曾渙煌，梁秀萍，李思琪，劉夫國

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

蛋白質(zhì)作為重要的生物大分子之一，在傳統(tǒng)以及新型食品中具有關(guān)鍵作用。蛋白質(zhì)的凝膠特性是蛋白質(zhì)獲得理想感官和質(zhì)構(gòu)的重要性質(zhì)，調(diào)控蛋白質(zhì)的凝膠特性可以擴展其在食品工業(yè)領(lǐng)域中的應(yīng)用。乳清分離蛋白(WPI)因具有豐富的營養(yǎng)和優(yōu)良的凝膠特性，在蛋白質(zhì)凝膠的生產(chǎn)與應(yīng)用中占據(jù)重要地位。從結(jié)構(gòu)上看，WPI由一系列球狀蛋白組成，包括α-乳白蛋白(α-lactalbumin)、β-乳球蛋白(β-lactoglobulin)、牛血清白蛋白(BSA)、免疫球蛋白等[1]。在營養(yǎng)價值方面，WPI具有較高的生物活性和支鏈氨基酸含量，擁有含硫氨基酸，可以維持體內(nèi)谷胱甘肽的水平，且具有抗癌等特性[2]。

WPI凝膠的制備方式分為熱處理和冷誘導(dǎo)，二者在原理上都是對WPI采取一定的變性處理。其中，熱處理為傳統(tǒng)制備方法。當(dāng)體系加熱至85℃以上時，WPI通過硫醇/二硫鍵交換機制產(chǎn)生的共價鍵和氫鍵、疏水相互作用、靜電作用、范德華力等非共價相互作用，形成隨機交聯(lián)的聚集體[3]。熱處理工藝雖然簡單，但其能耗較高且不利于凝膠中熱敏性化合物的遞送[4];此外，WPI凝膠的熱變性過程還會受到蛋白質(zhì)濃度、離子強度和pH值的影響。因此，出現(xiàn)了以預(yù)熱處理為起點的WPI冷誘導(dǎo)凝膠制備方式。WPI冷誘導(dǎo)凝膠制備主要分為兩個階段，一是預(yù)熱高于等電點的中性(pH≈7.0)低離子強度蛋白質(zhì)溶液，使其在一定程度上變性以形成可溶性聚合物(穩(wěn)定的分散體)；二是進行酸化以達到等電點，形成酸誘導(dǎo)的冷凝膠，或者添加單價、二價和多價陽離子鹽以降低蛋白間的排斥力，形成鹽誘導(dǎo)的冷凝膠。與傳統(tǒng)的熱處理凝膠相比，冷誘導(dǎo)凝膠顯示出諸多優(yōu)越性能，如更高的凝膠強度和持水能力以及更低的臨界凝膠濃度[5]。Ni等研究了WPI分子聚集行為對預(yù)熱溫度以及蛋白質(zhì)和鈣濃度的依賴性[6]。Kharlamova等也對酸誘導(dǎo)的WPI凝膠化進行了研究，證實熱激活酸誘導(dǎo)WPI凝膠的膠凝速率顯著高于鈣處理凝膠[7]。與熱處理法相比，冷誘導(dǎo)膠凝通過變性引發(fā)WPI分子內(nèi)部不同官能團暴露，使其中的多肽鏈之間產(chǎn)生氫鍵、靜電和疏水相互作用，進而加強凝膠的空間結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性。

近年來，隨著WPI凝膠在食品工業(yè)應(yīng)用中的縱向深入，通過酶和醇改性WPI使其形成冷誘導(dǎo)凝膠的方法得到關(guān)注，分別采用谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(TG酶)交聯(lián)和乙醇誘導(dǎo)WPI制備冷凝膠的方法得到了更多的研究與完善。TG酶的最佳酶促溫度在50 ℃左右，其在約1 h內(nèi)即可高效修飾WPI，使WPI部分交聯(lián)形成分子量在55～200 kDa的高分子量聚合物[8]，其作用機制為催化蛋白質(zhì)中賴氨酸(Lys)上ε-氨基和谷氨酸(Gln)上γ-羥基酰胺基之間的結(jié)合反應(yīng)，形成ε-(γ-谷氨酰胺基)賴氨酸異肽鍵(G-L共價鍵)，該鍵強度是氫鍵和疏水相互作用力的20倍左右[9]。WPI中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白固有的球狀結(jié)構(gòu)(二硫鍵包埋其中)及氨基酸構(gòu)成決定了其表面具有較少的TG酶作用位點，不利于酶促反應(yīng)[10-11]，故單純使用TG酶改性需要預(yù)熱處理WPI以暴露更多的酶促位點。該操作雖然能夠使凝膠結(jié)構(gòu)更為致密，但易破壞體系中的熱敏性成分，較難匹配凝膠生產(chǎn)的多樣性。

