尹會敏，劉 培，于 苗，周沫蘢，栗 慧，魏玉文，魏 東

(1 河北北方學院河北省農產品食品質量安全分析檢測重點實驗室，河北 張家口 075000；2 河北北方學院農林科技學院，河北 張家口 075000；3 張家口市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河北 張家口 075000)

仿生抗體，也稱分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymer，MIPs)，是一種利用MIT制備的含抗體或酶專一性的識別材料。由于其實用性強，穩(wěn)定性好，結構預定，制備簡單，能特異性識別靶物質，對極端環(huán)境具有很強的耐受能力，常常代替?zhèn)鹘y(tǒng)的生物抗體用于復雜基質中目標化合物的定性和定量分析[1]。隨著對MIT的不斷研究，仿生抗體已廣泛應用于色譜(chromatograph)、固相萃取、模擬酶和仿生傳感器等各個領域。同時，也在食品、環(huán)境和生物樣品的分離、純化和富集分析中展示出廣闊的應用前景。本文就仿生抗體的制備及應用進行了介紹，并對仿生抗體目前存在的問題和發(fā)展前景進行了分析。

1 仿生抗體的制備

1.1 分子印跡技術(MIT)

MIT是由20世紀中期發(fā)展起來的一種具有特定選擇性和親和性的新型聚合技術。它的思想起源于免疫學抗體形成學說中“一把鑰匙一把鎖”的概念[2-3]，是指以某一特定的目標分子為模板，通過交聯(lián)聚合反應制備具有特異識別位點的聚合物的過程?！胺肿佑≯E”的概念是1949年由Dickey[4]提出的，被稱為“分子印跡的萌芽”，但在以后的發(fā)展過程中并沒有引起太多的關注。1972年，Wulff等[5]成功制備出共價型MIPs，為MIT的發(fā)展創(chuàng)造了新思路。1993年，瑞典科學家Mosbach等[6]在《Nature》上發(fā)表了運用自組裝法制備茶堿MIPs的報道，使得MIPs的制備工藝簡單、制備效果顯著，MIT隨即便成為學術界的研究熱點。如今，MIT在生物傳感器、食品分析、臨床醫(yī)學等各個領域得到了快速發(fā)展。全球至少數十個國家、上百個團隊和學術科研機構在從事MIT的研究和開發(fā)工作。分子印跡示意圖如圖1所示。

圖1 分子印跡示意圖[7]Fig.1 Schematic diagram of mdecular imprinting

1.2 仿生抗體的基本原理

MIPs的基本原理是將目標物質(模板分子)與功能單體按一定比例將加入到合適的溶劑中相互作用，形成多個操作點，再加入適當的交聯(lián)劑和引發(fā)劑，使其發(fā)生交聯(lián)聚合反應，形成初始配合物。運用物理或化學手段去除模板分子，配合物形成一個特定的空間結構，再次加入目標分子，該配合物僅對目標分子表現(xiàn)出特異識別性[8]。

MIPs的合成步驟一般分為三步：(1)形成模板-單體復合物。將模板分子與功能單體按一定比例加入到合適的溶劑中自組裝反應形成模板-單體復合物；(2)引發(fā)聚合反應。緩慢加入適當比例的交聯(lián)劑和引發(fā)劑，與(1)中的復合物交聯(lián)聚合，形成聚合物；(3)去除模板分子。運用物理或化學手段去除聚合物中的模板分子，使得聚合物形成一個和模板分子形態(tài)大小相同的空間結構，再次加入模板分子，該聚合物表現(xiàn)出識別專一性。

圖2 仿生抗體的制備原理及過程[9]Fig.2 Scheme and processes for preparing molecular imprinting polymer

