劉麗環(huán)，陳純，黃藤波，曹濤*，李廣鵬，李森

（1. 深圳市億騰檢測科技有限公司，廣東 深圳 518100；2.廣東省檢迅檢測科技有限公司，廣東東莞 523843；3.深圳市深業(yè)航天食品與環(huán)境檢測科技有限公司，廣東 深圳 510100；4.深圳市匯知科技有限公司，廣東 深圳 518101）

苯甲酸也稱安息香酸，屬于芳香族酸，白色固體，微溶于水，其抗菌活性主要來源于未離解酸[1,2]。苯甲酸主要用作食品添加劑，具有抑制食品中微生物繁殖、防止食品腐敗與變質(zhì)、保持食品新鮮的作用，苯甲酸及其鈉鹽均是常用防腐劑之一[3-5]。有研究表明，苯甲酸不會在體內(nèi)蓄積，但過量添加苯甲酸可能對人體產(chǎn)生毒副作用[6]，苯甲酸能破壞細(xì)胞膜有序結(jié)構(gòu)，使膜的功能發(fā)生紊亂，擾亂細(xì)胞內(nèi)的各種平衡機制[7]。過量的苯甲酸鈉可能會引起腹瀉、腹痛和心跳加快等癥狀[8]。國家標(biāo)準(zhǔn)GB2760-2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》對允許使用的食品添加劑的名稱、分類、使用范圍、使用劑量等都做了明確的說明，規(guī)定了苯甲酸及鈉鹽在22種不同食品中限量標(biāo)準(zhǔn)，限量范圍在0.2～2 g/kg不等[9]。

免疫分析方法是利用抗原抗體特異性結(jié)合來設(shè)計實驗，實現(xiàn)對目標(biāo)分析物的高靈敏、高特異性檢測的一種方法。近年來，基于抗原抗體也發(fā)展了幾種方法用于檢測食品中的苯甲酸。其中尤為突出的有熒光偏振免疫分析法和酶聯(lián)免疫吸附法[10]。雖然基于熒光偏振的方法具有較好的性能，然而該方法需要使用熒光標(biāo)記的抗原，且需要熒光偏振儀，導(dǎo)致檢測成本較高。而對于酶聯(lián)免疫的方法，樣品中基質(zhì)的干擾對檢測結(jié)果的影響較大，且需要受過專門訓(xùn)練的人進(jìn)行操作。本文將利用抗原抗體特異性識別的原理，建立一種基于膠體金的免疫層析試紙條用于對食品中的快速、半定量檢測。由于抗體高的特異性及層析試紙條的分離原理，該方法對水產(chǎn)品魚蝦僅需要幾步簡單處理且便捷、快速、不需要使用昂貴的儀器、無需專業(yè)人士操作。因此該方法適用于對食品中苯甲酸的現(xiàn)場篩查。

1 材料和儀器

1.1 主要試劑與材料

氯金酸（AR）、檸檬酸三鈉（AR）、吐溫（tween)-20（CP）、蔗糖（AR）、聚乙二醇 20000（AR）、疊氮鈉（AR）、苯甲酸、苯乙酸、苯酚、苯磺酸、苯丙氨酸購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；牛血清蛋白（BSA)（BR）、羊抗鼠IgG由美國SIGMA公司分裝；樣品杯、吸水紙、樣品墊、PVC 底板和硝酸纖維素膜（Millipore 135）購自美國Millipore；超純水由Milli-Q 超純水系統(tǒng)制備

1.2 主要儀器設(shè)備

冷凍離心機購自美國eppendorf；M3 basic渦旋儀和Topolino磁力攪拌購自德國IKA；TP-213 電子天平購自美國DENVER Instrument；DHG-9140A 電熱恒溫干燥箱購自上海精宏實驗設(shè)備有限公司；XYZ3060噴金劃膜儀購自美國BioDot；可編程切條機購自杭州峰航科技有限公司；DF-101S恒溫加熱器購自鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；凍干機購自美國Labconc；高效液相色譜儀夠自日本島津。