乙醇作為一類小分子有機溶劑，具有親水性羥基(—OH)和疏水短碳鏈(CH3—CH2—)，為兩親分子，可與蛋白質(zhì)發(fā)生不同作用。在對蛋白質(zhì)的影響上，乙醇的低極性會使蛋白質(zhì)周圍的電荷密度發(fā)生變化，進而使相對疏水的基團暴露[12]。Yoshizawa等的研究也表明乙醇能夠通過改變帶電基團的自由能來增強分子間的靜電排斥力，并與溶質(zhì)-溶劑相互作用，協(xié)同決定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的程度，使蛋白質(zhì)在宏觀上出現(xiàn)可溶性聚集體或沉淀[13]。Kleemann等對此做出了詳細解釋：由于乙醇導(dǎo)致體系相對介電常數(shù)降低，蛋白質(zhì)上的部分反離子失去遷移率并在帶電荷的氨基酸側(cè)鏈上積累，產(chǎn)生偶極-偶極相互作用，形成新的更強的疏水相互作用和氫鍵，進而造成分子的致密堆積，宏觀上即形成凝膠[14]。選用乙醇誘導(dǎo)的WPI凝膠優(yōu)勢在于其可作為遞送體系保護熱敏成分(例如維生素B1和益生菌等)[4]。此外，熱誘導(dǎo)WPI的臨界質(zhì)量分數(shù)為10%～12%[15]，而乙醇誘導(dǎo)形成WPI凝膠的方法可以通過提高乙醇濃度及加快變性速率來降低WPI的成膠臨界濃度[16]。綜上，乙醇誘導(dǎo)處理對TG交聯(lián)的WPI冷凝膠具有工藝優(yōu)化、提質(zhì)增效等實際生產(chǎn)意義。但乙醇對TG酶也具有一定程度的變性作用，會干擾TG酶的酶促作用，故需要尋求二者協(xié)同的最佳工藝以制備優(yōu)質(zhì)的WPI冷凝膠。

本文旨在探究乙醇誘導(dǎo)與TG酶交聯(lián)對WPI改性的相互作用，揭示冷誘導(dǎo)WPI凝膠的形成機理并表征其各項性能；進而尋求WPI凝膠的最優(yōu)制備工藝，使在一定蛋白質(zhì)濃度下能夠形成性狀更為優(yōu)良的WPI凝膠，提高WPI凝膠的生產(chǎn)效率和質(zhì)量，滿足當(dāng)下新型蛋白凝膠食品的多元化需求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳清分離蛋白(純度90%)，上海普洛欽國際貿(mào)易有限公司；谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(活性120 U/g)，江蘇一鳴生物有限公司；無水乙醇(分析純)，天津市致遠化學(xué)試劑有限公司；Fast Green F7252，西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司。

84-1A多頭磁力攪拌器，金壇區(qū)西城新瑞儀器廠；TA Q2000差示掃描量熱儀，美國TA儀器公司；DHR-1流變儀，美國Waters公司；LGJ-10C冷凍干燥機，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；S-3400N掃描電子顯微鏡，日本日立公司；LECIA TCS SP8生物激光共聚焦顯微鏡，德國萊卡公司；TA.XT Plus物性測定儀，英國Stable Micro Systems Ltd公司；Vetex70傅里葉近紅外光譜儀，德國布魯克公司；5804R高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；JM-B電子天平，余姚市紀銘稱重校驗設(shè)備有限公司；PB-10 pH計，計賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；QL-901渦旋混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 水凝膠的制備

配制質(zhì)量濃度120 g/L的WPI溶液，室溫下過夜攪拌使其充分溶解；用2 mol/L的NaOH溶液將WPI溶液的pH值調(diào)至7.0；WPI溶液在8 000 r/min條件下離心20 min，取上清液。設(shè)置2組樣品,乙醇-TG酶聯(lián)合處理組中添加TG酶溶液，控制酶活力為120 U/g；向單獨乙醇處理組添加等體積的蒸餾水作為空白。將2組樣品共置于50 ℃水浴鍋中，水浴2 h，使乙醇-TG酶聯(lián)合處理組的TG酶交聯(lián)WPI；交聯(lián)結(jié)束后冷卻樣品至常溫并向2組樣品中添加無水乙醇，控制乙醇的最終體積分數(shù)分別為0、30%、40%、50%、60%，室溫下靜止4 h，形成冷誘導(dǎo)WPI凝膠。

1.2.2 掃描電子顯微鏡(SEM)觀察

通過SEM觀察水凝膠的微觀結(jié)構(gòu)。將冷凍干燥后的樣品固定在雙面膠帶上，再涂上一層30 nm金色的濺射涂層，使其導(dǎo)電45 s，在320 V條件下放大1 000倍對其表面結(jié)構(gòu)進行觀測。

