孫杰瑜，孫博蕊

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，遼寧 沈陽 110000）

膜性腎?。╩embranous nephropathy，MN）一種自身免疫性疾病，是成人終末期腎病常見原因之一。MN又細分為特發(fā)性MN（idiopathic membranous nephropathy，IMN）和繼發(fā)性MN兩種，IMN以腎病綜合征為主要臨床特征（如蛋白尿、血尿、低白蛋白血癥等），而繼發(fā)性MN還伴有原發(fā)病表現(xiàn)。常見發(fā)病原因有感染、自身免疫性疾病、惡性腫瘤及藥物等[1-2]。因MN疾病異質性，目前治療方案仍存在爭議，迫切需要更具前景的藥物進行治療。土茯苓根莖主要用于治療重金屬中毒、腎炎和炎癥性疾病，還可作為功能性成分添加于藥膳中。現(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，土茯苓具有多種生物活性，如抗炎、抑菌、抗痛風、肝和心腦血管保護作用[3]。土茯苓提取物中主要有效成分為黃酮類化合物，其中土茯苓總黃酮（smilax glabra flavonoids，SGF）具有較強抗氧化、降尿酸和肝、腎保護作用[4]。本研究擬通過建立大鼠MN模型，探討SGF對MN模型的作用和機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 100只7周齡SPF級雄性健康SD大鼠，體質量180～220 g，購自安徽醫(yī)科大學，動物生產許可證號：SCXK（皖）2017-001。購入后保持室內溫度（23±2）℃，空氣相對濕度（65±5）%，光照晝夜交替循環(huán)12 h，適應性飼養(yǎng)1周。尿蛋白試紙定性檢測大鼠尿蛋白，結果均為陰性，且測其24 h尿蛋白定量（urine total protein,UTP）均＜10 mg。本研究符合動物倫理要求，實驗過程嚴格遵守《實驗動物管理條例》。

1.2 藥物與試劑 茯苓總黃酮（SGF）（純度≥98%，批號：191028）購自通化德濟藥材公司；環(huán)孢素口服溶液（國藥準字H10930130，批號：190916）購自杭州中美華東制藥有限公司；Trizol試劑（批號：15596026）購自美國Invitrogen公司；白細胞介素-4（interleukin-4，IL-4）ELISA試劑盒（批號：SEKR-0004）、轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）ELISA試劑盒（批號：SERK-0012）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號：SEKR-0009）、DAB顯色試劑盒（批號：DA1015）、TUNEL試劑盒（批號：T2190）、RIPA裂解液（批號：R0010）均購自北京索萊寶科技有限公司；弗氏不完全佐劑（批號：F5506）、陽離子牛血清白蛋白（cationic bovine serum albumin，C-BSA）（批號：NA-BD6-1）購自美國Sigma公司；兔抗大鼠細胞外調節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）（批號：ab184699）、磷酸化細胞外調節(jié)蛋白激酶（phosphorylated extracellular regulatory protein kinase，p-ERK）（批號：ab201015）、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK）（批 號：ab4822）、磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶（phosphorylated p38 mitogen -activated protein kinase，p -p38MAPK）（批 號：ab178867）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單抗（批號：ab181602）、α-平滑肌肌動蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）多抗（批號：ab124964）、裂孔隔膜蛋白分子（Nephrin）多抗（批號：ab216341）和山羊抗兔二抗IgG（批號：ab6721）均購自英國Abcam公司。

1.3 主要儀器 cobas c501型全自動生化分析儀（瑞士Roche公司）；Multiskan GO型酶標儀（美國thermofisher公司）；NP-T1型脫水機和NP-B1型包埋機（孝感市諾普電子科技有限責任公司）；RM2016型病理切片機（德國徠卡公司）；7500型實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；DYCZ-24F型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

