許鵬宇，李冬秀△，程立立，張 敏

1.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院，河北石家莊050051；2.白求恩國際和平醫(yī)院，河北石家莊050051

卵母細(xì)胞的發(fā)育和成熟是一個復(fù)雜的過程，促卵泡生成素(FSH)、促黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)、睪酮(T)、孕激素(P)、褪黑素等與卵母細(xì)胞的生長發(fā)育密切相關(guān)，為卵母細(xì)胞核及胞漿的同步成熟提供內(nèi)環(huán)境的卵泡液至關(guān)重要，因此卵泡液及其對卵母細(xì)胞的發(fā)育成為輔助生殖領(lǐng)域的研究熱點[1-2]。在體外受精胚胎移植過程中胚胎實驗室會獲得不同成熟度的卵母細(xì)胞，尤其在多囊卵巢綜合征患者中，未成熟卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)受到越來越多胚胎學(xué)家的重視。但是，目前沒有一種未成熟卵體外培養(yǎng)體系能夠獲得滿意的實驗室結(jié)局。本研究通過測定不同成熟度的卵母細(xì)胞卵泡液的生殖激素水平，觀察不同卵泡大小來源的第二次減數(shù)分裂中期卵(MⅡ)實驗室結(jié)局，探討生殖激素和卵泡大小與控制性超促排卵(COH)過程中卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的關(guān)系，為完善未成熟卵體外培養(yǎng)體系提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年7月至2016年4月接受胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)助孕患者作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)女性年齡22～35歲；(2)體重指數(shù)(BMI)：18～25 kg/m2；(3)基礎(chǔ)激素正常；(4)無其他內(nèi)分泌疾??；(5)因女方輸卵管因素或男方因素行ICSI助孕；(6)采用《輔助生殖促排卵藥物治療專家共識》里標(biāo)準(zhǔn)的長方案促排卵[3]。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)高泌乳素血癥；(2)多囊卵巢綜合征；(3)子宮內(nèi)膜異位癥；(4)甲狀腺功能亢進(jìn)癥或甲狀腺功能低下癥。本研究均經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)且研究對象簽署知情同意書。

1.2COH方案 患者排卵后給予皮下注射醋酸曲普瑞林(法國益普生)0.1 mg/d降調(diào)節(jié)，至月經(jīng)第2天或第3天起檢測血清FSH、LH、E2、P及B超監(jiān)測研究對象降調(diào)節(jié)情況。達(dá)到降調(diào)節(jié)(FSH<5 mIU/mL、LH<5 mIU/mL、E2<50 pg/mL,子宮內(nèi)膜厚度<5 mm)標(biāo)準(zhǔn)后開始皮下注射醋酸曲普瑞林0.05 mg/d直至人絨毛膜促性腺激素(hCG)日，應(yīng)用醋酸曲普瑞林至18 d時給予促性腺激素(Gn) 75～300 IU/d直至hCG日，根據(jù)超聲監(jiān)測的卵泡情況及血清激素水平調(diào)整Gn用量。當(dāng)B超提示出現(xiàn) 3 個及以上主導(dǎo)卵泡直徑≥18 mm 時，肌肉注射絨毛促性腺激素5 000～10 000 U，36～38 h后經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下取卵。

1.3卵泡液標(biāo)本收集 取卵日，采用單腔取卵針取卵(美國庫克)。記錄每個穿刺卵泡的直徑，一一對應(yīng)收集研究對象卵泡液，將混有血塊或者紅細(xì)胞污染的卵泡液丟棄。將搜集的無血液污染的卵泡液200×g離心10 min，取上清液3 mL置于5 mL的EP管內(nèi)，標(biāo)記后置于-80 ℃冰箱中保存儲備。

1.4體外受精-胚胎培養(yǎng) 胚胎實驗室將獲得的每個卵丘復(fù)合物單獨置于微滴中培養(yǎng)2～4 h后拆蛋，觀察卵母細(xì)胞成熟度。卵胞漿內(nèi)可見生發(fā)泡，卵周間隙未見第一極體為生發(fā)泡期(GV)；卵胞漿內(nèi)未見生發(fā)泡，卵周間隙未見第一極體為第一次減數(shù)分裂中期(MⅠ)；卵周間隙可見第一極體為第二次減數(shù)分裂中期(MⅡ)。按卵母細(xì)胞成熟度進(jìn)行分組：GV組、MⅠ組和MⅡ組，并根據(jù)卵泡直徑將MⅡ卵分為大卵泡組(直徑≥18 mm)、中卵泡組(14 ～<18 mm)和小卵泡組(直徑<14 mm)。