1.2.3 生物激光共聚焦顯微鏡(CLSM)觀察

參考Wagner等的方法并加以調(diào)整，借助CLSM觀察WPI凝膠的微觀結(jié)構(gòu)[17]?？刂芖PI溶液和乙醇的總體積為100 μL，按照此前設(shè)計的梯度濃度將適量WPI溶液滴加于載玻片的空腔內(nèi)，添加10 μL Fast Green(質(zhì)量濃度0.1 g/L，溶于蒸餾水)對WPI溶液進行染色，隨后在載玻片空腔內(nèi)滴加乙醇使其誘導(dǎo)WPI變性，最后蓋上蓋玻片孵育2 h，待其在腔內(nèi)形成凝膠后放置于4 ℃冰箱內(nèi)貯存24 h穩(wěn)定，并最大限度減少測量前水或乙醇的蒸發(fā)。觀測時，用波長633 nm的He-Ne激光掃描記錄，在40倍物鏡下獲得CLSM圖像，最后在x-y平面上將圖像大小調(diào)整為2 048×2 048像素，平均8次掃描來生成每張圖像，且所有測量均在20 ℃下進行并至少平行3次。

1.2.4 差示量熱掃描(DSC)分析

使用DSC對凍干樣品的熱行為進行測定。將凍干后的樣品研磨成粉末，在50 ℃下干燥48 h，取3.0 mg樣品置于鋁盤中，用鋁蓋密封。樣品以10 ℃/min的加熱速率從20 ℃加熱到200 ℃。記錄DSC曲線，依據(jù)熱分析圖分析樣品的變性溫度峰值(Td)和變性焓(ΔH)。

1.2.5 傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)分析

參照Yu等的方法，通過傅里葉變換紅外光譜儀記錄WPI凝膠樣品的紅外光譜[18]。將凍干樣品2 mg與198 mg 溴化鉀(KBr)混合，研磨成細粉壓片，在4 000～400 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)掃描64次，觀察其在酰胺A、B帶和酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ帶的吸收峰變化。用OMNIC 8.2數(shù)據(jù)處理軟件對原始數(shù)據(jù)的酰胺Ⅰ帶(1 700～1 600 cm-1)進行二階導(dǎo)數(shù)處理，并用9個平滑點的Savitzky Golay算法分析WPI凝膠樣品吸收峰的變化。

1.2.6 流變特性分析

參照Liang等的方法，使用動態(tài)剪切流變儀表征水凝膠的流變性質(zhì)[19]。在25 ℃條件下，使用40 mm平行板，設(shè)置間距為1 mm。在樣品外緣涂上一層薄薄的硅油，防止水分蒸發(fā)。頻率掃描使用1%的固定應(yīng)變，從0.1～100 rad/s來確定水凝膠的儲能模量(G′)和損耗模量(G″)。G′反映水凝膠的彈性(類固相)性質(zhì)，G″反映其黏性(類流體)性質(zhì)。損耗角正切值(Tanδ)為G″與G′之比(G″/G′)，Tanδ值小于1為類固體性質(zhì)，大于1為類流體性質(zhì)。流動掃描在剪切速率為0.1～100 s-1范圍內(nèi)測定水凝膠表觀黏度(η)的變化。

1.2.7 持水力測定

參照Yu等的方法[18]，將2 g樣品置于10 mL離心管內(nèi)，在10 000 r/min條件下離心10 min，過濾除去上清液，記錄離心前后樣品的質(zhì)量，并計算持水力(CWH)：

CWH=(M2-M1)/(M3-M1)×100%。

(1)

式中：CWH代表持水力;M1代表空離心管的質(zhì)量(g)；M2代表樣品離心后的總質(zhì)量(g)；M3代表樣品離心前的總質(zhì)量(g)。

1.2.8 硬度測定

在50 mL燒杯中制備WPI凝膠，然后使用配有P/0.5R圓柱形測試探頭的物性測定儀測定硬度。采用的測量參數(shù)為：預(yù)試速度1.0 mm/s，測試速度1.0 mm/s，觸發(fā)力3 g，測試后速度1.0 mm/s，穿刺距離10.0 mm，測量溫度25 ℃。使用儀器提供的軟件計算凝膠硬度，每個樣品平行測定3次。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理

對每個樣本進行3次獨立的重復(fù)分析，結(jié)果表示為3個測定的平均值。所有圖都由Origin 8.6繪制，采用單因素方差分析(ANOVA)及Duncan多極差檢驗，比較兩組均值間的顯著性差異，P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 WPI凝膠的結(jié)構(gòu)表征

