(hào)16780)按1∶100稀釋?zhuān)? ℃過(guò)夜孵育，第2天PBS浸洗，再滴加二抗(HRP 1∶100)，孵育30 min(37 ℃)。磷酸鹽緩沖液(PBS)浸洗。DAB顯色，鏡下觀察，抗體標(biāo)記的陽(yáng)性部位準(zhǔn)確終止顯色。

1.2.2 免疫熒光 取約2 cm×1 cm×1 cm的組織，制成石蠟包埋組織。切片、烤片、二甲苯溶蠟，乙醇梯度水化。每片加入100 μL混合一抗(用BSA對(duì)抗體1∶100稀釋?zhuān)珿PER抗體與BRCA1抗體稀釋在一起，GPER抗體需與BRCA1抗體抗性不同)。次日PBS浸洗，兔抗和s鼠抗兩種熒光二抗(abcam型號(hào)150077;abcam型號(hào)150115)按1∶200用BSA進(jìn)行稀釋(兩種抗體混合在一起)，每片加入100 μL混合二抗，室溫孵育1 h。PBS浸洗，DAPI染核。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 27.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。BRCA1、GPER表達(dá)與EC病理類(lèi)型、FIGO分期、組織分化、肌層浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的表達(dá)差異采用χ2檢驗(yàn)分析。BRCA1、GPER與不同病理種類(lèi)子宮內(nèi)膜癌的相關(guān)性分析使用多元Logistic回歸分析。預(yù)后影響因素分析使用COX回歸分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BRCA1與EC臨床病理參數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

采用IHC方法檢測(cè)了35例子宮內(nèi)膜癌組織中BRCA1蛋白的表達(dá)情況，如圖1所述，BRCA1在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核內(nèi)均有表達(dá)，陽(yáng)性率51.43%。隨后進(jìn)一步分析了35例EC組織BRCA1陽(yáng)性表達(dá)與EC患者臨床病例參數(shù)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)EC患者BRCA1陽(yáng)性表達(dá)在病理類(lèi)型、組織分化、肌層浸潤(rùn)3個(gè)方面病理特征差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在年齡、FIGO分期、淋巴轉(zhuǎn)移、預(yù)后這4項(xiàng)病理指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

圖1 不同病理類(lèi)型子宮內(nèi)膜癌BRCA1蛋白表達(dá)情況Fig.1 Expression of BRCA1 protein in endometrial carcinoma with different pathological typesA、B： 子宮內(nèi)膜樣癌；C： 子宮內(nèi)膜漿液性癌；D： 子宮內(nèi)膜透明細(xì)胞癌；E： 正常子宮內(nèi)膜；F： 陰性對(duì)照；標(biāo)尺： 60 μm

表1 子宮內(nèi)膜癌患者不同臨床病理特征BRCA1蛋白表達(dá)情況

續(xù)表

2.2 GPER與EC臨床病理參數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

采用同樣的方法檢測(cè)了35例子宮內(nèi)膜癌組織中GPER蛋白的表達(dá)情況，如圖2所述，GPER主要表達(dá)于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，少數(shù)在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，陽(yáng)性率71.43%。隨后進(jìn)一步分析了35例EC組織GPER陽(yáng)性表達(dá)與EC患者臨床病例參數(shù)的相關(guān)性，EC患者GPER陽(yáng)性表達(dá)在不同F(xiàn)IGO分期、預(yù)后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在年齡、病理類(lèi)型、組織分化、肌層浸潤(rùn)、淋巴轉(zhuǎn)移病理特征差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

圖2 不同病理類(lèi)型子宮內(nèi)膜癌GPER蛋白表達(dá)情況Fig.2 Expression of GPER protein in different pathological types of endometrial carcinomaA、B： 子宮內(nèi)膜樣癌；C： 子宮內(nèi)膜漿液性癌；D： 子宮內(nèi)膜透明細(xì)胞癌；E： 正常子宮內(nèi)膜；F： 陰性對(duì)照；標(biāo)尺： 60 μm