對MⅡ卵行ICSI，受精后的卵置于卵裂胚培養(yǎng)液做成的微滴中。18～20 h觀察受精情況并記錄，觀察到兩個極體算正常受精。68～70 h進(jìn)行卵裂胚評分。卵裂胚評分如下：Ⅰ級，碎片 <10%，卵裂球均勻;Ⅱ級，碎片10%～<25%，卵裂球均勻或略不均勻;Ⅲ級，碎片25%～<50%，卵裂球不均勻;Ⅳ級，碎片50%～≤100%，卵裂球不均勻。7～9細(xì)胞Ⅰ/Ⅱ級胚胎定義為優(yōu)質(zhì)胚胎，6～10細(xì)胞Ⅲ級及以上胚胎為可利用胚胎。實驗室結(jié)局中各組雙原核(2PN)受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、可利用胚胎率計算方法如下：2PN受精率=2PN卵子數(shù)/注射MⅡ卵子總數(shù)×100%，優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/正常受精胚胎總數(shù)×100%，可利用胚胎率=可利用胚胎數(shù)/卵裂胚胎數(shù)×100%。

1.5實驗室方法 卵泡液中FSH、LH、E2、T水平測定采用化學(xué)發(fā)光法測定，使用德國羅氏公司的ELECSYS試劑，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

2 結(jié) 果

2.1研究對象一般情況 本研究共納入48例患者作為研究對象，平均年齡為(28.23±3.43)歲，平均體重指數(shù)(BMI)為(21.43±1.76)kg/m2，基礎(chǔ)FSH為(5.94±1.03)mIU/mL，LH為(4.15±0.84)mIU/mL，E2為(43.60±5.55)pg/mL，T為(1.06±0.22)nmol/L。穿刺卵泡688個，共獲卵636枚，其中大卵泡獲卵379枚，中卵泡獲卵143枚，小卵泡獲卵114枚。拆蛋后觀察卵母細(xì)胞成熟度：GV卵79枚，MⅠ卵113枚，MⅡ卵444枚。將444枚MⅡ卵行ICSI治療，其中小卵泡來源20枚，中卵泡來源69枚，大卵泡來源355枚。

2.2GV組、MⅠ組、MⅡ組激素水平比較 MⅡ組FSH水平顯著高于GV組和MⅠ組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；GV組FSH水平與MⅠ組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。MⅡ組LH水平顯著高于GV組和MⅠ組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；GV組LH水平與MⅠ組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。各組E2水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。MⅡ組T水平顯著高于GV組和MⅠ組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；GV組T水平與MⅠ組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.3MⅡ卵各組激素水平比較 大卵泡組、中卵泡組和小卵泡組FSH、LH、E2、T水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表1 GV組、MⅠ組、MⅡ組激素水平比較

表2 MⅡ卵各組激素水平比較

2.4各組2PN受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、可利用胚胎率比較 從受精率看，大卵泡組2PN受精率高于小卵泡組和中卵泡組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而小卵泡組2PN受精率與中卵泡組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。大卵泡組可利用胚胎率高于小卵泡組和中卵泡組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而小卵泡組可利用胚胎率與中卵泡組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。大卵泡組優(yōu)質(zhì)胚率略高于小卵泡和中卵泡組，但兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組2PN受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、可利用胚胎率比較[%(n/n)]

3 討 論

在卵泡早期FSH可以誘發(fā)顆粒細(xì)胞逐漸產(chǎn)生LH受體，隨著卵母細(xì)胞的發(fā)育，顆粒細(xì)胞中LH受體增多，當(dāng)卵泡成熟最后階段，產(chǎn)生的E2對LH形成正反饋，LH達(dá)峰值，LH同時促進(jìn)卵泡膜細(xì)胞產(chǎn)生T，與FSH共同促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟[4]。

