何澤琪，林倩如，黃文，劉果,2，賀麗蘋(píng)，苗建銀，曹庸*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省功能食品活性物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省天然活性物工程技術(shù)研究中心，廣東廣州 510642）（2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東廣州 510642）

鈣是人體中最豐富的礦物質(zhì)，在骨骼形成、肌肉收縮、心臟功能、神經(jīng)和大腦思維活動(dòng)中起重要作用[1]。世界上多數(shù)國(guó)家都存在兒童低鈣攝入問(wèn)題，由于膳食結(jié)構(gòu)、食品來(lái)源、多谷物飲食習(xí)慣等的影響，目前我國(guó)兒童的膳食鈣攝入量對(duì)于其生長(zhǎng)發(fā)育和獲得最佳峰值骨量是不夠的[2]。研究早已證明兒童低鈣期攝入可導(dǎo)致低骨量和骨生長(zhǎng)遲緩，嚴(yán)重的可導(dǎo)致缺鈣性佝僂病[3]。再加上我國(guó)兒童蔬菜攝入比例高，植酸及纖維素?cái)z入量大，使得兒童鈣吸收利用變得更加困難[2]。同時(shí)，國(guó)外大量研究均表明，補(bǔ)充鈣劑可促進(jìn)骨礦沉積，并在受到胞外基質(zhì)的刺激和成骨生長(zhǎng)因子的作用后，可以加速分化進(jìn)程、不斷產(chǎn)生和分泌胞外基質(zhì)蛋白，釋放堿性磷酸酶等，加速礦物沉積，產(chǎn)生新骨[4]。而在年幼時(shí)最大限度地增加骨量，可以使骨礦含量顯提高，還可以有效減少由于年齡增加所引發(fā)得骨量丟失[5]。

奶粉作為嬰幼兒的主要攝入食品之一，提供給嬰幼兒日常所需營(yíng)養(yǎng)，對(duì)嬰幼兒個(gè)體發(fā)育至關(guān)重要。奶粉中含有多種蛋白，對(duì)嬰幼兒骨骼發(fā)育影響顯著。Caco-2 細(xì)胞系自發(fā)分化表現(xiàn)出人類小腸上皮細(xì)胞的典型結(jié)構(gòu)和功能特征[6]，Caco-2 小腸上皮細(xì)胞模型被廣泛應(yīng)用模擬食品、藥物吸收研究。成骨細(xì)胞是骨組織中形成新骨的功能細(xì)胞，受到刺激或生長(zhǎng)因子作用后，可加速分化進(jìn)程，產(chǎn)生新骨，還可以通過(guò)產(chǎn)生骨保護(hù)素，促進(jìn)骨形成[4,7]。目前，利用Caco-2 和成骨細(xì)胞模型評(píng)價(jià)成品配方奶粉促鈣轉(zhuǎn)運(yùn)及對(duì)骨骼健康的研究較少。故本研究擬利用Caco-2 小腸上皮細(xì)胞和MC3T3-E1 成骨細(xì)胞兩種模型，系統(tǒng)評(píng)價(jià)某種市售兒童配方奶粉促進(jìn)鈣吸收的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

1.1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑

Caco-2 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物科學(xué)研究所細(xì)胞資源中心；MC3T3-E1 成骨細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物科學(xué)研究所細(xì)胞資源中心；胎牛血清、MEM 培養(yǎng)基、MEM-α培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、0.25%體積分?jǐn)?shù)胰蛋白酶、Glutamax、非必需氨基酸、丙酮酸鈉，均購(gòu)自Gibco 公司，鹽酸、硝酸等其他試劑均為分析純。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)材料

某品牌兒童成長(zhǎng)配方奶粉（ZHG），主要配料：全脂奶粉、脫鹽乳清粉、脫脂奶粉等；市售純牛奶A，主要配料：生牛乳。以上兩種產(chǎn)品均購(gòu)自當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備

