秦 娣，楊 雪，秦學林

(1.南京體育學院 運動健康學院，江蘇 南京 210014； 2.江蘇省運動與健康工程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210014；3.南京傳奇生物科技有限公司，江蘇 南京 211100)

0 引 言

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種原發(fā)性肝癌，是全球常見癌癥之一，主要在亞洲和非洲地區(qū)，在我國尤為常見[1].HCC的治療包括肝移植、手術切除、局部消融、經(jīng)動脈導管栓塞化療(TACE)、放療、靶向藥物和免疫療法等多種手段[2].盡管隨著現(xiàn)代醫(yī)學技術的發(fā)展，這些治療方法取得了很大進展，但是HCC仍然是全球第三大癌癥死亡原因，患者生存率低和預后差的原因是腫瘤復發(fā)率和轉(zhuǎn)移率較高[1].因此，尋找肝癌診斷或預后有效的生物標志物和治療靶點具有重要意義.

Fcγ受體(Fc gamma Receptor，F(xiàn)cγR)是所有IgG分子重鏈Fc部分的受體，屬于免疫球蛋白超家族，在人類中含有FcγRI、FcγRII、FcγRIII，在小鼠中還包括FcγRIV[3].人類FcγRII包括FcγRIIA、FcγRIIB和FcγRIIC三個亞型，小鼠FcγRII僅有FcγRIIB一個成員.FcγR在功能上分為活化性受體和抑制性受體兩類，其中FcγRIIB是唯一已知的抑制性受體，其胞內(nèi)段的免疫受體酪氨酸抑制基序(Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibition Motif，ITIM)發(fā)揮負向調(diào)節(jié)作用[4].FcγRIIB的兩個主要變體FcγRIIB1和FcγRIIB2分別在B細胞、嗜堿性粒細胞上高表達，在巨噬細胞、單核細胞、樹突狀細胞等白細胞和其他非白細胞上也有表達，F(xiàn)cγRIIB的異常表達與許多自身免疫性疾病和惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切[5-8].

大量流行病學研究已經(jīng)證實，多種腫瘤與慢性炎癥有關，其中HCC是典型代表.機體在感染因素，例如乙型或丙型肝炎病毒的慢性感染以及非感染因素如黃曲霉毒素暴露、酒精、非酒精性脂肪沉積等長期刺激下，形成慢性炎癥，炎癥持續(xù)破壞肝細胞，加快肝細胞基因突變，從而誘發(fā)癌變[9].然而，慢性炎癥和肝癌之間的分子機制尚未完全清楚.鑒于FcγRIIB是人和小鼠體內(nèi)唯一的抑制性FcγR，具有抑制炎性反應作用，因此，本研究檢測了FcγRIIB在肝癌中的表達，為肝癌診斷或預后提供新的生物標志物，并為進一步揭示FcγRIIB在肝癌中的作用以及深入研究肝臟炎癌轉(zhuǎn)化的調(diào)控機制提供潛在靶點和理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 生物信息學分析

HCC的RNASeq數(shù)據(jù)來源于腫瘤基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA).微陣列中的數(shù)據(jù)基于Affymetrix平臺，并從基因表達綜合數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus，GEO)GSE14520下載.利用Oncomine數(shù)據(jù)庫分析HCC和正常肝組織中FcγRIIB mRNA的表達水平，搜索參數(shù)如下：“FcγRIIB”、“癌癥和正常分析”、“肝細胞癌”和“mRNA”.

1.2 臨床樣本

12例肝癌患者的癌巢、癌旁、無明顯病變的肝組織標本，12例血管瘤患者的肝組織標本，均取自南京鼓樓醫(yī)院.標本取出后，立即將其在液氮中保存 30 min 以上，并轉(zhuǎn)移到 -80 ℃ 超低溫冰箱中長期儲存.所有患者均簽署了知情同意書，醫(yī)院倫理委員會審查委員會批準了該研究.