1.3 仿生抗體的制備方法

合成聚合物的分子印跡是在分子水平上創(chuàng)建模板的過程。與生物抗體相比，MIPs的生產通常具有良好的可重復性、快速、經濟、不涉及動物。同樣，MIPs的物理和化學穩(wěn)定性使其能夠使用各種溶劑而不會破壞識別部位。近年來，隨著對MIT的深入研究，MIPs的制備方法也不斷涌現(xiàn)。目前為止，MIPs的制備方法主要有以下幾種。

1.3.1 本體聚合法

本體聚合法(Bulk Polymerization)是一種將模板分子、功能單體和交聯(lián)劑等按一定比例加入到合適的溶劑中交聯(lián)聚合制備塊狀MIPs的方法。得到的聚合物需經干燥、研磨、粉碎、篩分，得到所需粒徑大小的粒子。這是目前制備MIPs研究中最常見的方法。該方法實驗條件易于滿足，操作簡便，制備的MIPs具有良好的篩選和鑒定能力，受到研究者們的廣泛歡迎[10]。Engy等[11]運用該方法和懸浮聚合法制備MIPs，對菊苣中的菊苣酸進行分離純化。相比之下，采用本體聚合法制備的MIPs擁有更好的吸附效果。該方法沿用至今，制備簡單，但研究人員發(fā)現(xiàn)該方法在研磨過程中容易破壞MIPs上的結合位點，導致MIPs的最終產率降低，限制了其在分析檢測中的應用。

1.3.2 原位聚合法

原位聚合法(In situ Polymerization)是直接將預聚合溶液加到色譜柱或兩個基板之間交聯(lián)聚合，制備MIPs的方法。1993年，Matsul等[12]以D-苯丙氨酸和L-苯丙氨酸為目標分析物，采用原位聚合法制備了分子印跡整體柱。這是關于運用原位聚合法制備MIPs的首次報道。Du等[13]在SPME的細管處制備了可以特異性識別苯醚甲環(huán)唑的分子印跡整體柱，對自來水和葡萄汁中的苯醚甲環(huán)唑進行提取，檢出限為0.5μg/L，回收率為87.6%～95.4%。

與本體聚合法相比，該方法無需研磨、篩分等復雜的過程，具有操作簡便，實用性強，分離效果好等優(yōu)點。此外，該方法制備的MIPs可以替代生物分子作為傳感器的識別元件，對目標物質進行特異性檢測。

1.3.3 表面印跡法

表面印跡法(Surface Molecular Imprinting)是一種以固體(SiO2、Al2O3、Fe3O4等)為載體，在其表面直接聚合反應，使其表面產生特定的可識別印跡位點的方法。運用該方法制備的MIPs，印跡位點將暴露在聚合物表面，加快了模板分子與印跡位點的結合速率。Wang等[14]以環(huán)丙沙星為模板分子，F(xiàn)e3O4為磁性材料，在羧化纖維素納米晶體表面直接聚合制備MIPs。經鑒定，該MIPs的選擇性吸附容量為50 mg/g，具有適宜的飽和磁化強度，可同時應用于多種FQs的選擇性鑒定。該方法克服了傳統(tǒng)的MIPs制備方法存在的印跡位點嵌入過深、印跡分子難以洗脫等缺點，提高了聚合物的吸附容量和吸附效率[15]。但是，該方法可能會導致印跡過程中MIPs對載體的包裹不完全，導致漏磁。因此，選擇合適的載體是十分必要的。

1.3.4 懸浮聚合法

懸浮聚合法(Suspension Polymerization)是添加溶有引發(fā)劑的功能單體到水或其他溶劑中，在高速攪拌下進行自由基聚合，制備得到微球型MIPs的方法。該方法操作簡單、制備時間短、所獲得的MIPs微球形態(tài)規(guī)則、微球粒徑均勻(約10～100 μm)，是用于高效液相色譜法和SPE包裝的理想材料[16]。