1.4 造模與分組 隨機取80只大鼠建立MN模型，依據(jù)Border法制備C-BSA于-80 ℃冰箱密封存儲備用。預免疫：取1 mg C-BSA溶于0.5 mL PBS，加入等體積弗氏不完全佐劑混勻并充分乳化后，在大鼠腋下和腹股溝等多點皮下不同部位注射1 mL C-BSA乳化液進行預免疫，隔日1次，每周3次，共計1周；正式免疫：大鼠尾靜脈注射16 mg/kg C-BSA（溶于1 mL pH值=7.4 PBS），隔日1次，每周3次，共計4周[5]。造模結束后，尿蛋白試紙檢測大鼠尿蛋白為陽性，并隨機處死2只造模大鼠，進行病理學檢查，出現(xiàn)腎小球基底膜（glomerular basement membrane，GBM）上皮下免疫復合物沉積，導致GBM彌漫性增厚，即造模成功[6]。除2只大鼠無任何癥狀外，剩余76只大鼠造模成功。將造模成功大鼠隨機分為模型組、SGF低劑量組、SGF高劑量組和陽性藥物組，每組19只。余下20只未造模大鼠作為對照組。預免疫：對照組在其相同位置注射等體積的生理鹽水與弗氏不完全佐劑混合溶液，隔日1次，每周3次，共計1周；正式免疫：對照組大鼠尾靜脈注射等體積生理鹽水，隔日1次，每周3次，共計4周。

1.5 實驗給藥 造模成功24 h后，參照文獻[7]用量，SGF低、高劑量組大鼠按15、30 mg/（kg·d）劑量灌胃SGF溶液；陽性藥物組大鼠按10 mg/（kg·d）劑量灌胃給予環(huán)孢素口服溶液，對照組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水，1次/d，共計6周。

1.6 觀察指標

1.6.1 常規(guī)指標檢測 末次給藥后24 h，代謝籠收集當日7:00:00至次日7∶00∶00大鼠24 h尿液，量杯計算總尿量，采用全自動生化分析儀測定24 h UTP。留尿結束后，戊巴比妥鈉麻醉大鼠，剖開腹腔，取主動脈血，4 ℃3 000 r/min離心10 min，離心半徑20 cm，取血清，全自動生化分析儀檢測血清血肌酐（serum creatinine，Scr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）的含量。

1.6.2 血清IL-4、TGF-β1、TNF-α水平檢測 常規(guī)指標檢測結束后，ELISA法檢測血清IL-4、TGF-β1、TNF-α含量。嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行操作。

1.6.3 腎臟病理學觀察 脫頸椎處死大鼠，左側腎臟取2 mm×2 mm×10 mm的新鮮皮質，石蠟包埋，切片4 μm，脫蠟20 min，蘇木精染色3～5 min，伊紅染色2 min，脫水，二甲苯透化10 min，中性樹脂封固，光學顯微鏡觀察。

1.6.4 腎臟細胞凋亡檢測 取腎臟切片，脫蠟至水，37 ℃蛋白酶K孵育30 min，依據(jù)TUNEL試劑盒說明書對切片染色、終止反應、封片等，5個不同視野下顯微鏡觀察腎臟腎小球足細胞（podocyte，PC）凋亡情況，計算凋亡指數(shù)（apoptoticindex，AI）。AI（%）=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.6.5 ERK mRNA、p38MAPK mRNA、Nephrin mRNA、α-SMA mRNA水平檢測 取一半右側腎臟皮質，勻漿，Trizol法提取RNA，測純度、濃度，逆轉錄得cDNA，實時熒光定量PCR反應。反應體系：1.8 μL Taq聚合酶、1 μL上下游引物、4 μL模板cDNA、13.2 μL ddH2O。擴增條件：94 ℃預變性30 s、94 ℃變性5 s、59 ℃退火30 s，共40個循環(huán)，加熔解曲線，50 ℃降溫30 s。GAPDH為內參對照，數(shù)據(jù)分析采用2-△△Ct法，重復多次，取Ct均值。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.6.6 ERK、p-ERK、p38MAPK、p-p38MAPK、Nephrin、α-SMA蛋白水平檢測 取剩余右側腎臟皮質，加RIPA裂解緩沖液，離心取上清，蛋白BCA試劑盒確定總蛋白濃度，100 V電泳分離80 min，250 mA轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶磷酸鹽緩沖液封閉2 h，樣品與ERK（1∶500）、p-ERK（1∶250）、p38MAPK（1∶500）、p-p38MAPK（1∶250）、Nephrin（1∶250）和α-SMA（1∶500）一抗4 ℃過夜孵育，TBST緩沖液洗膜，加二抗（HRP標記IgG，1∶2 000）室溫孵育2 h，洗膜，曝光，顯影。Image J軟件測樣品條帶與GAPDH條帶灰度值。計算目標蛋白相對表達量，即目標條帶與GAPDH條帶灰度比值。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 27.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用“均數(shù)±標準差”（）表示，采用Levene檢驗方差齊性，如檢驗方差齊，多樣本計量資料比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；如方差不齊，則用Welch's t檢驗，再行Dunnett's T3檢驗進行兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠24 h UTP、Scr、BUN水平比較 與對照組比較，模型組大鼠24 h UTP、Scr、BUN水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，SGF低劑量組、SGF高劑量組及陽性藥物組大鼠24 h UTP、Scr、BUN水平均明顯降低（P＜0.05）；與SGF低劑量組比較，SGF高劑量組及陽性藥物組大鼠24 h UTP、Scr、BUN水平均明顯降低（P＜0.05），且陽性藥物組低于SGF高劑量組（P＜0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠24 h UTP、Scr、BUN 水平比較（）