超凈工作臺(tái)、二氧化碳培養(yǎng)箱，Esco；噴霧干燥，無(wú)錫市現(xiàn)代噴霧干燥設(shè)備有限公司；酶標(biāo)儀，Enspire；Millicell ERS-2 細(xì)胞電阻儀；Wahli 火焰原子吸收光譜儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備

實(shí)驗(yàn)選擇國(guó)內(nèi)市場(chǎng)最廣泛銷售的乳業(yè)品牌，并選取其中最暢銷的產(chǎn)品市售純牛奶A 作為對(duì)照。為確保細(xì)胞實(shí)驗(yàn)上樣量一致，對(duì)市售純牛奶A 進(jìn)行噴霧干燥處理，噴霧干燥條件為進(jìn)風(fēng)溫度180 ℃，出風(fēng)溫度90 ℃，霧化器40 Hz，恒流泵50 r/min。市售純牛奶A粉劑保藏于4 ℃，直至開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 鈣轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 Caco-2 單層細(xì)胞模型的建立

選擇30～60代的Caco-2細(xì)胞建立小腸上皮單層細(xì)胞模型。根據(jù)中科院細(xì)胞庫(kù)推薦配方，細(xì)胞完全培養(yǎng)基配方為77% MEM，20%胎牛血清，1%雙抗，1%Glutamax，1%非必需氨基酸和1%丙酮酸鈉（比例均為體積分?jǐn)?shù)），培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5%的CO2濃度。待細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)，以每毫升2×105個(gè)的密度，將細(xì)胞接種至12 孔transwell 轉(zhuǎn)運(yùn)板上層的小室中，上層培養(yǎng)基體積為0.5 mL，并在下層補(bǔ)充1.5 mL 完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)21 d，每2 d 換液直至細(xì)胞形成完整的膜。通過(guò)跨膜電阻的檢測(cè)來(lái)確定細(xì)胞單層的完整性，當(dāng)電阻超過(guò)500 Ω·cm2時(shí)，將單層膜用于轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.2 鈣轉(zhuǎn)運(yùn)測(cè)定

采用本實(shí)驗(yàn)室前期已報(bào)道的方法[8]進(jìn)行鈣轉(zhuǎn)運(yùn)量的測(cè)定，并根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)情況稍作修改。Caco-2 細(xì)胞培養(yǎng)21 d 后棄去培養(yǎng)基，單層細(xì)胞立即用37 ℃的HBSS（不含鈣和鎂）清洗兩次，然后轉(zhuǎn)移至新的12孔板中，與HBSS 在培養(yǎng)箱中共孵育30 min。將不同濃度預(yù)先混合好的樣品加至transwell 小室上層，兒童配方奶粉加鈣螯合物（每孔分別加50、100、150 μg樣品與150 μg 鈣混合）、純牛奶A 粉劑加鈣螯合物（每孔100 μg 樣品與150 μg 鈣混合）、CaCl2（每孔150 μg）。在不同的時(shí)間點(diǎn)（60、90、120 min），從下層小室收集0.5 mL HBSS 緩沖液以測(cè)量鈣離子濃度，同時(shí)補(bǔ)充0.5 mL 新鮮的HBSS 緩沖液以保持恒定體積。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的鈣濃度使用火焰原子吸收檢測(cè)。每個(gè)孔的鈣含量按以下公式計(jì)算：

式中：

Bn——在各時(shí)間點(diǎn)（60、90、120 min）每孔下層1.5 mL HBSS 緩沖液中鈣含量，μg/孔；

1.5——一個(gè)常數(shù)，代表基底外側(cè)的1.5 mL HBSS 緩沖液每個(gè)孔；

An——在不同時(shí)間點(diǎn)在每個(gè)孔下層HBSS 的鈣離子濃度，原子吸收測(cè)定，μg/mL；

0.5——一個(gè)常數(shù)，代表從基底外側(cè)收集的0.5 mL HBSS緩沖液；

n——自變量，對(duì)于本研究，它可以是1、2、3，分別代表時(shí)間點(diǎn)60、90 和120 min。

火焰原子吸收光譜法測(cè)定鈣離子含量的具體流程同《GB 5009.92-2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中鈣的測(cè)定》中的火焰原子吸收光譜法，選用王水消解法消解樣品，王水與樣品體積比為1:1。