Walsh等[17]將組胺類藥物作為目標分析物，采用懸浮聚合法制備了粒徑均一的MIPs，將撲爾敏和d-撲爾敏，溴非尼臘明和d-溴非尼臘明成功分離。Lian等[18]將茶氨酸作為目標分析物，采用懸浮聚合法通過控制攪拌速度制備了粒徑均勻的微球型MIPs。并將MIPs與HPLC-MS聯(lián)用，成功地消除了基質干擾，對巖藻毒素表現(xiàn)出良好的選擇性。然而，該方法中水的極性過強會降低目標分析物與功能單體之間的非共價鍵作用，影響聚合物結構的形成，從而降低印跡效應和MIPs的最大吸附容量。

1.3.5 沉淀聚合法

沉淀聚合法(Precipitation Polymerization)的制備過程與傳統(tǒng)的制備方法類似，是將模板分子和功能單體按一定比例加入到合適的有機溶劑中混勻，在物理條件下，制備得到一個更小粒度的微球形聚合物，微球粒徑在0.2～2 μm之間。1994年，Uezu等[19]報道了水-油-水乳液體系中微球的制備，這也是關于沉淀聚合法的首次報道。近年來，為了使其得到更廣泛的應用，許多研究將沉淀聚合與其他方法相結合來控制反應速率，以增加聚合物的粒徑。然而，為了獲得顆粒均勻的聚合物，實驗條件往往比較嚴格，所以在選擇該方法時，需要考察不同因素的影響[20]。

2 仿生抗體的應用

近年來，仿生抗體憑借自身較強的識別能力、良好的穩(wěn)定性以及高選擇性等優(yōu)點，在SPE、傳感器、膜分離、免疫分析等多個領域展現(xiàn)出了良好的應用前景。

2.1 分子印跡固相萃取

分子印跡固相萃取(Molecularly imprinted polymer SPE，MSPE)是以MIPs為固相萃取劑進行固相萃取的一門新技術。MSPE融合了MIT和SPE的優(yōu)點，具有選擇性高、穩(wěn)定性好、可重復利用等特點，為樣品的采集和分析提供了極大的方便。1994年，Sellergern領導的研究小組[21]以噴他脒(一種AIDS病毒的抑制藥物)為模板分子，甲基丙烯酸為功能單體制備了噴他脒MIPs，將其作為MSPE吸附材料，成功分離和富集了尿中痕量的噴他脒。結果表明，該方法優(yōu)于傳統(tǒng)的固相萃取法。這也是關于MIPs應用于固相萃取的首次報道。何慧清等[22]采用沉淀聚合法制備了白藜蘆醇MIPs。將聚合物與固相萃取技術結合，研究了聚合物的最佳吸附條件。結果表明，制備的微球的印跡因子為1.62。同時從花生根和莖中分離純化白藜蘆醇，結果表明，白藜蘆醇的純度為92.5%，回收率為76.2%，吸附效果顯著。目前，MIPs作為固相萃取材料已成為MIPs最重要的應用方向，充分顯示了MIPs和MIT在實際應用中的優(yōu)越性。

2.2 分子印跡傳感器

在生物傳感技術中，一種生物受體(抗體、抗原、酶、細胞等)表面的固定化轉換器與分析物的相互作用導致系統(tǒng)的物理和化學參數的變化，從而產生進一步放大和記錄的信號，利用設備進行記錄和處理數據[23]。分子印跡傳感器的工作原理與生物傳感器是相似的，但不是使用生物分子，而是將傳感器技術與含有分子識別位點的聚合物結合，極大地提高了傳感器的選擇性和靈敏度，縮短了響應時間。此外，由于其設計簡單、經濟適用等優(yōu)點引起科學家們的廣泛關注。1991年，Mosbach等首次將MIT與傳感器技術相結合，將MIPs作為識別元件制備了分子印跡傳感器并申請了專利。Li等[24]以磺胺胍為模板分子合成磺胺胍MIPs，又結合分散的SiO2微球制備了光子晶體傳感器用于并魚肉中磺胺胍的檢測。檢測限為2.8×10-7mmol/L，反應時間僅為5 min，與磺胺類化合物相比，該傳感器對磺胺胍具有更高的特異性。這一發(fā)現(xiàn)表明，分子印跡傳感器也可以用于檢測具有復雜基質的食物樣品。