1.3 小鼠肝細胞癌模型

C57BL/6野生型小鼠，6～8周齡，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司.動物飼養(yǎng)在中國藥科大學新藥安全評價研究中心SPF動物房.小鼠繁殖后，在2周齡時腹腔注射 25 mg/kg N-亞硝基二乙胺(DEN)(Sigma公司).注射DEN后8個月，小鼠被頸椎脫位處死后取肝臟.

1.4 實時定量PCR(qRT-PCR)

在NCBI中找到各個目的基因的編碼序列，利用Beacon designer軟件設計引物，并在NCBI基因上進行驗證，各個目的基因引物序列見表1.上述臨床組織樣本和小鼠肝組織勻漿后，采用Trizol試劑(Takara，RNAiso Plus，貨號9109)提取總RNA.運用PrimeScriptTMRT試劑盒(Takara，貨號RR047A)生成cDNA.使用TB Green Real-time Master Mix(Takara, 貨號RR420A)在Applied Biosystems StepOne儀器(Bio-rad)上運行qRT-PCR.通過雙標準曲線法計算mRNA表達.

表1 基因引物序列

續(xù)表1

1.5 蘇木精-伊紅(H&E)染色

小鼠新鮮肝組織在4%多聚甲醛溶液中固定 24 h 以上，水沖洗組織塊除去固定劑，組織置于梯度濃度乙醇后，在二甲苯和蠟中滲透.組織經(jīng)過包埋、修剪、切片、干燥后完成石蠟切片.將石蠟切片浸泡在二甲苯和酒精中，蘇木精染色 5 min，伊紅染色 3 min，然后重新浸泡在酒精和二甲苯中.載玻片用合成樹脂固定，顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照.

1.6 統(tǒng)計分析

統(tǒng)計分析采用GraphPad Prism 5的t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義.

2 結(jié) 果

2.1 生物信息學分析顯示FcγRIIB在HCC中低表達

TCGA和GSE14520數(shù)據(jù)庫用于分析HCC、正常肝組織中FcγRIIB和其他FcγRs mRNA的表達.在TCGA數(shù)據(jù)庫中，比較374例HCC組織和50例正常組織，結(jié)果顯示，HCC組織中FcγRIIB的表達明顯低于正常組織(圖1a).通過比較225例HCC組織和220例正常組織，在GSE14520數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果(圖1a).HCC組織和正常組織之間，F(xiàn)cγRI、FcγRIIA和FcγRIII的表達水平無統(tǒng)計學意義(圖1b).

(a)TCGA和GSE14520數(shù)據(jù)庫分析HCC組織和 (b) TCGA和GSE14520數(shù)據(jù)庫分析HCC組織和正常肝正常肝組織中FcγRIIB的表達組織中FcγRI、FcγRIIA、FcγRIII的表達*P<0.05，***P<0.001，ns：無統(tǒng)計學差異圖1 TCGA和GSE14520數(shù)據(jù)庫分析HCC組織和正常肝組織中FcγRs mRNA的表達Fig.1 Analysis of FcγRs mRNA expression in HCC and normal liver tissue by TCGA and GSE14520 databases

通過Oncomine數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)cγRIIB的下調(diào)也見于其他腫瘤，例如結(jié)直腸癌、白血病和肺癌等(圖2a).在Roessler和Wurmbach肝臟數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)，與正常肝組織相比，HCC組織中FcγRIIB mRNA水平顯著降低(圖2b).