1.2.3 成骨細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

購(gòu)買成骨細(xì)胞后，按細(xì)胞培養(yǎng)指引對(duì)細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代。培養(yǎng)基配方為85%α-MEM 培養(yǎng)基，10%胎牛血清，1%雙抗（比例均為體積分?jǐn)?shù)）?？疾鞓悠穼?duì)成骨細(xì)胞毒性，篩選適合濃度，進(jìn)一步考察其對(duì)成骨細(xì)胞增殖、堿性磷酸酶分泌及礦化的影響。

1.2.3.1 細(xì)胞毒性

取第3 代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MC3T3-E1 細(xì)胞，以每毫升5×104個(gè)的密度接種于96 孔板，每組6 復(fù)孔，每孔100 μL 完全培養(yǎng)液。待細(xì)胞完全貼壁后，去除培養(yǎng)基，分別加入100 μL 含有5、10、50、100、200、500 μg/mL樣品的完全培養(yǎng)基；在培養(yǎng)24 h 后每孔加入100 μL MTT（0.5 mg/mL），37 ℃避光孵育4 h，孵育完成后終止培養(yǎng)，小心吸去上清培養(yǎng)液，每孔加入150 μL 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩5 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀570 nm 處測(cè)量各孔的吸光光度值。

1.2.3.2 細(xì)胞增殖

取第3 代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MC3T3-E1 細(xì)胞，以每毫升3×104個(gè)的密度接種于96 孔板，每組6 復(fù)孔，每孔100 μL 完全培養(yǎng)液。待細(xì)胞完全貼壁后，去除培養(yǎng)基，分別加入100 μL 含有5、10、50 μg/mL 樣品的完全培養(yǎng)基；在培養(yǎng)72 h后每孔加入20 μL MTT（0.5 mg/mL），37 ℃避光孵育4 h，孵育完成后終止培養(yǎng)，小心吸去上清培養(yǎng)液，每孔加入150 μL 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩5 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀570 nm 處測(cè)量各孔的吸光光度值。

1.2.3.3 堿性磷酸酶含量測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MC3T3-E1 細(xì)胞，以每毫升2×106個(gè)的密度接種于6 孔板，每組4 復(fù)孔，每孔2 mL 完全培養(yǎng)液。第二天小心除去培養(yǎng)基，分別加入2 mL 含有5、10、50 μg/mL 樣品的誘導(dǎo)培養(yǎng)基；隔天換液。第7 天，小心除去培養(yǎng)基，并用4 ℃預(yù)冷的PBS 清洗細(xì)胞3 次，用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞后，使用超聲破碎儀裂解細(xì)胞（功率300 W，冰水浴，每3～5 s 超聲1 次，間隔4 次，間隔時(shí)間30 s）。BCA 法測(cè)定蛋白含量，試劑盒定量，后使用堿性磷酸酶試劑盒測(cè)定堿性磷酸酶含量。

1.2.3.4 成骨細(xì)胞礦化實(shí)驗(yàn)