表2 各組大鼠24 h UTP、Scr、BUN 水平比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與SGF低劑量組比較，cP＜0.05；與SGF高劑量組比較，dP＜0.05

2.2 各組大鼠血清IL-4、TGF-β1、TNF-α水平比較 與對照組比較，模型組大鼠TNF-α水平明顯升高（P＜0.05），IL-4、TGF-β1水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，SGF低劑量組、SGF高劑量組及陽性藥物組大鼠TNF-α水平均明顯降低（P＜0.05），IL-4、TGF-β1水平均明顯升高（P＜0.05）；與SGF低劑量組比較，SGF高劑量組及陽性藥物組TNF-α水平均明顯降低（P＜0.05），IL-4、TGF-β1水平均明顯升高（P＜0.05）；與SGF高劑量組比較，陽性藥物組大鼠TNF-α水平明顯降低（P＜0.05），IL-4、TGF-β1水平明顯升高（P＜0.05）。（見表3）

表3 各組大鼠血清IL-4、TGF-β、TNF-α 水平比較（）

表3 各組大鼠血清IL-4、TGF-β、TNF-α 水平比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與SGF低劑量組比較，cP＜0.05；與SGF高劑量組比較，dP＜0.05

2.3 各組大鼠腎臟病理學改變情況 對照組大鼠腎皮質內腎小球結構清晰，形態(tài)完整，細胞排列整齊，無系膜與基質增生；模型組大鼠腎小球體積增大，細胞萎縮，系膜與基質出現(xiàn)明顯增生，腎小管擴張；SGF低劑量組大鼠腎小球體積增大，系膜與基質增生，基底膜皺曲；SGF高劑量組大鼠腎小球基底膜增生減輕，上皮細胞水腫減輕；陽性藥物組大鼠腎小球基底膜增生減輕，細胞萎縮減少，上皮細胞水腫減輕。（見圖1）

圖1 各組大鼠腎組織病理學改變比較（HE，×400）

2.4 各組大鼠腎臟腎小球足細胞AI比較 凋亡細胞呈棕黃色染色，對照組大鼠幾乎未見凋亡細胞；模型組大鼠陽性染色細胞明顯增多；SGF低劑量組大鼠腎小球體積增大，棕黃色陽性染色細胞減少；SGF高劑量組大鼠細胞排列紊亂，腎小球結構模糊，陽性染色細胞明顯減少；陽性藥物組大鼠腎小球結構清晰，基底膜稍增厚，陽性染色細胞減少。（見圖2）