(a)各種腫瘤和相應正常對照組織中FcγRIIB表達的比較 (b)HCC組織和正常肝組織中FcγRIIB的表達***P<0.001圖2 Oncomine數(shù)據(jù)庫分析HCC中FcγRIIB mRNA的表達Fig.2 Analysis of FcγRIIB mRNA expression in HCC by Oncomine databases

2.2 臨床HCC組織中FcγRIIB表達降低

通過qRT-PCR檢測臨床HCC患者的癌巢、癌旁組織和無明顯病變的肝組織樣本中FcγRs的表達水平，將臨床血管瘤患者的肝組織樣本作為另一個對照.如圖3a所示，與癌旁和非病理性肝組織相比，癌巢中FcγRIIB1和FcγRIIB2的表達水平顯著降低，與血管瘤肝組織相比，癌巢中FcγRIIB2的表達顯著下調(diào).FcγRI、FcγRIIA和FcγRIII的表達在各組之間無統(tǒng)計學差異(圖3b).

(a) 臨床HCC組織中FcγRIIB1、FcγRIIB2的表達

2.3 DEN誘導小鼠肝癌模型中FcγRIIB表達下調(diào)

DEN注射后8個月，小鼠肝臟有明顯的腫瘤結(jié)節(jié)(圖4a).H&E染色顯示，模型組肝組織具有明顯的癌變特征，細胞壞死，細胞核大而深，核質(zhì)比例增加，非典型細胞增多(圖4b).qRT-PCR檢測DEN誘導小鼠肝癌模型中FcγRIIB mRNA的表達，結(jié)果顯示，與正常肝組織相比，模型組肝組織中FcγRIIB的表達顯著下調(diào)(圖5).對照組和模型組之間FcγRIII和FcγRIV的表達沒有統(tǒng)計學差異.

(a) 肝臟腫瘤結(jié)節(jié)的觀察 (b) 肝組織H&E染色圖4 DEN誘導小鼠肝細胞癌Fig.4 Induction of HCC in mouse by DEN

***P<0.001，**P<0.01圖5 qRT-PCR檢測DEN誘導小鼠肝癌模型中FcγRIIB mRNA的表達Fig.5 Detection of FcγRIIB mRNA expression in DEN-induced mouse HCC model by qRT-PCR

3 討 論

長期以來，慢性炎癥一直被視為促發(fā)癌癥的一個關鍵風險因素，慢性炎癥增加了患腫瘤的風險并促進腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移[10-11].HCC的發(fā)生是一個多步驟多節(jié)點的過程，病毒感染、肝臟毒性藥物、代謝紊亂等多種危險因素導致肝細胞損傷或死亡，肝臟中免疫細胞活化，誘發(fā)肝臟遷延不愈的慢性非可控性炎癥，引起肝細胞失控的代償性增殖修復，癌細胞產(chǎn)生的幾率增加，最終導致肝臟炎癌轉(zhuǎn)化[12-13].據(jù)報道，鋅指轉(zhuǎn)錄因子Miz1在HCC小鼠模型和相當一部分HCC患者中下調(diào)，產(chǎn)生促炎細胞因子等，使腫瘤浸潤巨噬細胞的極化偏向促炎表型，從而促進HCC[14].該研究表明，慢性炎癥在HCC中起到核心作用.

FcγR家族最重要的功能之一是在同一細胞上共同表達活化性受體和抑制性受體，共同設定免疫細胞活化閾值.活化性FcγR很多，例如人的FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIC、FcγRIII和小鼠的FcγRI、FcγRIII、FcγRIV.活化性受體通過免疫受體酪氨酸活化基序(Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif，ITAM)傳遞信號，促進抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用(ADCC)、抗體依賴性細胞介導的吞噬作用(ADCP)、抗原抗體免疫復合物(IC)的內(nèi)吞作用和炎性細胞因子的產(chǎn)生等[15].人和小鼠均只有一種抑制性FcγR，即FcγRIIB，F(xiàn)cγRIIB能夠調(diào)節(jié)炎癥反應和細胞因子釋放.Kovacs等人[16]研究表明，F(xiàn)cγRIIB在一種自身免疫性皮膚病即獲得性大皰性表皮松解癥(EBA)模型中能夠抑制皮膚炎癥，保護皮膚免受中性粒細胞的早期浸潤和激活.張唯等人[17]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)cγRIIB-/-小鼠與FcγRIIB+/+小鼠相比，血清中炎性因子TNF-α、IL-6和IFN-γ水平明顯升高，脂肪組織巨噬細胞浸潤顯著增加，M1型極化基因TNF-α、MCP-1增加，表明敲除FcγRIIB加重高脂飲食誘導下的小鼠全身及脂肪組織局部炎癥反應.Akyol等人[18]研究表明，小鼠腦出血后，靜脈注射免疫球蛋白(IVIG)通過激活FcγRIIB-SHIP1-PIP3通路減弱腦出血誘導的肥大細胞激活，從而抑制腦炎癥，減輕腦水腫，改善腦出血后的神經(jīng)功能.Pandey等人[19]發(fā)現(xiàn)，由過敏原和過敏原特異性IgG形成的免疫復合物(IgG1-IC)與FcγRIIB結(jié)合抑制了C5a介導的炎癥信號，減少過敏性疾病的炎癥反應.本實驗中，F(xiàn)cγRIIB在HCC中的低表達可能是肝臟慢性非可控性炎癥并最終進展為HCC的重要原因之一.