表2 子宮內(nèi)膜癌患者不同臨床病理特征GPER蛋白表達(dá)情況

續(xù)表

2.3 EC組織中BRCA1、GPER表達(dá)結(jié)果

EC組織中BRCA1與GPER表達(dá)關(guān)系使用χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。BRCA1、GPER二者在子宮內(nèi)膜腺癌中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)圖3。在子宮內(nèi)膜漿液性癌及透明細(xì)胞癌中差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖3 子宮內(nèi)膜腺癌中BRCA1、GPER的表達(dá)情況Fig.3 Co-expression of BRCA1 and GPER in endometrial adenocarcinoma放大倍數(shù)200；使用DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，熒光二抗(紅光)標(biāo)記BRCA1，熒光二抗(綠光)標(biāo)記GPER；標(biāo)尺： 75 μm

2.4 EC預(yù)后影響因素分析

最后分析了BRCA1和GPER與EC患者預(yù)后的相關(guān)性。采用單因素Cox回歸分析顯示，年齡、病理類(lèi)型、組織分化、FIGO分期、GPER的表達(dá)均為可能影響EC總體生存的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。將這些危險(xiǎn)因素進(jìn)一步納入多因素Cox回歸風(fēng)險(xiǎn)模型，結(jié)果顯示，年齡、FIGO分期、GPER的表達(dá)為EC患者預(yù)后的獨(dú)立因素(P<0.05)，見(jiàn)表3。GPER陰性患者具有更高的死亡風(fēng)險(xiǎn)(P<0.05)，見(jiàn)圖4。BRCA1的表達(dá)與患者預(yù)后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖5。

圖4 GPER表達(dá)的不同與患者生存曲線的比較Fig.4 Survival curves of EC patients with positive and negative GPER expression

表3 預(yù)后影響因素分析

圖5 BRCA1表達(dá)的不同與患者生存曲線的比較Fig.5 Survival curves of EC patients with positive and negative BRCA1 expression

3 討 論

目前我國(guó)每年新發(fā)EC病例約5萬(wàn)例。近年來(lái)分子生物學(xué)的研究認(rèn)為EC的發(fā)生可能與癌基因、抑癌基因的異常表達(dá)有關(guān)[13]。目前現(xiàn)有的治療手段仍不能使子宮內(nèi)膜癌患者的預(yù)后達(dá)到理想狀態(tài)[14]。因此研究EC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,可為EC臨床診斷、治療、改善患者預(yù)后提供重要理論參考。

超重、肥胖、家族史、糖尿病、不孕和種族是EC發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素，持續(xù)暴露于內(nèi)源性或外源性雌激素刺激，被認(rèn)為是約90%病例的原因。GPER能與雌激素快速結(jié)合并激活非基因組效應(yīng)[25]。研究認(rèn)為GPER與肥胖、免疫抑制、代謝綜合征發(fā)展和組織內(nèi)雌激素合成的關(guān)鍵事件有關(guān)，為雌激素誘導(dǎo)的癌變提供了另一種觀點(diǎn)： GPER的功能不依賴于ER的存在，因此可能單獨(dú)促進(jìn)雌激素誘導(dǎo)的癌變[26]。在乳腺癌和卵巢癌中，GPER的表達(dá)與轉(zhuǎn)移、腫瘤大小有關(guān)[27]，Yu等[28]研究發(fā)現(xiàn)GPER在乳腺癌中的表達(dá)量顯著升高。相反的也有報(bào)道GPER在早期卵巢癌及低度惡性卵巢癌組織標(biāo)本中表達(dá)，并且在隨著疾病進(jìn)展出現(xiàn)GPER表達(dá)的下降，與無(wú)病生存密切相關(guān)[29]。最新研究報(bào)道GPER在細(xì)胞不同部位的表達(dá)與患者預(yù)后相關(guān)[30]。