2.1.1 樣品外觀

單獨乙醇誘導(dǎo)組和乙醇-TG酶聯(lián)合處理組WPI的外觀如圖1所示。當(dāng)乙醇體積分數(shù)為0時，單獨乙醇誘導(dǎo)組和乙醇-TG酶聯(lián)合處理組樣品宏觀上均呈流動態(tài)；當(dāng)乙醇體積分數(shù)為30%時，單獨乙醇處理組的黏度增加，但并未形成倒置凝膠，而乙醇-TG酶聯(lián)合處理組形成固態(tài)凝膠，這是由于較低乙醇濃度對WPI的改性不充分，不能使其形成凝膠，而TG酶預(yù)處理提高了乙醇誘導(dǎo)樣品的膠凝性。中體積分數(shù)乙醇(40%、50%)單獨醇誘導(dǎo)組和乙醇-TG酶聯(lián)合處理組樣品都能夠形成凝膠，但二者的凝膠質(zhì)地存在顯著差異。單獨醇誘導(dǎo)組凝膠質(zhì)地黏軟，手指按壓變形后無反彈，呈乳白色，透明度低；乙醇-TG酶聯(lián)合處理組凝膠質(zhì)地較干、硬，手指按壓后有反彈恢復(fù)現(xiàn)象，透明度較高，可見該乙醇體積分數(shù)具備形成質(zhì)地良好凝膠的條件。隨著乙醇體積分數(shù)的繼續(xù)升高(60%)，乙醇對WPI的變性出現(xiàn)“可逆”效果，即此前暴露的疏水基團相互間重新形成疏水核心，導(dǎo)致WPI的溶解度提高[20]；宏觀上表現(xiàn)為連續(xù)相中不溶性聚合物的體積和數(shù)量減小，表觀黏度下降，流動性增強，凝膠倒置性消失。Tanford等認為此現(xiàn)象是由于β-乳球蛋白經(jīng)歷了特殊的“Tanford transition”，蛋白質(zhì)二聚體分解為2個單體，從而暴露出先前隱藏的羧基，宏觀上表現(xiàn)為體系的聚集度降低[21]。

圖1 乙醇單獨處理和乙醇-TG酶聯(lián)合處理WPI凝膠表觀圖Fig.1 Appearance of WPI gels induced by ethanol alone and ethanol-TG

2.1.2 WPI凝膠的掃描電子顯微鏡觀察

掃描電子顯微鏡可以用來觀察各種蛋白質(zhì)凝膠的微觀結(jié)構(gòu)。圖2為單獨乙醇處理組和乙醇-TG酶聯(lián)合處理組WPI凝膠的SEM微觀結(jié)構(gòu)。單獨乙醇處理WPI(圖2a～2e)出現(xiàn)了和Feng等相似的實驗結(jié)果[16]，即在無乙醇條件下，WPI呈現(xiàn)出破碎光滑的“玻璃片狀”結(jié)構(gòu)，其破碎形態(tài)可能是由凍干過程導(dǎo)致。隨著乙醇體積分數(shù)的升高(30%、40%)，WPI片狀結(jié)構(gòu)內(nèi)部出現(xiàn)裂橫，直到整體結(jié)構(gòu)全部裂解，這可能與乙醇使WPI結(jié)構(gòu)展開有關(guān)[22]。當(dāng)乙醇體積分數(shù)為50%時，部分分散的WPI分子依靠氫鍵和分子間相互作用重新連接，形成具有細小空隙的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使體系的流變特性得到顯著提高，這與其后續(xù)剪切模量的結(jié)果相吻合。當(dāng)使用體積分數(shù)為60%的乙醇單獨誘導(dǎo)WPI時，出現(xiàn)了此前已說明的變性可逆現(xiàn)象，WPI表面變得粗糙，此前的細小空隙閉合并相互擠壓，形成塊狀和顆粒結(jié)構(gòu)。與單獨乙醇處理組相比，乙醇-TG酶聯(lián)合處理組WPI(圖2f～2j)則出現(xiàn)了明顯的橋接結(jié)構(gòu)，這是由于TG酶的共價交聯(lián)作用在WPI分子間形成了新的酰胺鍵。當(dāng)乙醇體積分數(shù)為40%時，聯(lián)合處理WPI出現(xiàn)了所謂的“蜂巢狀”結(jié)構(gòu)[23]。隨著乙醇體積分數(shù)的提高，聯(lián)合處理組也出現(xiàn)了和單獨乙醇處理組相似的現(xiàn)象，即凝膠表面變粗糙，結(jié)構(gòu)出現(xiàn)破裂與重組，并在乙醇60%體積分數(shù)下形成表面顆粒物，但TG酶在一定程度上抑制了該現(xiàn)象，使WPI凝膠在高濃度乙醇溶劑中仍具有保持一定三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的能力。

