朱年青，贠雪，申小倩，徐佳慧，李澤宇，夏文靜

（1.泰州學院，江蘇 泰州 225300；2.南京師范大學泰州學院，江蘇 泰州 225300）

甘露糖赤蘚糖醇脂不僅具備作為表面活性劑優(yōu)良的界面特性，而且還具有多功能的生物活性，如對人類白血病、大鼠嗜鉻細胞瘤和小鼠黑色素瘤細胞的分化誘導；對不同的免疫球蛋白和凝集素也表現(xiàn)出很高的結合親和力[1]。甘露糖赤蘚糖醇脂（MELs）包含4-O-β-D-甘露糖基赤蘚糖醇或1-O-β-D-甘露糖基赤蘚糖醇作為親水基團，脂肪酸作為疏水鏈，是由假絲酵母屬菌株大量產生的功能性糖脂[2]。其中，A 型甘露糖赤蘚糖醇脂和二乙?；母事短浅嗵\糖醇脂，能夠提高陽離子脂質體介導的基因轉移的效率。此外，甘露糖赤蘚糖醇脂具有抗炎作用，能夠抑制肥大細胞分泌炎癥介質，這使得甘露糖赤蘚糖醇脂在化妝品、醫(yī)藥等方面具有廣泛應用價值。

甘露糖赤蘚糖醇脂包括4 種不同的結構[3]。其中，A 型甘露糖赤蘚糖醇脂中，甘露糖上含有2 個乙酰基，B 型甘露糖赤蘚糖醇脂中，甘露糖上C-6 位含有1 個乙?；?，C 型甘露糖赤蘚糖醇脂中，甘露糖上C-4 位含有1 個乙?；珼 型甘露糖赤蘚糖醇脂中甘露糖上不含乙?；?。甘露糖赤蘚糖醇脂的界面性能和自組裝性能的研究表明，分子結構（包括乙?；臄盗浚┑奈⑿〔町?，會導致臨界膠束濃度（CMC）的顯著差異和液晶相的形成[4]。A 型甘露糖赤蘚糖醇脂在處理水溶液方面存在缺陷，因為它的水溶性和親水性很低，限制了其實際應用。另一方面，A 型甘露糖赤蘚糖醇脂的脫乙酰衍生物B 型和C 型比A 型具有更高的親水性和臨界膠束濃度[5]，使得它們在油包水型乳化劑和/或洗滌劑中具有極大的優(yōu)越性，在環(huán)保、日化、農業(yè)和醫(yī)藥等領域的應用受到廣泛的關注。有關學者報道了非對映體B 型甘露糖赤蘚糖醇脂的水相行為，其在非常寬的濃度和溫度范圍內自發(fā)組裝成層狀相，并在低濃度下形成相對較大的囊泡（1～5 μm）[6]。這些結果表明，非對映體B 型甘露糖赤蘚糖醇脂作為囊泡形成脂質具有巨大的潛力，在藥物和基因傳遞等方面有很大的應用需求。同時，由于中心位紅糖醇部分的獨特構型，非對映體糖脂表現(xiàn)出更優(yōu)越的護膚性 能。

鑒于此，本文從三個方面研究湖北擬酵母發(fā)酵合成B 形甘露糖赤蘚糖醇脂的影響因素，分別是：（1）橄欖油、玉米油、大豆油和花生油四種碳源對甘露糖赤蘚糖醇脂產量的影響；（2）酵母提取物、麥芽提取物、玉米浸粉和蛋白胨四種有機氮源對甘露糖赤蘚糖醇脂產量的影響；（3）在氮源總量不變的情況下，無機氮源硝酸鈉與有機氮源酵母提取物之間的配比對甘露糖赤蘚糖醇脂產量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

湖北擬酵母（Pseudozyma Tsukubaensis）購買于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 培養(yǎng)基及搖瓶發(fā)酵

（1）YM 活化培養(yǎng)基（g/L）：麥芽汁提取物3.0、酵母提取物3.0、蛋白胨5.0、葡萄糖10.0、瓊脂20.0。配制后121 ℃滅菌20 min，適溫倒平板，無菌環(huán)境下操作。