MIPs的出現(xiàn)成功地填補了傳統(tǒng)生物傳感器生物識別元件穩(wěn)定性差、成本高、對環(huán)境使用要求高的缺陷，這也使分子印跡傳感器取代傳統(tǒng)生物傳感器成為必然的趨勢。相信隨著MIT技術的更新發(fā)明與創(chuàng)造，分子印跡傳感器的檢測領域會拓展到更多的領域。

2.3 分子印跡膜

分子印跡膜(molecularly imprinted membrane，MIM)是MIT結合膜分離技術制備出的一種新型分離膜，具有特異識別性和分離效率高等特點，被廣泛應用于各分離領域。Ke等[25]以醋酸纖維素為基膜，功能化環(huán)糊精為功能單體制備了復合MIM。由于環(huán)糊精與藥物分子包合作用的差異，可用于手性藥物分離。Wu等[26]以PVDF膜為基膜，多巴胺為功能單體制備復合MIM，提高了膜的親水性和布洛芬分離的選擇性。同時，銀納米粒子在MIM上的結合使膜具有抗菌性能，實現(xiàn)了MIM的多功能。Asliyuce等[27]以甲基丙烯酸羥乙酯為功能單體，低溫聚合制備了乙型肝炎表面抗體(antiHBs)的復合水凝膠MIM，并在膜色譜模式下進行了分離純化研究，取得了良好的分離效果。

2.4 分子印跡免疫吸附分析技術

分子印跡免疫吸附分析技術(molecularly imprinted sorbent immunoassays，MIAs)是利用分子印跡仿生抗體的特異性識別能力建立的親和分析方法，已成為近年來的研究熱點之一。其基本原理是基于抗原抗體的競爭反應。反應體系中的目標物和探針競相與MIPs中特定的結合位點結合。探針與MIPs的結合率隨目標物的增加而降低，通過檢測探針與MIPs結合物質的含量，來計算目標物的含量[28]。分子印跡免疫吸附分析技術因標記物種類的不同可分為放射標記MIAs，熒光標記MIAs和酶標記MIAs。

2.4.1 放射標記MIAs

放射標記MIAs是基于放射化學標記分子(如3H,14C或125I)的使用。放射性同位素標記在分析發(fā)展的早期階段是最常見的。它們的主要優(yōu)點是，標記分析物的化學結構與印跡模板相同，可以保持與空腔競爭結合的高選擇性。Vlatakis等[29]在1993年報道了第一個異質射電分子印跡試驗。在本研究中，以MAA為功能單體，EGDMA為交聯(lián)劑合成的MIPs成功地用于競爭分析法測定人血漿樣品中的茶堿或地西泮藥物。本文報道了基于抗嗎啡和抗腦素的MIPs的制備及其在放射免疫分析中的應用。該結果與基于抗體的檢測系統(tǒng)的結果相當，并證實了MIPs作為抗體模擬物用于MIPs免疫檢測的可行性。放射標記MIAs也被用于開發(fā)檢測其他化合物的分析系統(tǒng)，如藥物、除草劑、糖皮質激素等[30]。需要注意的是，該方法的應用總是與輻射安全和廢物處理問題有關。因此，我們可以得出結論，盡管使用與目標物質分子結構相同的放射標記分析物具有無可辯駁的優(yōu)勢，但2000年后基于放射化學示蹤劑的分子印跡吸附劑分析研究大大減少。這種下降的原因可能是許多分析物同位素標記示蹤劑的市場供應不足，以及使用放射性核素的滯留。