圖2 不同乙醇體積分數(shù)下單獨乙醇處理和乙醇-TG酶聯(lián)合處理WPI凝膠的SEM圖像Fig.2 SEM images of WPI gels treated with ethanol alone and ethanol-TG under different ethanol concentrations注：E-WPI代表乙醇單獨處理WPI，E-T-WPI代表乙醇-TG酶聯(lián)合處理WPI。

2.1.3 WPI凝膠的生物激光共聚焦顯微鏡觀察

使用生物激光共聚焦顯微鏡可以進一步表征凝膠的微觀結(jié)構(gòu)，單獨乙醇誘導(dǎo)組和乙醇-TG酶聯(lián)合處理組WPI的CLSM圖像如圖3所示。經(jīng)染色后的WPI在圖像中顯示為紅色，而凝膠孔隙顯示為黑色陰影，故可通過二者的形態(tài)位置來觀察WPI凝膠的內(nèi)部結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)的分布狀態(tài)。圖3a～3e反映了乙醇單獨誘導(dǎo)WPI凝膠的內(nèi)部結(jié)構(gòu)隨乙醇體積分數(shù)變化而發(fā)生的改變。在低體積分數(shù)乙醇(10%、30%)誘導(dǎo)下，WPI發(fā)生的變性不足以形成凝膠，含有較少的孔隙，分布均勻(圖3a、3b)。隨著乙醇體積分數(shù)升高至40%，乙醇對WPI的變性作用增強，WPI開始發(fā)生大面積聚集，整體分布逐漸不均勻，并出現(xiàn)了邊界模糊且不規(guī)則的大空腔結(jié)構(gòu)(圖3c);這可能是由于乙醇使WPI內(nèi)部的疏水基團暴露，增強了分子間的疏水相互作用，使分子開始致密堆積。當(dāng)乙醇體積分數(shù)達到50%時，WPI凝膠空腔邊界逐漸清晰，結(jié)構(gòu)不斷向內(nèi)擠壓，分隔出獨立的不規(guī)則空腔(圖3d)，這與Kleemann等報道的結(jié)果相似[14]。當(dāng)乙醇過度改性WPI時(體積分數(shù)60%)，可見此前凝膠的不規(guī)則孔狀結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榇罅康募毿∏驙羁紫?圖3e)；這與SEM結(jié)果中的對應(yīng)現(xiàn)象一致，WPI分子在過量乙醇作用下開始在凝膠表面不斷結(jié)合，填合孔隙。

與單獨乙醇處理組WPI凝膠相比，乙醇-TG酶聯(lián)合處理組WPI在30%乙醇體積分數(shù)下即形成了凝膠結(jié)構(gòu)(圖3g)，這與Ercili-Cura等發(fā)現(xiàn)TG處理過的凝膠更早硬化的結(jié)果相一致[24]；其連接結(jié)構(gòu)也與單獨乙醇處理時有所不同，具有可見的“枝條狀”結(jié)構(gòu)，這可能歸因于TG酶的共價橋接作用，即形成分子內(nèi)或分子間異肽鍵而發(fā)生的共價交聯(lián)[25]。在體積分數(shù)為40%的乙醇作用下，WPI凝膠形成了邊界清晰的大孔隙(圖3h)，這與SEM所拍攝的(圖2h)“蜂巢狀”結(jié)構(gòu)相類似。隨著乙醇體積分數(shù)升高至50%，WPI凝膠孔隙也出現(xiàn)了壓縮現(xiàn)象(圖3i)，這可能與大孔隙對應(yīng)較小的基數(shù)而小孔隙對應(yīng)較大的基數(shù)有關(guān)，即空腔總體積未發(fā)生明顯變化。當(dāng)乙醇體積分數(shù)達到60%時，體系此前的堅固孔隙轉(zhuǎn)變?yōu)榧毿〉那驙?圖3j)，與對照組相比，表現(xiàn)為孔隙數(shù)量的增加。綜上所述，TG酶的添加使得中、低乙醇濃度下的WPI凝膠結(jié)構(gòu)增強，而對高濃度乙醇誘導(dǎo)WPI膠凝的促進作用并不顯著，這可能與高濃度乙醇對TG酶的抑制作用有關(guān)[26]。