（2）液體種子培養(yǎng)基（g/L）：酵母提取物3.0、麥芽汁提取物3.0、葡萄糖10.0、蛋白胨5.0、（pH 值6.0）。配制后按10 mL/瓶（100 mL 三角瓶）分裝，121 ℃滅菌20 min。

（3）發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅰ（g/L）：酵母提取物3.0、NaNO31.0、MgSO4·7H2O 0.30、KH2PO40.30、碳源種類和添加量根據試驗設計進行，pH 值為6.0。按100 mL/瓶（500 mL 三角瓶）進行分裝，121 ℃滅菌20 min。

（4）發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅱ（g/L）：橄欖油120.0、NaNO31.0、MgSO4·7H2O 0.30、KH2PO40.30、有機氮源種類和添加量根據試驗設計進行，（pH 值6.0）。按100 mL/瓶（500 mL 三角瓶）分裝，121 ℃滅菌20 min。

將4 ℃斜面保藏的菌種通過平板劃線法轉接于YM 活化培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)3 d；于平板上挑取單菌落于10 mL 液體種子培養(yǎng)基中，25 ℃、250 r/min條件下培養(yǎng)24 h；將種子培養(yǎng)液混勻，按照4%（V/ V）的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，于25 ℃、250 r/min條件下培養(yǎng)7 天。

1.2 實驗設計

1.2.1 不同碳源植物油對湖北擬酵母合成MELs 的影響

選取橄欖油、玉米油、大豆油和花生油作為湖北擬酵母發(fā)酵培養(yǎng)基的的碳源，加入量為120 g/L，每組各設置3 個平行組。將活化好的菌種接種至發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅰ中，對比發(fā)酵7 天后MELs 的產量。確定最優(yōu)碳源后，將最優(yōu)碳源分別按照40 g/L、80 g/L、120 g/L、200 g/L 的加入量添加至于發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅰ中，并編號為A、B、C、D 組，每組各3 個平行組。對比發(fā)酵7 天后MELs 的產量。

1.2.2 不同有機氮源對湖北擬酵母合成MELs 的影響

實驗分別選取酵母提取物、麥芽浸粉、玉米浸粉和蛋白胨作為湖北擬酵母發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源，加入量均為3 g/L，并編號A、B、C、D 組，每組各設置3 個平行組。將活化好的菌種接種至發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅱ中，對比發(fā)酵7 天后MELs 的生物合成產量。

確定最優(yōu)氮源后，針對最優(yōu)氮源分別按照1.0 g/ L、3.0 g/L、5.0 g/L、7.0 g/L 的加入量添加至發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅱ中，并編號為A、B、C、D 組，每組各3 個平行組。對比發(fā)酵7 天后MELs 的產量。

1.2.3 氮源復配對湖北擬酵母合成MELs 的影響

為進一步研究無機氮源和有機氮源組合對MELs發(fā)酵的影響，將硝酸鈉和酵母提取物進行了復配。保持氮源的總添加量不變，調整兩種組分的含量，編號為A，B，C，D 和E，分別加入4.0 g/L 酵母提取物、3.0 g/L 酵母提取物+1.0 g/L NaNO3、2.0 g/L 酵母提取物+2.0 g/L NaNO3、1.0 g/L 酵母提取物+3.0 g/L NaNO3、4.0 g/L NaNO3。對比發(fā)酵7 天后MELs 的產量。

1.3 甘露糖赤蘚糖醇脂定量分析

甘露糖赤蘚糖醇脂利用Agilent 1100 HPLC檢測。色譜柱型號為Inertsil SIL 100A（5 μm，4.6 mm×250 mm），檢測器為蒸發(fā)光散射檢測器。

2 結果與分析

2.1 不同碳源對湖北擬酵母合成MELs 的影響

固定除碳源以外的其他成分，A 組、B 組、C 組、D 組分別加入等量的不同碳源物質，發(fā)酵7d 后，測定各組所產MELs 的量。結果如表1所示：四種碳源中，添加橄欖油為碳源時，MELs 產量最高，可達50 g/L，可能是橄欖油的脂肪酸的組成更適合MELs的合成。