2.4.2 熒光標記MIAs

熒光標記MIAs是以熒光物質作為標記物標記目標物質或其他相關物質的一種免疫分析法。近年來，許多用于抗生素檢測的熒光MIPs免疫分析法被報道。Zhang等[31]描述了一種基于熒光MIPs的檢測大環(huán)內酯類抗生素紅霉素(ERY)的方法。以3-amino-propyl triethoxysilane為功能單體，tetraethoxysilane為交聯(lián)劑，通過簡單的溶膠-凝膠表面印跡法合成分子印跡熒光探針。印跡因子為4.0。在ERY濃度0.1～11.9 μM范圍內，396/585nm激發(fā)/發(fā)射波長處測得的熒光呈線性下降，檢出限為12nM。該方法已成功地用于人尿和唾液中痕量砷的測定。Geng等[32]以MAA和硫醇改性適配體為功能單體，CdSe量子點(QDs)為載體，制備了一種熒光MIPs，用于氨基糖苷類抗生素卡那霉素(KAN)的特異性測定。這種結構使得印跡空腔和適配體能夠對抗生素進行雙重識別，適配體與MAA之間存在協(xié)同作用，提高了MIPs對KAN的識別能力。結果表明，該方法選擇性高，印跡系數可達3.51。KAN的檢出限為13 ng/mL。

與放射標記MIAs相比，該技術無輻射傷害，對環(huán)境無污染，但在陽光照射下極易發(fā)生分解，使檢測結果受到影響。到目前為止，一直局限于實驗室研究。

2.4.3 酶標記MIAs

酶標記MIAs是以酶作為標記物，通過觀察底物被酶分解后的顯色反應或發(fā)光強度來檢測目標物質含量的一種技術。該技術由于沒有放射性標記的典型缺陷，許多酶以低成本和高純度的商業(yè)可用性，以及易于與低分子量和高分子量抗原結合而受到歡迎。

報道的第一個酶標記分子印跡吸附測定法是Surugiu等[33]對2,4-D除草劑的異相測定法。用煙草過氧化物酶直接標記2,4-D，通過沉淀聚合得到微球形式的印跡聚合物。經分析表明，該聚合物對于模板分子的一些類似物有很好的選擇性。比色模式下動態(tài)檢測范圍為40～600 μg/mL，化學發(fā)光模式下動態(tài)檢測范圍為1～200 μg/mL。Piletsky等[34]建議發(fā)展酶標記腎上腺素的印跡微孔板檢測方法。酶示蹤劑是HRP和去甲腎上腺素(目標分析物的類似物)的結合。校準曲線的動態(tài)范圍從1～100 μM。同樣的方法也被用于制備與辣根過氧化物酶、乳過氧化物酶、微過氧化物酶和血紅蛋白結合的蛋白印跡微滴定板。

酶標記MIAs仍處于初始階段。相對于生物抗體，MIPs作為仿生抗體應用于酶聯(lián)免疫吸附分析(Enzyme-linked immunoassay，ELISA)中仍然具有較低的選擇性和吸附能力，但穩(wěn)定性和經濟性較好。隨著MIT和ELISA的發(fā)展，該方法將成為分子印跡應用領域的熱點。

3 結 語

近年來，在仿生抗體的合成和應用方面取得了重要進展。仿生抗體的低成本、優(yōu)異的穩(wěn)定性和不斷提高的性能使其成為不同科學領域最有前途的分子識別合成材料。但這并不意味著仿生抗體的研究已達到非常深入的程度，因為我國開始從事分子印跡研究歷史尚短，仿生抗體在實際應用中仍有一些不足，尚難以完全代替生物抗體應用于各種檢測中。首先，在印跡過程中，目標分析物與聚合物之間主要靠非共價鍵作用，作用力較弱，降低了聚合物的印跡能力和印跡效果；其次，我們對仿生抗體在印跡和識別過程中的作用機理研究還不夠深入；此外，將仿生抗體的合成和應用在水相中完成，使之完全能與天然分子識別系統(tǒng)相比擬，仍然是目前一個重要的研究方向。