2.1.4 WPI凝膠的傅里葉變換紅外光譜分析

傅里葉變換紅外光譜測量經(jīng)常用于表征高分子聚合物之間的相互作用[27]。為了進一步研究乙醇-TG酶聯(lián)合改性WPI的膠凝機制，對樣品中的WPI進行了FT-IR分析。圖4a為單獨乙醇處理和乙醇-TG酶聯(lián)合處理WPI凝膠的FT-IR譜圖。與無乙醇處理相比，乙醇誘導(dǎo)WPI的紅外光譜并未產(chǎn)生新峰，證實乙醇不會使WPI分子中產(chǎn)生新鍵[28]。波數(shù)為3 440 cm-1和3 193 cm-1的2個峰分別由N—H和O—H的伸縮振動引起，表明凝膠結(jié)構(gòu)中存在分子間和分子內(nèi)氫鍵[7]。單獨乙醇處理組在波數(shù)3 244 cm-1左右出現(xiàn)單峰，而乙醇-TG酶聯(lián)合處理組出現(xiàn)了寬峰現(xiàn)象(3 325～3 254 cm-1)，表明聯(lián)合處理組WPI在O—H伸縮振動的基礎(chǔ)上出現(xiàn)了新的N—H伸縮振動，這可能是因為在TG酶的作用下，谷氨酰胺和賴氨酸殘基形成共價交聯(lián)產(chǎn)生酰胺鍵，隨之產(chǎn)生了很強的分子間相互作用。在2 900～2 800 cm-1出現(xiàn)的峰歸屬于C—H鍵伸縮振動，其出現(xiàn)在凝膠后期，反映了該時期WPI凝膠的氧化和被破壞過程[29]。

圖4 傅里葉變換紅外光譜Fig.4 Fourier transform infrared spectrum注：E-WPI代表乙醇單獨處理WPI，E-T-WPI代表乙醇-TG酶聯(lián)合處理WPI。網(wǎng)絡(luò)版為彩圖。

2.1.5 WPI凝膠的差示掃描量熱分析

差式掃描量熱分析可通過熱轉(zhuǎn)變溫度(Td)和焓變值(ΔH)的變化來分析蛋白質(zhì)的變性過程。本實驗利用DSC研究了乙醇和TG酶對WPI凝膠熱性能的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同乙醇體積分數(shù)下單獨乙醇處理和乙醇-TG酶聯(lián)合處理WPI凝膠的熱流曲線Fig.5 Heat flow curves of WPI gels treated with ethanol alone and ethanol-TG under different ethanol concentrations注：E-WPI代表乙醇單獨處理WPI，E-T-WPI代表乙醇-TG酶聯(lián)合處理WPI。

所有樣品的熱轉(zhuǎn)變溫度都在70～120 ℃之間，這可能歸因于凝膠中結(jié)合水的蒸發(fā)[19]。單獨乙醇處理組WPI凝膠的熱轉(zhuǎn)變溫度隨著乙醇濃度的增加呈現(xiàn)遞減現(xiàn)象，這與此前報道的乙醇降低WPI熱變性溫度的結(jié)果一致[33]。與熱轉(zhuǎn)變溫度對應(yīng)的是上述體系焓變值隨著乙醇濃度的增加不斷減小，這可能是由于乙醇顯著改變了WPI分子中非共價鍵(氫鍵、疏水相互作用、分子間作用力、靜電斥力等)的力學(xué)平衡，促使WPI預(yù)變性，削弱了WPI的熱敏效果[34]。在體積分數(shù)為60%的乙醇作用下，WPI凝膠體系并未出現(xiàn)明顯的熱吸收峰，可知乙醇幾乎使WPI完全變性，蛋白質(zhì)的高級有序結(jié)構(gòu)被松散為無序結(jié)構(gòu)，在升溫中并未出現(xiàn)顯著熱變化。對比單獨乙醇處理組和乙醇-TG酶聯(lián)合處理組WPI凝膠的熱流曲線可知，在TG酶的交聯(lián)作用下，WPI凝膠的熱變性溫度顯著提高，這可能是因為TG酶在WPI中形成了谷氨酰胺和賴氨酸殘基的共價交聯(lián)，提高了WPI分子間的凝聚力及有序水平(降低了焓變值)，進而增加了凝膠的熱穩(wěn)定性。

2.2 WPI凝膠的流變特性

應(yīng)用動態(tài)振蕩測量探究乙醇-TG酶聯(lián)合處理對WPI凝膠流變特性的影響(圖6)。單獨乙醇處理組WPI的剪切模量如圖6a所示，在低體積分數(shù)乙醇(0、30%)作用下，呈流動態(tài)的改性WPI在儲能模量上并無顯著差異;而在體積分數(shù)為40%的乙醇誘導(dǎo)下，WPI儲能模量高于損耗模量，形成了固態(tài)凝膠，這表明乙醇誘導(dǎo)WPI形成凝膠的濃度存在閾值[13]。隨著乙醇體積分數(shù)繼續(xù)升高，WPI在50%時出現(xiàn)最大儲能模量，此后便呈下降趨勢。這是由于在體積分數(shù)50%時，乙醇對WPI疏水相互作用的破壞和氫鍵的轉(zhuǎn)化與其他次級鍵間達到最優(yōu)平衡，有利于凝膠的形成[35]；當(dāng)乙醇體積分數(shù)繼續(xù)升高時，其綜合作用力不利于空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成，故儲能模量下降。乙醇-TG酶聯(lián)合處理組WPI的剪切模量如圖6b所示，與單獨乙醇處理組相比，TG酶的酶促預(yù)處理使得中濃度乙醇誘導(dǎo)的WPI凝膠儲能模量得到較大提高。顯然，TG酶的交聯(lián)作用有利于提高凝膠的聚集度，從而提高儲能模量[19]。