2 試驗方法

2.1 膠體金溶液的制備

所有制備的膠體金的玻璃器皿在制備前均需要經(jīng)酸處理。將所有玻璃器皿用超純水洗凈之后，加入王水涮洗并浸泡2小時，隨后沖洗干凈，烘干備用。

根據(jù)文獻(xiàn)采用以下配方制備膠體金[11]。在250 mL圓底燒瓶中加入100 mL 0.1%的氯金酸溶液，在轉(zhuǎn)速為300 rpm的條件下加熱至溶液沸騰，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 mL 1%的檸檬酸三鈉溶液，保持溫度為在100℃左右10分鐘，然后移除加熱及攪拌，自然冷卻至室溫。制備好的膠體金保存于4℃下。

2.2 膠體金的表征

取膠體金于400～700 nm可見光區(qū)域掃描其吸光度，并據(jù)此判斷其尺寸范圍。

2.3 膠體金抗體的標(biāo)記

2.3.1 最佳標(biāo)記 pH 的確定

在1.5 mL EP管中加入1 mL膠體金溶液，然后分別加入1 mol/L K2CO3溶液調(diào)節(jié)不同pH(7.5、8、8.5、9)，然后在反應(yīng)體系加入6 μL濃度為的苯甲酸抗體，混合均勻后靜置4小時，然后10000 rpm離心10分鐘，取上清液紫外測試。以其OD530值為縱坐標(biāo)，pH為橫坐標(biāo)，其吸收最大的pH為最佳pH。

2.3.2 膠體金最佳標(biāo)記蛋白量的確定

在1.5 mL EP管中加入1 mL膠體金溶液，加入1 mol/L K2CO3條件pH 9.0，將純化后的抗體(1.0 mg/mL)分別取5 uL、10 uL、15 uL、20 uL加入反應(yīng)體系中，混合均勻后靜置4小時，然后10000 rpm離心10分鐘。去除上清液，并加入1 mL復(fù)溶溶液，于渦旋儀上2500 rpm渦旋30秒，觀察上清液及沉淀。出現(xiàn)最少沉淀的為最佳標(biāo)記條件，若有數(shù)個同等條件，則加入蛋白最少量的條件為最佳標(biāo)記量。

2.3.3 復(fù)溶溶液的確定

選 擇1 mol/L pH為7.5及8的Tris溶 液，加入0.5%及1%的不同活性劑（BSA， PEG8000，PEG2000，蔗糖，Tween 20）備用。在標(biāo)記并離心的膠體金沉淀中加入1 mL重懸液，渦旋儀2500 rpm上渦旋30秒，觀察上清液及沉淀，沉淀最少，分散時間最短的重懸液為最佳。

2.3.4 標(biāo)記備用液

綜合2.3.1至2.3.3，確認(rèn)最優(yōu)條件后，取50 mL膠體金，在渦旋條件下按最佳條件調(diào)節(jié)pH及標(biāo)記加入抗體量，靜置4小時，并加入終濃度為1%的BSA，渦旋均勻后放入4℃避光保存。

2.4 標(biāo)記抗體、二抗?jié)舛鹊倪x擇

抗體標(biāo)記量及二抗的濃度決定了試紙條的靈敏度。在抗原濃度一定時，膠體金中標(biāo)記抗體量越少，T線越難顯色即越易消帶，試紙條的靈敏度越高；反之靈敏度越低。C線的二抗起著參比作用，應(yīng)根據(jù)要求T線的靈敏度來確定。其三者需要比對搭配達(dá)到最佳效果。

包被抗原及二抗?jié)舛鹊倪x擇：取不同量的包被抗原及二抗，噴涂于試紙條上，加入不同含量的苯甲酸進(jìn)行層析，并根據(jù)C線、T線的亮度對比和讀數(shù)判斷其合適濃度。在檢測限附近，其讀數(shù)為0.9～1.1，并且具有較好梯度為宜。