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MC3T3-E1 細(xì)胞，用體積分?jǐn)?shù)0.25%胰酶及體積分?jǐn)?shù)0.02% EDTA 消化，制成密度為每毫升1×106個(gè)的細(xì)胞懸液，接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種完全培養(yǎng)基2 mL，第二天小心除去培養(yǎng)基，分別加入2 mL 含有5、10、50 μg/mL 樣品的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，隔天換液。21 d 后進(jìn)行茜素紅染色。除去培養(yǎng)基，以4 ℃預(yù)冷的PBS 緩沖液小心漂洗2 次；注意不要把礦化結(jié)節(jié)吸掉。預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛室溫條件下固定15 min，去離子水充分沖洗；體積分?jǐn)?shù)1%茜素紅染液室溫染色15 min，使用蒸餾水洗去染液，并用蒸餾水反復(fù)沖洗，直至洗液透明。風(fēng)干后在倒置顯微鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)形成情況并拍照。最后，分別添加1 mL 100 mmol/L 西吡氯銨溶液，室溫放置1 h，使與鈣結(jié)合的茜素紅充分溶液，用酶標(biāo)儀測(cè)570 nm 處溶液的吸光值，對(duì)礦化結(jié)晶進(jìn)行定量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次，使用SPSS 23.0 軟件和Prism 8.4.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和顯著性分析，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD），p＜0.05 被認(rèn)為具有顯著差異。并使用Prism 8.4.0 及Origin 2018 制作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 鈣轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)

Caco-2 單層模型被廣泛運(yùn)用于模擬物質(zhì)吸收。將不同濃度的奶粉與鈣混合物添加到transwell 小室上層，并測(cè)定下層中鈣的含量，將150 μg/mL 的CaCl2（與樣品組含鈣量相同）作為對(duì)照。Caco-2 單層細(xì)胞模型的鈣轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1 所示。由圖1 可知，隨著轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間的延長(zhǎng)，CaCl2組和樣品組的鈣轉(zhuǎn)運(yùn)含量均有增加。轉(zhuǎn)運(yùn)60 min 時(shí)，兒童配方奶粉低劑量樣品組（50 μg/mL）效果最佳，下層接收液鈣離子濃度為1.09 μg/well，而中劑量組和高劑量組轉(zhuǎn)運(yùn)的鈣離子濃度依次下降，分別為每孔0.93 μg 和每孔0.83 μg。所有劑量?jī)和浞侥谭鄣拟}轉(zhuǎn)運(yùn)量均大于純牛奶A粉劑的鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)濃度0.82 μg/well，說(shuō)明60 min 時(shí)兒童配方奶粉的鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)能力優(yōu)于純牛奶A 粉劑，但各樣品鈣轉(zhuǎn)運(yùn)量與空白對(duì)照組鈣含量0.89 μg/well 相比，均無(wú)顯著性差異（p＞0.05）。轉(zhuǎn)運(yùn)90 min 時(shí)，兒童配方奶粉中劑量樣品組（100 μg/mL）鈣轉(zhuǎn)運(yùn)效果最佳，下層接收液鈣離子濃度為每孔1.38 μg，其次為高劑量組的每孔1.36 μg 和低劑量組的每孔1.32 μg。同樣，90 min 時(shí)兒童配方奶粉各劑量組的鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)能力優(yōu)于純牛奶A 粉劑（每孔1.27 μg），但與空白對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異（p＞0.05）。轉(zhuǎn)運(yùn)120 min 時(shí)，下層接收液鈣離子含量從高到低分別為兒童配方奶粉中劑量樣品組每孔1.46 μg，低劑量樣品組每孔1.46 μg，高劑量樣品組和純牛奶A 粉劑每孔1.39 μg，所有樣品組鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)含量與空白對(duì)照組（每孔1.30 μg）相比依舊無(wú)顯著性差異（p＞0.05）。

圖1 兒童配方奶粉與市售純牛奶A 對(duì)各時(shí)間段Caco-2 細(xì)胞鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)量的影響Fig.1 Effect of children's formula and commercially available pure milk A on calcium ion transport in Caco-2 cells at various time