WPI凝膠的表觀黏度如圖6c所示?？梢钥闯?，樣品的表觀黏度對剪切速率具有依賴性。這是因為剪切速率的增加會導(dǎo)致液滴絮凝物或蛋白質(zhì)聚集體逐漸變形和被破壞，從而降低流動阻力并降低黏度[22]。呈流動態(tài)的樣品(乙醇體積分數(shù)為0、30%時)具有極低的黏度，隨著乙醇濃度的提高，樣品黏度得到一定提高。乙醇-TG酶聯(lián)合處理組WPI凝膠的表觀黏度優(yōu)于單獨乙醇處理組，并在乙醇體積分數(shù)為40%時出現(xiàn)最大值。這是由于在形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，TG酶的進一步作用形成了WPI分子間的酰胺鍵，提高了結(jié)構(gòu)的緊密度，從而使聯(lián)合處理組凝膠表現(xiàn)出比單獨乙醇處理組更高的黏度。

圖6 單獨乙醇處理(a)和乙醇-TG酶聯(lián)合處理(b)WPI凝膠的剪切模量及表觀黏度(c)Fig.6 Searing modulus of WPI gels induced by ethanol alone (a) and ethanol-TG (b) and apparent viscosity of the WPI gels(c)注：E-WPI代表乙醇單獨處理WPI，E-T-WPI代表乙醇-TG酶聯(lián)合處理WPI。網(wǎng)絡(luò)版為彩圖。

2.3 WPI凝膠的功能特性

2.3.1 持水力

研究表明，凝膠強度越大，持水力越強。另外，隨著體系孔尺寸的減小，將水保持在凝膠中的毛細作用力會增加，導(dǎo)致蛋白質(zhì)基質(zhì)保留更多的水并提高持水力值[36]。

單獨乙醇誘導(dǎo)和乙醇-TG酶聯(lián)合處理WPI凝膠的持水力測定結(jié)果如圖7所示。由于在體積分數(shù)為0的乙醇作用下，WPI未形成凝膠，故該條件下樣品的持水力較低。當(dāng)乙醇體積分數(shù)達到50%時，單獨乙醇誘導(dǎo)組和聯(lián)合處理組的WPI凝膠分別出現(xiàn)了最強持水力，且乙醇-TG酶聯(lián)合處理組的持水力強于乙醇誘導(dǎo)組，表明TG酶對乙醇誘導(dǎo)WPI凝膠的持水力具有增強作用，這可能是由于TG酶使WPI分子間形成了酰胺鍵，提高了WPI分子間的交聯(lián)度，體系形成了三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可固定部分醇水混合物[37]。在體積分數(shù)60%的乙醇作用下，單獨乙醇誘導(dǎo)組和聯(lián)合處理組的WPI凝膠持水力均顯著下降，這與乙醇對WPI的過度改性有關(guān)，體系中此前暴露的疏水基團相互間重新形成疏水核心，使不溶性聚合物的體積和數(shù)量減小。綜上所述，在乙醇體積分數(shù)低于50%的條件下，乙醇-TG酶聯(lián)合處理組WPI凝膠的持水力顯著高于單獨乙醇誘導(dǎo)組。

圖7 單獨乙醇誘導(dǎo)和乙醇-TG酶聯(lián)合處理WPI凝膠的持水力Fig.7 Water holding capacities of WPI gels induced by ethanol alone and ethanol-TG

2.3.2 硬度

硬度主要反映蛋白質(zhì)凝膠的質(zhì)地特性，與食品的感官有關(guān)[38]。通過質(zhì)地多面剖析(TPA)來測定各組樣品的硬度，結(jié)果如圖8所示。體積分數(shù)為0的乙醇處理組未形成凝膠，故未給出其硬度數(shù)據(jù)，其他乙醇處理組和乙醇-TG酶聯(lián)合處理組WPI凝膠的硬度均呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。這是由此前說明的“Tanford transition”所造成的，即高濃度乙醇會使蛋白質(zhì)二聚體解體，凝膠連結(jié)處結(jié)構(gòu)松散，硬度下降。乙醇-TG酶聯(lián)合處理組WPI凝膠的硬度顯著高于單獨乙醇處理組；在乙醇體積分數(shù)為40%時，聯(lián)合處理組WPI凝膠的硬度最大，表明此體積分數(shù)下乙醇和TG酶對WPI的綜合作用達到平衡，凝膠性能達到最佳。