2.5 試紙條的組裝

我們選取了流速為80 s/4 cm的硝酸纖維素(NC)膜、樣品墊、吸水紙、底板，按照圖1的方式搭配起來。

圖1 試紙條的組裝

2.6 水產(chǎn)品（魚、蝦）的前處理

組織樣（蝦要去掉頭和殼后徹底清洗干凈，魚要去鱗后洗凈）應(yīng)當(dāng)避光冷藏保存。取切碎的一定量的組織樣本，用均質(zhì)器均質(zhì)；稱取2 g均質(zhì)于15 mL離心管中；用微量移液器加入4.0 mL乙酸乙酯，然后加入4.0 mL NaOH于15 mL離心管中。劇烈振蕩3 min后，室溫下4000 r/min離心5 min；用微量移液器移取3 mL上清于15 mL離心管中，用微量移液器加入1.0 mL正己烷，上下顛倒6次，室溫4000 r/min離心1 min，用微量移液器移取離心管刻度1.0 ～3.0 mL之間的液體（大約2.0 mL）到新的5mL離心管中，再加入MG氧化劑瓶內(nèi)的下層黃色液體0.1 mL，混合均勻1分鐘后，65℃加熱條件下，用空氣吹干；用微量移液器向吹干的離心管中加入300 μL復(fù)溶液，用微量移液器沖洗溶解試管內(nèi)壁上殘留物；靜置2分鐘；吸取待檢樣品溶液100 μL于金標(biāo)微孔中，用小滴管吹打完全溶解孔內(nèi)紅色物質(zhì)，等待反應(yīng)5分鐘。

2.7 試紙條性能測試

2.7.1 試紙條靈敏度測試

取苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品，以購買并經(jīng)高效液相確認(rèn)為未含苯甲酸草魚作為基質(zhì)，加入不同濃度下進(jìn)行加標(biāo)實驗。所有檢測會經(jīng)過肉眼判斷及讀數(shù)儀讀數(shù)判定。若T線顏色深度比C線更強，結(jié)果為陰性，此時讀數(shù)儀讀數(shù)應(yīng)為1.1以上；若T線顏色深度與C線相當(dāng)或叫C線弱，則結(jié)果為陽性，測試讀數(shù)儀讀數(shù)為1.1以下。當(dāng)T線顏色與C線相當(dāng)，讀數(shù)儀讀數(shù)為0.9～1.1時，其苯甲酸濃度為檢測限濃度。若在檢測中發(fā)現(xiàn)C線無顏色，測試紙條已失效。實驗平行進(jìn)行3次。

2.7.2 試紙條假陽性率、假陰性率測試

取陰性草魚待檢樣品溶液200 μL，添加苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品至不同濃度進(jìn)行加標(biāo)實驗。所有檢測經(jīng)過肉眼及讀數(shù)儀讀數(shù)判定，判定標(biāo)準(zhǔn)同上。

2.7.3 試紙條兼容性測試

選取鯽魚、對蝦待檢樣品溶液，添加苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品至不同濃度進(jìn)行加標(biāo)實驗，所有檢測經(jīng)過肉眼及讀數(shù)儀讀數(shù)判定，判定標(biāo)準(zhǔn)同上。

2.7.4 試紙條交叉反應(yīng)率測試

選取一個經(jīng)確認(rèn)為陰性的草魚待檢樣品，分別添加1 mg/L苯甲酸為及10倍量的結(jié)構(gòu)類似物為進(jìn)行加標(biāo)實驗，結(jié)果通過肉眼及讀數(shù)儀進(jìn)行讀數(shù)判定，判定標(biāo)準(zhǔn)同上。

2.7.5 試紙條重復(fù)性測試

選取一個經(jīng)質(zhì)譜確認(rèn)為陰性的草魚待檢樣品，分別添加苯甲酸為4 mg/L進(jìn)行加標(biāo)實驗，結(jié)果通過肉眼及讀數(shù)儀進(jìn)行讀數(shù)判定，判定標(biāo)準(zhǔn)同上。觀察結(jié)果穩(wěn)定性及讀數(shù)穩(wěn)定性。

2.7.6 試紙條穩(wěn)定性測試

試紙條在37℃、50℃分別放置制定天數(shù)，選取一個經(jīng)質(zhì)譜確認(rèn)為陰性的草魚待檢樣品，分別添加苯甲酸為1 mg/L進(jìn)行加標(biāo)實驗，結(jié)果通過肉眼及讀數(shù)儀進(jìn)行讀數(shù)判定，判定標(biāo)準(zhǔn)同上。觀察結(jié)果穩(wěn)定性及讀數(shù)穩(wěn)定性。

2.7.7 試紙條與高效液相色譜法的比對

目前，國標(biāo)采用高效液相色譜進(jìn)行測定，要確定試紙條的準(zhǔn)確性，需要與國標(biāo)進(jìn)行比對。在進(jìn)行液相色譜測試前，需使用苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行標(biāo)曲繪制，然后再進(jìn)行樣品測試。