圖2 各組大鼠腎臟腎小球足細胞凋亡情況（TUNEL，×400）

與對照組比較，模型組大鼠腎皮質組織腎小球足細胞AI明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，SGF低劑量組、SGF高劑量組及陽性藥物組大鼠腎皮質組織腎小球足細胞AI均明顯降低（P＜0.05）；與SGF低劑量組比較，SGF高劑量組及陽性藥物組大鼠腎皮質組織腎小球足細胞AI均明顯降低（P＜0.05），且陽性藥物組低于SGF高劑量組（P＜0.05）。（見表4）

表4 各組大鼠腎臟腎小球足細胞AI 比較（）

表4 各組大鼠腎臟腎小球足細胞AI 比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與SGF低劑量組比較，cP＜0.05；與SGF高劑量組比較，dP＜0.05

2.5 各組大鼠腎組織ERK mRNA、p38MAPK mRNA、Nephrin mRNA、α-SMA mRNA相對表達量比較 與對照組比較，模型組大鼠腎組織α-SMA mRNA相對表達量明顯升高（P＜0.05），Nephrin mRNA相對表達量明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，SGF低劑量組、SGF高劑量組及陽性藥物組大鼠腎組織α-SMA mRNA相對表達量均明顯降低（P＜0.05），Nephrin mRNA相對表達量均明顯升高（P＜0.05）；與SGF低劑量組比較，SGF高劑量組及陽性藥物組大鼠腎組織α-SMA mRNA相對表達量均明顯降低（P＜0.05），Nephrin mRNA相對表達量均明顯升高（P＜0.05）；與SGF高劑量組比較，陽性藥物組大鼠腎組織α-SMA mRNA相對表達量明顯降低（P＜0.05），Nephrin mRNA相對表達量明顯升高（P＜0.05）。5組大鼠腎組織ERK mRNA、p38MAPK mRNA相對表達量比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見表5）

表5 各組大鼠腎組織ERK mRNA、p38MAPK mRNA、Nephrin mRNA、α-SMA mRNA 相對表達量比較（）

表5 各組大鼠腎組織ERK mRNA、p38MAPK mRNA、Nephrin mRNA、α-SMA mRNA 相對表達量比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與SGF低劑量組比較，cP＜0.05；與SGF高劑量組比較，dP＜0.05

2.6 各組大鼠腎組織ERK、p-ERK、p38MAPK、p-p38MAPK、Nephrin、α-SMA蛋白相對表達量比較 與對照組比較，模型組大鼠腎組織p-ERK、p-p38MAPK、α-SMA蛋白相對表達量均明顯升高（P＜0.05），Nephrin蛋白相對表達量明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，SGF低劑量組、SGF高劑量組及陽性藥物組大鼠腎組織p-ERK、p-p38MAPK、α-SMA蛋白相對表達量均明顯降低（P＜0.05），Nephrin蛋白相對表達量均明顯升高（P＜0.05）；與SGF低劑量組比較，SGF高劑量組及陽性藥物組大鼠腎組織p-ERK、p-p38MAPK、α-SMA蛋白相對表達量均明顯降低（P＜0.05），Nephrin蛋白相對表達量均明顯升高（P＜0.05）；與SGF高劑量組比較，陽性藥物組大鼠腎組織p-ERK、p-p38MAPK、α-SMA蛋白相對表達量均明顯降低（P＜0.05），Nephrin蛋白相對表達量均明顯升高（P＜0.05）。5組大鼠腎組織ERK、p38MAPK蛋白相對表達量比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。（見表6、圖3）

表6 各組大鼠腎組織ERK、p-ERK、p38MAPK、p-p38MAPK、Nephrin、α-SMA 蛋白相對表達量比較（）

表6 各組大鼠腎組織ERK、p-ERK、p38MAPK、p-p38MAPK、Nephrin、α-SMA 蛋白相對表達量比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與SGF低劑量組比較，cP＜0.05；與SGF高劑量組比較，dP＜0.05