FSH、LH自垂體分泌后經(jīng)血液運輸作用于顆粒細(xì)胞及卵泡膜細(xì)胞。FSH在卵泡早期的募集發(fā)揮重要作用，隨著卵母細(xì)胞成熟度的增加，本研究發(fā)現(xiàn)，MⅡ組FSH水平顯著高于GV組和MⅠ組，GV組FSH水平與MⅠ組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。GV組LH水平與MⅠ組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但是MⅡ組LH水平顯著高于GV組和MⅠ組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這可能是在LH峰發(fā)生前環(huán)磷酸腺苷(cAMP)和環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)抑制細(xì)胞成熟因子(MPF)的活性，當(dāng)LH水平增加時，卵母細(xì)胞內(nèi)及卵泡內(nèi)細(xì)胞的cAMP和cGMP急劇降低，對MPF的抑制作用減弱從而促使減數(shù)分裂繼續(xù)，促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟[5]。本研究結(jié)果顯示，不同卵母細(xì)胞的卵泡液中E2水平并無顯著增加，甚至隨著卵母細(xì)胞成熟度增加略有下降，這可能與卵泡后期卵泡液體積增大對E2起到稀釋作用有關(guān)，WALTERS等[6]研究同樣發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象。有研究認(rèn)為左右卵巢的E2水平存在顯著差異，但是不同卵母細(xì)胞之間E2水平無顯著差異[7]。本研究還發(fā)現(xiàn)，MⅡ組T水平顯著高于GV組和MⅠ組，這與周易等[8]研究結(jié)果一致。隨著卵母細(xì)胞的成熟，顆粒細(xì)胞LH受體的增加，T的生成增加。T通過 PI3K/AKT/Foxo3a 信號通路上調(diào)始基卵泡中卵母細(xì)胞的胰島素樣生長因子-1受體促進(jìn)始基卵泡的激活，同時T與 FSH 協(xié)同作用，增強(qiáng) cAMP 介導(dǎo)的信號通路活性，從而促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖和竇前卵泡發(fā)育[9-10]。有研究顯示，給予T可顯著增加竇前和小竇狀卵泡的數(shù)目，減少了卵泡的閉鎖,促進(jìn)卵泡的發(fā)育[11]。但是過量的T，會激活缺氧誘導(dǎo)因子1促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)，導(dǎo)致卵巢人血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞的增殖，進(jìn)而導(dǎo)致卵巢膠原纖維合成過度，間質(zhì)彌漫性增生，抑制排卵[12-13]。這在多囊卵巢綜合征與非多囊卵巢綜合征患者的卵泡液比較中得到驗證[14]。

卵泡大小與卵母細(xì)胞成熟度及發(fā)育潛能的關(guān)系一直存在爭議。有學(xué)者認(rèn)為卵母細(xì)胞的成熟及卵裂能力與卵泡大小無關(guān)[15],也有學(xué)者持相反觀點[16]。本研究發(fā)現(xiàn)：大卵泡組、中卵泡組和小卵泡組FSH、LH、E2、T水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。但是大卵泡組受精率、可利用胚胎率顯著高于小、中卵泡組。大卵泡組優(yōu)質(zhì)胚率略高于小卵泡和中卵泡組，但兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。國外有學(xué)者同樣發(fā)現(xiàn)卵泡直徑大具有更高的胚胎利用率，而隨卵泡直徑減小，卵母細(xì)胞成熟度和受精率降低，胚胎質(zhì)量下降[17]。不完全的細(xì)胞質(zhì)成熟可能是造成臨床結(jié)局差異的原因之一，這也是研究者進(jìn)行未成熟卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)成熟(IVM)后行ICSI治療結(jié)局不太理想的主要原因。本研究MⅡ組FSH、LH、T水平顯著高于其余兩組，因此筆者認(rèn)為在對GV、MⅠ卵行IVM時應(yīng)適當(dāng)添加這3類激素可以促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟。

綜上所述，激素與卵泡的發(fā)育成熟密切相關(guān)，直徑≥18 mm的卵泡獲取MⅡ卵行ICSI助孕的實驗室結(jié)局優(yōu)于直徑<18 mm的卵泡。在超促排卵獲取較大直徑的卵泡中，提高卵母細(xì)胞細(xì)胞核與胞漿成熟的同步化是IVM獲取優(yōu)質(zhì)胚胎的重要因素，對于IVM時各種激素的適宜濃度仍需大樣本、多中心的研究。