3 結(jié)果與討論

3.1 膠體金的表征

膠體金的尺寸與其顏色相關(guān)，尺寸不同，呈現(xiàn)的顏色也不同。尺寸在5～20 nm之間，波長為520 nm，顏色為酒紅色；尺寸在20～40 nm之間，波長為530 nm，顏色為深紅色；尺寸在60 nm時，溶液主要波長為600 nm，顏色為藍(lán)紫色。

如圖2，我們制得的膠體金的紫外圖譜最大吸收峰為529 nm，顏色為深紅色。根據(jù)文獻(xiàn)，其尺寸為20～40 nm。

圖2 膠體金的紫外吸收光譜

3.2 最佳標(biāo)記pH的確定

pH對蛋白在膠體金上的標(biāo)記具有重要影響，當(dāng)pH不合適時容易造成”死金”現(xiàn)象，即膠體金顏色變灰褐色，如圖3。pH從左到右分別為7.5、8.0、8.5、9.0。由圖3中可知最佳標(biāo)記的pH為8.5及9.0。測試其波長在529 nm的吸收值，可見在pH為9.0時，其吸收值最大，說明溶液中的膠體金含量最多，此條件下標(biāo)記最穩(wěn)定。

圖3 左：pH從左到右分別為7.5，8.0，8.5及9.0 右：不同pH的膠體金吸光度

3.3 最佳抗體蛋白標(biāo)記量的確定

抗體純化后濃度稀釋為1 mg/mL，在調(diào)節(jié)至pH為9的1 mL膠體金中分別加入5 μL、10 μL、15 μL、20 μL。穩(wěn)定后觀察現(xiàn)象，結(jié)果如圖4。當(dāng)抗體含量逐漸增大，膠體金的顏色出現(xiàn)變化。含量為5 μL、10 μL、15 μL時，膠體金的顏色變化不明顯，當(dāng)抗體含量為20 μL時，膠體金顏色變?yōu)榛液稚?，即出現(xiàn)死金現(xiàn)象，說明抗體的量過大，使得膠體金團(tuán)聚，因此抗體標(biāo)記量不應(yīng)超過15 μL。隨后再將加入5～15 μL抗體的膠體金試管10000 rpm離心10分鐘，去除上清液，并加入1 mL重懸液（使用1% tween 20）渦旋，比較溶液顏色。結(jié)果如下圖4，可見當(dāng)抗體為15 μL時，膠體金溶液未能完全分散，說明蛋白量過多，而5 μL和10 μL的膠體金可完全重新分散，因此標(biāo)記量合適。考慮到節(jié)約成本的關(guān)系，我們最終確定最佳抗體標(biāo)記量為5 μg/mL。

圖4 抗體蛋白標(biāo)記量（從左到右抗體加入量分別為5 μL，10 μL及15 μL）

3.4 復(fù)溶液的確定

復(fù)溶液的合適選擇可以使得標(biāo)記后膠體金得到最大程度的回收。往離心后的膠體金沉淀中加入等體積不同復(fù)溶液，渦旋后比較不同復(fù)溶液中膠體金的分散情況，當(dāng)所需時間最短，沉淀最少，且無”掛壁”現(xiàn)象(即膠體金黏附于管壁)的為最佳復(fù)溶液。比較含量為0.5%～1%的含BSA，PEG8000，PEG2000，蔗糖及Tween 20的pH為9.0的0.5 M Tris 復(fù)溶液，效果最佳的為0.5%及1%的Tween 20。因此選用0.5%的Tween 20 pH為9.0的0.5M Tris為復(fù)溶液。

綜合3.2到3.4，可知膠體金標(biāo)記的最佳條件為pH為9.0，抗體標(biāo)記含量為5 μL，復(fù)溶液為0.5%的Tween 20 pH為9的0.5 M Tris。

3.5 標(biāo)記抗體、包被抗原及二抗?jié)舛却_定

因試紙條采用比色法，當(dāng)T線與C線相當(dāng)或T線比C線顏色弱時，則結(jié)果為陽性；當(dāng)T線比C線深時，結(jié)果為陰性。在包被抗原濃度一定時，當(dāng)二抗?jié)舛仍礁撸珻線約亮，結(jié)果可能陰性偏高；當(dāng)標(biāo)記抗體濃度越高，T線越亮，其陽性結(jié)果越難呈現(xiàn)。而當(dāng)標(biāo)記抗體的量一定時，包被抗原濃度越高，T線越亮。因此標(biāo)記抗體、包被抗原濃度及二抗標(biāo)記濃度決定了試紙條的靈敏度，需要根據(jù)目標(biāo)的檢測限配合來調(diào)。