根據(jù)Caco-2 鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，兒童配方奶粉鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)能力優(yōu)于純牛奶 A 粉劑，但轉(zhuǎn)運(yùn)60～120 min 間與同時(shí)空白對(duì)照組相比，各劑量下層接收液鈣離子含量沒(méi)有顯著性差異。對(duì)比其他牛乳促鈣吸收物質(zhì)，相同鈣離子添加劑量和轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間下，文獻(xiàn)中牛乳酪蛋白促鈣吸收肽轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間為120 min 時(shí)，下層鈣離子濃度為每孔30～50 μg，較空白對(duì)照（＜10 μg每孔）顯著提高[8]。綜上所述，兒童配方奶粉不具有促進(jìn)鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)的能力。牛乳中的多肽常被發(fā)現(xiàn)具有促進(jìn)鈣轉(zhuǎn)運(yùn)的活性[9,10]。這可能是由于牛乳多肽，促鈣吸收肽通過(guò)與鈣通道TRPV6 的相互作用調(diào)節(jié)Caco-2 細(xì)胞中的鈣攝取[11]，也可能由于促鈣吸收肽刺激細(xì)胞因子IL-6 的分泌[11]，也可能是由于樣品中促進(jìn)鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)的有效成分含量差異。

2.2 成骨細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

MTT 比色法是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法,其檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性 MTT 還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲臜，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在不同濃度的奶粉作用下，成骨細(xì)胞的MTT 毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2 所示，兒童配方奶粉的加樣量為5、10、50 μg/mL 時(shí)，與對(duì)照組比較，成骨細(xì)胞的存活率達(dá)到102.00%～107.64%，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害作用。故選擇5、10、50 μg/mL作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)樣品的低、中、高濃度添加量。

圖2 兒童配方奶粉和市售純牛奶A 對(duì)成骨細(xì)胞的毒性作用Fig.2 Toxic effects of children's formula and commercially available pure milk A on osteoblasts

2.3 樣品對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響

細(xì)胞增殖也使用MTT 法。在不同質(zhì)量濃度的兒童配方奶粉和市售純牛奶A 作用下，成骨細(xì)胞的MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3 所示，在5、10、50 μg/mL 質(zhì)量濃度下，兒童配方奶粉和市售純牛奶A 對(duì)成骨細(xì)胞都有促進(jìn)增殖作用，其中兒童配方奶粉組的增殖速度均在25%以上，且在低濃度時(shí)已到達(dá)最高值，為31.16%；而市售純牛奶A 組的增殖速度為10%～15%。相同濃度下，兒童配方奶粉促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖速度是市售純牛奶A 的1.70～3.00 倍，說(shuō)明兒童配方奶粉在促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖上優(yōu)于市售純牛奶A。

圖3 兒童配方奶粉和市售純牛奶A 對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響（顯著性差異p＜0.05）Fig.3 Effect of children's formula and commercially available pure milk A on osteoblast proliferation

2.4 樣品對(duì)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶（ALP）活性的影響

堿性磷酸酶是成骨細(xì)胞胞外基質(zhì)形成的關(guān)鍵酶，具有磷酸酯酶活性，可以水解天然存在的含磷底物，釋放游離磷酸根離子，參與胞外基質(zhì)的礦化沉積。如圖4 所示，在5、10、50 μg/mL 質(zhì)量濃度下，兒童配方奶粉能夠顯著或極顯著提高成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶活性，且呈現(xiàn)濃度依賴，50 μg/mL 質(zhì)量濃度時(shí)達(dá)到7.79 U/g 蛋白；市售純牛奶A 作用質(zhì)量濃度為，在5 μg/mL 時(shí)，對(duì)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶的活性無(wú)顯著性影響，質(zhì)量濃度提高至10 μg/mL 時(shí)極顯著提高酶活性，達(dá)到7.71 U/g 蛋白，但在50 μg/mL 時(shí)效果降低至5.83 U/g 蛋白。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，兒童配方奶粉和市售純牛奶A 都對(duì)堿性磷酸酶活性有積極影響，且兒童配方奶粉的效果在5～50 μg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)更加穩(wěn)定。

圖4 兒童配方奶粉和市售純牛奶A對(duì)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響Fig.4 Effect of children's formula and commercially available pure milk A on alkaline phosphatase activity in osteoblasts