表1 不同種類碳源對MELs 合成的影響Tab.1 Effects of different carbon sources on MELs production

橄欖油是最合適的碳源，繼而進一步探究該碳源的最適加入量，在其他成分相同的情況下，A 組、B 組、C 組、D 組分別按照40 g/L、80 g/L、120 g/L、200 g/L 添加量，將橄欖油加入培養(yǎng)基中，發(fā)酵7d 后，測定各組MELs 產量。結果如表2所示：4 個濃度中，120 g/L 的橄欖油添加量最適合湖北擬酵母發(fā)酵生產MELs，產量可達52 g/L，當橄欖油濃度高于120 g/L，則會抑制菌株代謝油脂合成MELs。

表2 橄欖油濃度對MELs 合成的影響Tab.2 Effects of olive oil concentration on MELs production

2.2 不同氮源對湖北擬酵母合成MELs 的影響

固定除氮源以外的其他成分，A 組、B 組、C 組、D 組分別加入等量的不同的氮源物質，發(fā)酵7 d 后，測定各組所產MELs 的量。結果如表3所示：4 種氮源中，添加酵母提取物為氮源時，MELs 產量最高可達50 g/L，可見酵母提取物中的維生素、生長因子等成分能顯著促進MELs 的合成。

表3 不同種類氮源對MELs 合成的影響Tab.3 Effects of different nitrogen sources on MELs production

通過實驗設計發(fā)現(xiàn)酵母提取物是最合適的氮源，為進一步探究該氮源的最適加入量，在其他成分相同的情況下，A 組、B 組、C 組、D 組分別按照1.0 g/L、3.0 g/L、5.0 g/L、7.0 g/L 添加量，將酵母提取物加入培養(yǎng)基中，發(fā)酵7 d 后，測定各組MELs 產量。結果表4所示：4 個濃度中，3 g/L 的酵母提取物添加量最適合湖北擬酵母發(fā)酵生產MELs，產量可達52 g/L。

表4 酵母提取物濃度對MELs 合成的影響Tab.4 Effects of yeast extract concentration on MELs production

2.3 氮源復配對湖北擬酵母合成MELs 的影響

為進一步研究無機氮源和有機氮源組合對MELs發(fā)酵的影響，將硝酸鈉和酵母提取物進行了復配。保持氮源的總添加量不變，對比A，B，C，D 和E 五個組合發(fā)酵7 天后MELs 的產量。結果如表5所示：當氮源配比為B 組合：1 g/L NaNO3+3 g/L 酵母提取物，即無機氮源/有機氮源=1/3 時，最適合湖北擬酵母發(fā)酵生產MELs，產量可達55 g/L。無機氮源有利于MELs 的合成，有機氮源有利于菌體的生長，當兩種氮源比例合適時，菌株才能夠生長并高效合成MELs。

表5 不同氮源復配比例對MELs 合成的影響Tab.5 Effects of different ratios of nitrogen sources on MELs production

3 結論與討論

本研究以湖北擬酵母為發(fā)酵菌株，探究不同碳源、有機氮源及二者的添加量對微生物合成MELs 的影響。結果表明碳源中橄欖油更有利于湖北擬酵母發(fā)酵合成MELs，而有機氮源中酵母提取物更有利于湖北擬酵母發(fā)酵合成MELs。在選取硝酸鈉和酵母提取粉進行復配的實驗中發(fā)現(xiàn)：以3.0 g/L 酵母提取物和1.0 g/L 硝酸鈉組合時，最適合于湖北擬酵母發(fā)酵合成MELs。湖北擬酵母發(fā)酵合成MELs 的最優(yōu)培養(yǎng)基組成成分為：橄欖油120 g/L、酵母提取物3.0 g/ L、NaNO31.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.30 g/L、KH2PO40.30 g/ L，此條件下湖北擬酵母發(fā)酵7 d 后MELs 產量可達55 g/L。