本次調(diào)試，希望苯甲酸能夠?qū)z測限調(diào)至1 mg/L。因此，加標(biāo)濃度選取0.5～4 mg/L。根據(jù)之前的篩選，選取最低標(biāo)記量的5 μL抗體標(biāo)記于膠體金。

首先，需要篩選合適的包被抗原。目前知道的包被抗原有對氨苯甲酸戊二醛-BSA，對氨苯甲酸N2-BSA，對氨苯甲酸環(huán)乳及對羥基苯甲酸-BSA。先選取二抗10 μL、標(biāo)記抗體10 μL、包被抗原均取5 μL，在試紙條上層析。結(jié)果如圖5，可知對羥基苯甲酸-BSA顯色條帶最明顯，因此優(yōu)選為包被抗原。

圖5 包被抗原選擇圖

其次，調(diào)整加標(biāo)條件。選取二抗10 μL，包被抗原選取對羥基苯甲酸-BSA（濃度為1 mg/mL）5 μL?？贵w為5 μL，加標(biāo)分別為0.5 mg/L、1.0 mg/L、4.0 mg/L，結(jié)果如圖5所示，其C線過亮，T線較弱。因此，需要將二抗?jié)舛冉档?，并調(diào)高T線濃度。因此將二抗調(diào)至5 μL，抗體濃度分別為4 μL及8 μL。結(jié)果如圖6。在標(biāo)記抗體濃度為6 μL時，加標(biāo)4 mg/L，T線條帶亮度依然較高，因此依然需要配合C線進(jìn)行調(diào)節(jié)。但從效果看，已經(jīng)接近需求范圍。

圖6 不同添加量T線及C線效果

為了更準(zhǔn)確地調(diào)試試紙條條件，采用讀數(shù)儀對試紙條結(jié)果進(jìn)行判讀，當(dāng)讀數(shù)為0.9～1.1時，為弱陽性；小于0.9時為強陽性，大于1.1時為陰性。圖7 A、B及C，C線分別為5 μL、8 μL、10 μL，記抗體分別為6 μL、7 μL及7 μL。比較3圖中可見當(dāng)加標(biāo)量為1 mg/L時，圖B和圖C中數(shù)值為1.33和0.67，因此理想加標(biāo)量應(yīng)該落在兩者間。調(diào)節(jié)條件C線為9 μL，T線為7 μL，得圖D，當(dāng)加標(biāo)量為1 mg/L時，數(shù)值為0.96，落在檢出限判讀區(qū)間。因此確定C線(二抗噴涂量)為9.0 μL，T線（包被抗原噴涂量）為7.0 μL，而膠體金標(biāo)記抗體量為5.0 μL。確定此條件后，我們進(jìn)行了小量制備，噴涂2000份測試量進(jìn)行試紙條性能試驗。

圖7 不同添加量T線及C線效果及讀數(shù)

3.6 試紙條性能測試

3.6.1 試紙條靈敏度測試

首先我們進(jìn)行了加標(biāo)實驗。取陰性草魚樣品，分別按下表加入苯甲酸進(jìn)行免疫層析測試。所有實驗平行進(jìn)行50次。

根據(jù)表1，可見試紙條在加標(biāo)量為1.0 mg/L時均可以報陽，報陽率100%。因此，其靈敏度可達(dá)到目標(biāo)設(shè)定的1.0 mg/L。

表1 苯甲酸試紙條靈敏度測試

3.6.2 試紙條假陽性率，假隱形率測試

取陰性草魚樣品溶液100 μL，分別按下表加入苯甲酸進(jìn)行免疫層析測試。所有實驗平行進(jìn)行10次。

根據(jù)表2，可見試紙條在加標(biāo)量為1.0 mg/L及更高時均可以報陽，報陽率100%，加標(biāo)量為0.5 mg/L時均顯示陰性，報陰率100%。因此，其假陽性率及假陰性率均為0%。

