張瑾莉， 徐 敏， 楊 希， 朱麗婭， 袁翔宇

(1.安徽糧食工程職業(yè)學(xué)院， 安徽 合肥 230011；2.合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 安徽 合肥 230601)

0 引 言

隨著人們生活水平的提高和生活習(xí)慣的改變，動脈粥樣硬化和高血壓發(fā)病率越來越高，已成為影響人們健康的重要因素，而且發(fā)病年齡越來越年輕化。研究表明，血管細(xì)胞氧化應(yīng)激是動脈粥樣硬化和高血壓等這些血管慢性疾病的重要誘因之一[1-2]。

氧化應(yīng)激是指生物體內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)之間失衡，氧化產(chǎn)物多于抗氧化劑，從而導(dǎo)致細(xì)胞過氧化損傷，影響細(xì)胞正常功能的現(xiàn)象[3-4]。細(xì)胞內(nèi)抗氧化劑表達水平的高低可反映出細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激情況及抗氧化作用[5-6]。

栝樓籽是我國傳統(tǒng)中藥栝樓的種子，其中的蛋白具有清除DPPH自由基及羥基自由基的功效[7]，顯示一定的體外抗氧化性。但其在細(xì)胞水平的抗氧化作用及降血壓活性相關(guān)報道較少。近年來，越來越多的學(xué)者利用酶解技術(shù)釋放出天然蛋白中的小分子活性肽，這些酶解產(chǎn)物顯示較好的抗氧化活性[8-9]。

因此，文中選用蛋白酶水解栝樓籽，制備栝樓籽蛋白酶解物(Protease hydrolysates of Trichosanthes seed， PHTS)，通過研究其對氧化損傷的人臍動脈平滑肌細(xì)胞(HUASMC)存活率和抗氧化劑谷胱甘肽(GSH)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)表達水平及縮血管因子內(nèi)皮素(ET)分泌量的影響，探究其對血管細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激作用及其降血壓效應(yīng)，以期為動脈粥樣硬化、高血壓等血管相關(guān)疾病的治療提供更多參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

栝樓籽,購自安徽省安慶市潛山栝樓種植基地；

HUASMC細(xì)胞,購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；

DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、FBS,購自以色列BI公司；

胰蛋白酶，購自美國Corning公司;

堿性蛋白酶、GSH,購自北京索萊寶公司；

CCK8,購自日本Dojindo實驗室；

GSH檢測試劑盒,購自武漢Elabscience生物公司；

ET檢測試劑盒,購自山東博研生物公司；

CAT、SOD、GAPDH多克隆抗體及HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)二抗,均購自武漢三鷹生物公司；

ECL化學(xué)發(fā)光試劑,購自Biosharp公司。

1.2 方法

1.2.1 栝樓籽蛋白酶解物(PHTS)的制備

將鮮栝樓籽經(jīng)干燥、去殼、粉碎、脫脂后，稱取10 g，按料液比1∶10(m/v)加入3%堿性蛋白酶溶液1 000 mL，置于50 ℃、pH至9.00條件下水解，使用2.00 mol/L NaOH溶液保持pH至9.00，直至pH值不再變化，即視為水解反應(yīng)結(jié)束，水解過程持續(xù)4 h，得到的栝樓籽蛋白酶解物水解度為15.73%。再置于90 ℃水浴10 min滅酶后，調(diào)節(jié)pH至7.00，再離心取上清液，濃縮并真空冷凍干燥，得栝樓籽蛋白酶解物粉末，標(biāo)記為PHTS。

1.2.2 HUASMC細(xì)胞存活率檢測

將HUASMC細(xì)胞按濃度4×104細(xì)胞/mL、每孔100 μL種到96孔板中，于細(xì)胞培養(yǎng)箱、37 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng)過夜。第二天取出，將細(xì)胞分組，分別設(shè)置HUASMC、HUASMC(H2O2)、HUASMC(H2O2+GSH)和HUASMC(H2O2+PHTS)組，其中，HUASMC(H2O2+PHTS)組設(shè)置0.625,1.25,2.50,5.00,10.00 mg/mL五種濃度。

各組細(xì)胞兩次加樣順序及濃度見表1。

從表1可以看出，兩次加樣處理：第一次加樣后，37 ℃孵育24 h；取出，進行第二次加樣，37 ℃孵育4 h。再移除細(xì)胞上清液，每孔加入100 μL含10% FBS DMEM培養(yǎng)液和10 μL CCK8， 37 ℃孵育2 h。最后，用酶標(biāo)儀測定波長450 nm處的OD值。

1.2.3 細(xì)胞總GSH水平及ET分泌量的檢測

將HUASMC細(xì)胞按6×104個細(xì)胞/孔、2 mL培養(yǎng)基種于6孔板，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)過夜。表1中對各組細(xì)胞進行兩次加樣處理，此處HUASMC(H2O2+PHTS)組選用10 mg/mL濃度。移取細(xì)胞培養(yǎng)液，用試劑盒檢測ET含量。將細(xì)胞經(jīng)裂解、離心，取上清液，用試劑盒測定總GSH含量。

表1 各組細(xì)胞兩次加樣順序及濃度

1.2.4 細(xì)胞CAT、SOD基因表達水平分析

如1.2.3中，將HUASMC細(xì)胞種于6孔板，進行兩次加樣處理。按照RNA提取試劑盒提取總RNA，再經(jīng)逆轉(zhuǎn)后，進行實時熒光定量PCR(Real-time PCR)，以GAPDH為內(nèi)參。

引物設(shè)計如下：

GAPDH:(Forward)5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，(Reverse)5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′;