圖8 單獨乙醇處理和乙醇-TG酶聯(lián)合處理WPI凝膠的硬度Fig.8 Hardness of WPI gels induced by ethanol alone and ethanol-TG

2.4 WPI凝膠的形成機理

本研究選用TG酶交聯(lián)和乙醇誘導(dǎo)促使WPI變性形成冷誘導(dǎo)凝膠，通過對以上結(jié)果的分析與討論，推測形成冷誘導(dǎo)凝膠可能存在的機理如下：

首先，在合適的TG酶活性(120 U/g)與WPI濃度(120 g/L)下，WPI的分子間相互作用增強，達到了臨界成膠濃度，能夠形成穩(wěn)定的WPI凝膠。其次，在適宜的TG酶活性下，WPI中的賴氨酸和谷氨酰胺形成賴氨酸異肽鍵，WPI的凝聚度和穩(wěn)定性得到提高[39]。最后，一定濃度乙醇的誘導(dǎo)使WPI進一步變性，WPI分子內(nèi)/間的氫鍵、疏水相互作用、分子間作用力、靜電斥力等各項作用力被重新改變，達到形成凝膠的平衡條件，即在常溫下形成結(jié)構(gòu)完整的WPI冷誘導(dǎo)凝膠。結(jié)合實驗結(jié)果可知，乙醇可以使WPI的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，一定濃度的乙醇能夠通過增加α-螺旋的數(shù)量，增強WPI的凝聚度[20]。此外，在對樣品酰胺Ⅰ帶光譜進行分析時，發(fā)現(xiàn)WPI二級結(jié)構(gòu)中β-折疊的數(shù)量增加，使得分子間致密堆積，在宏觀上形成高緊實度的凝膠。

如圖9所示，不同體積分數(shù)(低、中、高)乙醇對WPI的改性程度不同，微觀結(jié)構(gòu)也呈現(xiàn)出不同形態(tài)。WPI在中體積分數(shù)乙醇誘導(dǎo)下從分散的球狀結(jié)構(gòu)逐漸聚集并暴露出內(nèi)部疏水基團，形成穩(wěn)定的凝膠孔隙，而在高體積分數(shù)乙醇誘導(dǎo)下的疏水相互作用反而下降，凝膠表面結(jié)構(gòu)被破壞，變得粗糙。在TG酶的催化作用下，雖然一部分WPI能夠形成新的酰胺鍵，但宏觀上并不能形成凝膠，需要乙醇進一步誘導(dǎo)使其形成冷誘導(dǎo)凝膠。在聯(lián)合處理組WPI凝膠中，中體積分數(shù)乙醇使WPI形成了穩(wěn)定的“蜂巢狀”結(jié)構(gòu)，而TG酶共價交聯(lián)WPI加固了凝膠孔隙，進一步形成了流變特性與功能特性較優(yōu)的蛋白質(zhì)凝膠。

圖9 凝膠形成機理推測Fig.9 The presumed formation mechanism of gels注：網(wǎng)絡(luò)版為彩圖。

3 結(jié)語

本研究在使用TG酶交聯(lián)和不同濃度乙醇誘導(dǎo)WPI形成穩(wěn)定水凝膠的基礎(chǔ)上，對其微觀結(jié)構(gòu)進行表征，對其流變特性與功能特性進行評價，探究WPI凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成機理，篩選出最適乙醇濃度，獲得了流變與功能特性最佳的WPI凝膠。通過實驗得到以下結(jié)論：在120 U/g TG酶與120 g/L WPI的條件下，體積分數(shù)為40%的乙醇誘導(dǎo)能形成流變與功能特性最優(yōu)的WPI凝膠；乙醇能提高WPI二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋的比例，增強體系的氫鍵和疏水作用，形成維持WPI凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；TG酶在該凝膠形成工藝中具有交聯(lián)作用，可以提高WPI二級結(jié)構(gòu)中β-折疊的比例，促進乙醇誘導(dǎo)WPI凝膠的形成。從整體來看，TG酶與乙醇聯(lián)合處理凝膠的性能優(yōu)于單獨乙醇誘導(dǎo)凝膠，其形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加致密，質(zhì)地更加均勻，凝膠強度更大。相對于傳統(tǒng)的熱誘導(dǎo)凝膠，該冷凝膠制備工藝能耗較低，能夠提質(zhì)增效；同時，本研究構(gòu)建的具有較高乙醇濃度的蛋白凝膠，對于開發(fā)富含醇溶性活性成分(如姜黃素、類胡蘿卜素等)的功能食品具有重要參考價值。