2.5 樣品對(duì)成骨細(xì)胞礦化的影響

茜素紅染色的原理是茜素紅會(huì)和鈣發(fā)生顯色反應(yīng)，產(chǎn)生一種深紅色的化合物。誘導(dǎo)后的成骨細(xì)胞，其外面沉積的鈣結(jié)節(jié)會(huì)被染成深紅色。而西吡氯銨能夠溶解茜素紅顯色，利用這一特性對(duì)礦化結(jié)晶進(jìn)行定量分析。將培養(yǎng)了21 d 后的成骨細(xì)胞進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察不同濃度樣品培養(yǎng)后的成骨細(xì)胞（圖5）。發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，兒童配方奶粉和市售純牛奶A 作用的成骨細(xì)胞有明顯的礦化結(jié)節(jié)產(chǎn)生，形狀多呈圓形或橢圓形，少數(shù)呈不規(guī)則形，而空白對(duì)照組結(jié)節(jié)較少。礦化結(jié)節(jié)與茜素紅染液結(jié)合成深紅色物質(zhì)，表明兒童配方奶粉和市售純牛奶A 能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化。進(jìn)一步利用西吡氯銨對(duì)礦化結(jié)節(jié)進(jìn)行定量分析，結(jié)果如圖6 所示，添加量為5 μg/mL 時(shí)，兒童配方奶粉組、市售純牛奶A 組的吸光值均為0.18，表明礦化結(jié)節(jié)生成量接近。當(dāng)添加量增大至10 μg/mL 和50 μg/mL，市售純牛奶A 組的吸光值分別為0.17、0.15，礦化量稍有降低，而兒童配方奶粉組的吸光值均為0.180，促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化量隨劑量改變無(wú)顯著變化，相較空白對(duì)照組提高50%以上，說(shuō)明奶粉的作用效果更為穩(wěn)定。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，兩種樣品在較低濃度下對(duì)骨有明顯促進(jìn)作用，但在高濃度下促進(jìn)作用反而有所下降，與曾祥偉等[12]的研究結(jié)果相一致。

圖5 兒童配方奶粉和市售純牛奶A 對(duì)成骨細(xì)胞礦化結(jié)晶的影響（400×）Fig.5 Effect of children's formula and commercially available pure milk A on mineralized crystals in osteoblasts (400×)

圖6 兒童配方奶粉和市售純牛奶A 對(duì)成骨細(xì)胞礦化的影響Fig.6 Effect of children's formula and commercially available pure milk A on osteoblast mineralization

MC3T3-E1 細(xì)胞是小鼠顱蓋骨細(xì)胞的前體細(xì)胞，具有成骨細(xì)胞形成過(guò)程中的生物學(xué)特性，包括ALP 活性和基質(zhì)成熟及礦化等，已成為體外研究骨質(zhì)疏松比較有價(jià)值的細(xì)胞模型[13]。張偉[5]也發(fā)現(xiàn)牛乳具有促骨生長(zhǎng)功能，利用成骨細(xì)胞模型證明了乳鐵蛋白可以有效促進(jìn)分化標(biāo)志物堿性磷酸酶活性以及骨鈣素的表達(dá)，且能提高骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的形成，與本研究結(jié)果有類似之處。推測(cè)兒童配方奶粉中，可能存在有較高活性的促成骨細(xì)胞增殖和礦化的物質(zhì)，因此具有潛在的增強(qiáng)骨硬度，抗骨質(zhì)疏松或骨質(zhì)吸收的效果[14]。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)以市售兒童配方奶粉為樣品，評(píng)價(jià)其促進(jìn)鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)能力及對(duì)骨骼健康的作用。發(fā)現(xiàn)在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，兒童配方奶粉雖不能夠明顯促進(jìn)鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)，但對(duì)成骨細(xì)胞增殖和礦化均有正向調(diào)節(jié)作用，說(shuō)明其具有潛在的調(diào)節(jié)兒童骨骼健康作用。