CAT：(Forward)5′-TAAGACTGACCAGGGCATC-3′，(Reverse)5′-CAACCTTGGTGAGATCGAA-3′；

SOD：(Forward)5′-GAGATGTTACACGCCCAGATAGC-3′,(Reverse)5-AATCCCCAGCAGTGGAATAAGG-3′。

采用 2-△△Ct法計算各組CAT和SOD基因相對表達量。

1.2.5 細(xì)胞CAT、SOD蛋白表達水平分析

如1.2.3中，將HUASMC細(xì)胞種于6孔板培養(yǎng)并分組，進行兩次加樣處理。再裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，將蛋白定量到同一濃度。每孔等量蛋白加樣進行 SDS-PAGE 電泳，再轉(zhuǎn)膜、漂洗、封閉、脫色。然后將膜置于一抗抗體稀釋液中，4 ℃過夜，再漂洗。再將膜置于二抗抗體稀釋液中室溫孵育 1 h，再漂洗，用 ECL 化學(xué)發(fā)光法顯影，在 Image J中分析條帶灰度。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)至少采用3個平行樣本，數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Graphpad Prism進行統(tǒng)計分析。*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，****表示p<0.000 1。

2 結(jié)果與分析

2.1 PHTS對氧化損傷HUASMC細(xì)胞活性的影響

CCK8試劑是一種細(xì)胞計數(shù)試劑，可在細(xì)胞線粒體中脫氫酶作用下生成黃色甲臜產(chǎn)物，甲臜產(chǎn)物的生成量與活細(xì)胞數(shù)量成正比，可間接由OD450值反映。

栝樓籽蛋白酶解物對氧化損傷HUASMC細(xì)胞活性的影響如圖1所示。

圖1 栝樓籽蛋白酶解物對氧化損傷HUASMC細(xì)胞活性的影響

圖1結(jié)果顯示，經(jīng)H2O2損傷之后，HUASMC細(xì)胞存活率明顯下降，而加入PHTS的HUASMC細(xì)胞存活率明顯升高，且細(xì)胞活性與PHTS濃度呈正相關(guān)。其中HUASMC(H2O2+10 mg/mL PHTS)組細(xì)胞存活率最高，且顯著高于GSH陽性對照組，故后續(xù)實驗中，HUASMC(H2O2+PHTS)組均選用10 mg/mL濃度。

2.2 PHTS對氧化損傷HUASMC細(xì)胞總GSH水平的影響

栝樓籽蛋白酶解物對氧化損傷HUASMC細(xì)胞總GSH水平和ET分泌量的影響，如圖2所示。

(a) 總GSH水平 (b) ET分泌量

GSH是細(xì)胞內(nèi)最重要的非酶類自由基清除劑之一。圖2(a)顯示，經(jīng)H2O2處理后，HUASMC細(xì)胞總GSH水平顯著下降，而加入10 mg/mL PHTS處理的HUASMC細(xì)胞總GSH水平顯著提升，顯示較好的抗氧化應(yīng)激作用。

2.3 PHTS對氧化應(yīng)激HUASMC細(xì)胞分泌內(nèi)皮素(ET)的影響

內(nèi)皮素(ET)是生物體內(nèi)的一種活性多肽，具有收縮血管功效[10]。其適量分泌有利于血管維持基本張力，但是過量分泌可引起血壓升高。圖2(b)顯示，HUASMC細(xì)胞經(jīng)H2O2氧化損傷后ET分泌量明顯增高，而加入10 mg/mL PHTS處理可使ET分泌水平下降。因此，PHTS有利于降血壓。

2.4 PHTS對氧化損傷HUASMC細(xì)胞內(nèi)CAT和SOD基因表達的影響

栝樓籽蛋白酶解物對氧化損傷HUASMC細(xì)胞內(nèi)CAT和SOD基因表達的影響，如圖3所示。

CAT和SOD是細(xì)胞內(nèi)最常見的兩種抗氧化酶。圖3結(jié)果顯示，經(jīng)H2O2損傷后，HUASMC細(xì)胞的CAT和SOD基因表達水平顯著下降。而加入10 mg/mL PHTS，細(xì)胞的CAT和SOD基因表達水平顯著提升，且高于GSH陽性對照組，有助于抗氧化。

2.5 PHTS對氧化損傷HUASMC細(xì)胞內(nèi)CAT和SOD蛋白表達的影響

Western Blot檢測各組細(xì)胞內(nèi)CAT、SOD蛋白表達情況和灰度分析結(jié)果分別如圖4和圖5所示。

(a) CAT (b) SOD

圖4 各組HUASMC細(xì)胞的CAT和SOD蛋白表達情況

(a) CAT (b) SOD

結(jié)果表明，與H2O2損傷組相比，加入10 mg/mL PHTS處理組細(xì)胞的CAT和SOD蛋白表達水平顯著提升。

3 結(jié) 語

氧化應(yīng)激是導(dǎo)致血管細(xì)胞損傷與功能失調(diào)的常見誘因之一，因此，開發(fā)抗氧化類藥物是防治這些疾病的重要方向。栝樓籽蛋白酶解物可有效保護人臍動脈平滑肌細(xì)胞HUASMC的抗氧化系統(tǒng)，通過增強GSH、CAT、SOD等抗氧化劑的作用，從而抵抗H2O2引起的氧化應(yīng)激損傷，提高細(xì)胞活性，減少細(xì)胞凋亡率。同時，還能抑制氧化損傷HUASMC細(xì)胞分泌ET，具有體外降血壓活性。因此，本研究為防治動脈粥樣硬化和高血壓等血管疾病的藥物研發(fā)提供了更多思路。