表2 苯甲酸試紙條假陽性率及假陰性率測試

3.6.3 試紙條交叉反應(yīng)率測試

試紙條的交叉反應(yīng)率可以反映試紙條的特異性。取苯甲酸類似物甲苯、苯酚、苯乙酸、苯丙氨酸、苯磺酸，其加標(biāo)量為苯甲酸的10倍，進(jìn)行測試，所有測試平行10次。結(jié)果見表3。

根據(jù)表3，所有類似物在10 mg/L時試紙條均沒報陽，只有苯甲酸呈陽性，因此無交叉反應(yīng)。

表3 苯甲酸試紙條交叉反應(yīng)率測試

3.6.4 試紙條重復(fù)性測試

取陰性草魚檢樣品溶液100 μL，按表4添加苯甲酸，共測試30次，觀察判讀結(jié)果。

根據(jù)表4，試紙條重現(xiàn)性100%，重復(fù)性良好。

表4 苯甲酸試紙條重復(fù)性測試

此外，分別購買另外2個魚類樣品（鯽魚、鰱魚）和1個蝦類樣品（對蝦），每批次取10個樣品，分別為陰性樣本及1.0 mg/L添加，進(jìn)行重復(fù)性檢測。

結(jié)果如表5所示，在不同類別水產(chǎn)品中，試紙條均能檢出1.0 mg/L苯甲酸，未添加樣品均報陰性，因此試紙條重復(fù)性優(yōu)良。

表5 不同類別水產(chǎn)品苯甲酸重復(fù)性檢測結(jié)果

3.6.5 試紙條穩(wěn)定性測試

將試紙條分別置于37℃及50℃條件下，對其檢測性能進(jìn)行跟蹤。在不同時間抽取裝置對樣品進(jìn)行檢測，每次檢驗陰性及陽性樣品各5個。結(jié)果如下：

從表6可看出，苯甲酸試紙條在37℃可以至少存放35天，50℃可以存放6天左右，擁有足夠的穩(wěn)定性。

表6 苯甲酸試紙條穩(wěn)定性檢測結(jié)果

3.6.6 試紙條與高效液相色譜法檢測結(jié)果比對

目前國標(biāo)是使用高效液相色譜法（GB 5009.28-2016）。在測試前，先繪制標(biāo)曲。分別往陰性草魚中加入苯甲酸含量為0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.5 mg/L、4.0 mg/L及5.0 mg/L，并進(jìn)行HPLC測試。結(jié)果如圖8，回歸方程為Y＝56749.57X＋247216.42（R2＝0.99899），線性良好，復(fù)合要求。接著進(jìn)行苯甲酸樣品測試，添加樣品為1 mg/L及陰性樣品，分別進(jìn)行高效液相色譜及試紙條測試，平行重復(fù)5次，結(jié)果如表7所示，可知試紙條與液相色譜對比具有同樣的檢出性。

圖8 苯甲酸高效液相色譜標(biāo)準(zhǔn)曲線及其圖譜

表7 苯甲酸試紙條與高效液相色譜檢測結(jié)果比對

4 結(jié)論

實驗選擇檸檬酸三鈉還原制備膠體金，制備的膠體金粒徑為20～40 nm；利用膠體金來標(biāo)記苯甲酸單克隆抗體，再將BA人工合成抗原（BA-BSA）和羊抗鼠二抗（IgG）分別包被在硝酸纖維素膜的T線和C線處，組裝成膠體金免疫層析試紙條；單抗的最佳標(biāo)記量為5.0 μg/mL，單抗標(biāo)記最佳的pH為9.0，復(fù)溶液為0.5%的Tween 20 pH為9.0的0.5 mol/L Tris；抗原的最佳包被量為7.0 μL，二抗的最佳包被量為9.0 μL，膠體金標(biāo)記抗體量為5.0 μL，膠體金免疫層析試紙條的目測檢測限為1.0 mg/L。試驗對苯甲酸試紙條的重復(fù)性、穩(wěn)定性、假陽性及假陰性率的測試驗證，結(jié)果良好。并研究了幾種與苯甲酸結(jié)構(gòu)類似物對試紙條的特異性，實驗結(jié)果顯示：試紙條對甲苯、苯乙酸、苯磺酸、苯丙氨酸等均不發(fā)生交叉反應(yīng)性。將試紙條方法和高效液相色譜法做比較，結(jié)果顯示試紙條和高效液相色譜法結(jié)果一致。