圖3 各組大鼠腎組織ERK、p-ERK、p38MAPK、p-p38MAPK、Nephrin、α-SMA 蛋白表達Western blotting 圖

3 討論

IMN是一類以腎小球足細胞（PC）損傷為核心機制的自身免疫性腎臟病，近年來發(fā)病率不斷攀升，是終末期腎臟病主因[8]。IMN的病理特征普遍認為是PC膜上形成的抗原-抗體復合物，沉積于腎小球基膜（GBM）上皮細胞下，進而激活補體引起腎損害，主要體現(xiàn)為大量蛋白尿、低蛋白血癥、漸進性腎功能受損[9]。目前本病發(fā)病機制尚不明確，且常用免疫抑制類藥物存在諸多不良反應，目前IMN仍缺乏特異性治療方案。故本研究通過建立MN大鼠模型，探討SGF對MN大鼠EMT的影響及作用機制。

MN發(fā)病機理復雜，且和諸多因素有關。隨著PC細胞株構建及生化技術發(fā)展，PC應用越來越廣泛。PC即腎小球上皮細胞，屬于高度特化細胞，擁有規(guī)則的間隔足突，與GBM和腎小球內皮細胞一起，維持腎血尿過濾屏障功能。MN發(fā)生過程中，由于免疫復合物激活補體級聯(lián)反應，導致PC受損[10]。PC損傷被確定為MN典型特征，也被認為是誘發(fā)蛋白尿和腎小球硬化的關鍵因素，其損傷導致細胞丟失和蛋白尿產生，且PC丟失已成為早期病理的重要標記物[11]。大量研究表明，PC損傷潛在機制與多種生理變化有關，如細胞因子激活、炎癥和細胞凋亡等，但腎損傷PC具體機制尚未闡明[12]。PC損傷可導致阿霉素誘導的腎病綜合征大鼠足突廣泛融合和嚴重蛋白尿現(xiàn)象。已有研究證實，PC功能障礙可能通過EMT導致蛋白尿，阻斷EMT可逆轉早期階段PC凋亡[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，藥物干預后，大鼠常規(guī)生化指標24 h UTP、Scr、BUN水平和血清IL-4、TGF-β1、TNF-α水平降低，腎小球足細胞AI降低，炎癥反應得到改善。HE結果顯示，SGF高、低劑量組大鼠腎臟病理損傷較模型組出現(xiàn)明顯改善，PC足突融合減少，提示SGF可通過減少腎小球PC凋亡，從而減緩大鼠腎臟病變，改善炎癥反應，阻止MN發(fā)展。

作為MAPK信號通路重要分支，p38和多種病理生理過程密切相關。p38MAPK是MAPK超家族成員重要組成部分。p-p38MAPK表達升高，可導致PC凋亡，進而引起GBM濾過屏障受到破壞，以致產生大量蛋白尿[14]。MAPK通路活化與PC損傷、足突融合、蛋白尿發(fā)生有關。Nephrin是PC足突間裂孔膜（slitdiaphragm，SD）結構蛋白成員，特異表達于SD區(qū)，是PC上皮細胞表型之一[15]。α-SMA是肌成纖維細胞（myofibroblast，Myo F）標志蛋白，纖維細胞激活可高表達，腎臟固有細胞在轉分化成Myo F后合成α-SMA，因此，α-SMA表達高低可間接反映腎臟固有細胞向肌成纖維轉化的程度[16]。α-SMA是上皮細胞EMT及纖維化標志蛋白，纖維化是MN向腎小球硬化發(fā)展的最終途徑。研究發(fā)現(xiàn)，在IMN發(fā)病過程中，PC發(fā)生EMT，上皮細胞樣表型標記物Nephrin表達下調，間充質細胞樣表型標記物結蛋白（Desmin）表達上調，導致PC形態(tài)和功能異常，腎小球濾過屏障受損，形成蛋白尿[17]。本研究結果顯示，與模型組比較，SGF高、低劑量組大鼠腎組織Nephrin mRNA和蛋白相對表達量明顯升高，α-SMA mRNA和蛋白相對表達量及p-ERK、p-p38MAPK蛋白相對表達量明顯降低，說明p38/ERK MAPK通路被抑制，揭示SGF可能通過抑制其通路，進而調控PC損傷與細胞凋亡。

綜上所述，SGF能抑制MN大鼠EMT，可能通過調控p38/ERK MAPK通路相關分子表達發(fā)揮作用。