在本研究中，BRCA1的表達(dá)在EC病理類(lèi)型、組織分化、肌層浸潤(rùn)方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，BRCA1的表達(dá)與預(yù)后、FIGO分期、淋巴轉(zhuǎn)移、年齡無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。對(duì)于BRCA突變的卵巢癌和轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者，PARP抑制劑正在成為標(biāo)準(zhǔn)治療的一部分，其療效明顯[31]。免疫治療能否聯(lián)合靶向用于子宮內(nèi)膜癌的一線治療值得期待。對(duì)于BRCA突變患者是否同時(shí)行子宮切除建議進(jìn)行仔細(xì)全面的風(fēng)險(xiǎn)、效益評(píng)估，子宮切除術(shù)的決定應(yīng)根據(jù)患者的年齡、BMI、乳腺癌史和手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)等因素進(jìn)行個(gè)性化定制。此外子宮切除術(shù)的心理影響和輕微增加的EC風(fēng)險(xiǎn)也應(yīng)考慮在內(nèi)。術(shù)前與患者就子宮切除術(shù)的所有因素、優(yōu)勢(shì)和風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行徹底的討論是必要的[32]。GPER的表達(dá)與FIGO分期、預(yù)后有關(guān)(P<0.05)，與患者年齡、病理類(lèi)型、組織分化、肌層浸潤(rùn)、淋巴轉(zhuǎn)移無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。COX回歸分析顯示FIGO分期、年齡、GPER表達(dá)情況是EC預(yù)后獨(dú)立危險(xiǎn)因素。GPER被發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)的不同位置表達(dá)，雖然GPER屬于膜受體家族，但GPER在胞膜和細(xì)胞內(nèi)均可檢測(cè)到，這可能與GPER的內(nèi)吞作用有關(guān)，即GPER在細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)存在一個(gè)重新分部過(guò)程[12]，該過(guò)程被認(rèn)為可以調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展，在骨肉瘤細(xì)胞中GPER不同的亞細(xì)胞定位發(fā)揮不同的生物學(xué)作用[33]。GPER在細(xì)胞核的表達(dá)提示較差的總生存期和較差的5年無(wú)進(jìn)展生存期[30]。而且疾病的進(jìn)程也會(huì)影響GPER的表達(dá)，疾病狀態(tài)可能會(huì)調(diào)整該受體表達(dá)水平[12]。GPER的小鼠敲除模型顯示，GPER的過(guò)表達(dá)及其在質(zhì)膜中的位置是乳腺癌進(jìn)展的重要事件[34]，而在他莫西芬治療的ERα陽(yáng)性的乳腺癌患者中，質(zhì)膜中GPER的缺失的患者具有良好的長(zhǎng)期預(yù)后[35]。同樣在本研究中GPER基因表達(dá)水平較低的患者預(yù)后情況較差，說(shuō)明GPER可以作為判斷EC預(yù)后的分子標(biāo)志物。本研究中GPER與BRCA1在EC中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。尤其在子宮內(nèi)膜腺癌中BRCA1、GPER相關(guān)性明顯(P<0.05)。推測(cè)GPER與BRCA1在EC發(fā)生發(fā)展中可能存在相互作用，GPER和BRCA1之間信號(hào)通路的研究是下一步的研究方向。

綜上，BRCA1、GPER與EC病理特征密切相關(guān)，聯(lián)合二者檢測(cè)對(duì)于對(duì)BRCA基因突變相關(guān)HBOC綜合征高危人群的篩查、治療、判斷預(yù)后及隨訪有指導(dǎo)意義，同時(shí)PARP免疫治療能否靶向用于BRCA基因突變EC患者的一線治療值得期待。GPER作為一種新型雌激素受體與EC患者預(yù)后相關(guān)，可為治療靶點(diǎn)提供新參考。