Ishikawa等人[20]研究非酒精性脂肪肝疾病時發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)cγRIIB的表達與纖維化分期成反比關系.Vilar-Gomez等人[21]發(fā)現(xiàn)非酒精性脂肪肝患者的血小板計數(shù)隨著肝纖維化的發(fā)展而減少.Jin等人[22]以及上述Ishikawa等人[20]也指出，肝竇內(nèi)皮細胞上血小板計數(shù)與FcγRIIB水平成正相關，在肝臟高纖維化階段血小板計數(shù)偏低，F(xiàn)cγRIIB的表達也降低.Jin等人還發(fā)現(xiàn)，慢性乙型肝炎患者血清樣本中的FcγRIIB水平與HBV攜帶者和健康對照組相比顯著降低，中度和重度慢性乙型肝炎組FcγRIIB的表達顯著低于對照組，F(xiàn)cγRIIB可以作為預測慢性乙型肝炎患者炎癥程度和纖維化分期的指標[22].本研究中FcγRIIB在HCC中低表達的原因可能是，在肝癌進展過程中，炎癥和纖維化影響了FcγRIIB的表達.由于FcγRIIB能夠抑制活化性受體介導的炎癥反應，其表達降低可能進一步加重肝臟炎癥并誘導肝癌發(fā)生.

肝癌傳統(tǒng)診斷方法，例如甲胎蛋白(AFP)的特異性和敏感性有限，尤其敏感性僅為60%～70%.目前，沒有單一的生物標志物單獨用于診斷HCC，尤其在肝癌早期.盡管，一些基因已被視為是肝癌診斷的新生物標志物或肝癌的潛在預測指標和治療靶點，例如SCAMP3、STK39和SOX4等，但是，仍然需要更多更好的肝癌特異性的診斷、預后和進展生物標志物[23-24].本研究首先采用生物信息學分析發(fā)現(xiàn)FcγRIIB在HCC組織中低表達，然后通過臨床患者樣本證實了FcγRIIB在HCC中表達降低，最后在DEN誘導的小鼠肝癌模型中也檢測到FcγRIIB表達下調(diào)，因此，F(xiàn)cγRIIB可能成為肝癌診斷或預后的生物標志物或新的治療靶點.作者將在FcγRIIB基因敲除小鼠中繼續(xù)探討FcγRIIB與炎癥的相關性以及FcγRIIB在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用.本研究為肝癌診斷或預后提供新的生物標志物，并為進一步明晰肝臟炎癌轉(zhuǎn)化的分子調(diào)控機制進而干預HCC的發(fā)生奠定基礎.

4 結(jié) 論

本文研究抑制性受體FcγRIIB在HCC中的表達，生物信息學、臨床樣本和小鼠模型的結(jié)果均表明，F(xiàn)cγRIIB在HCC中低表達，提示FcγRIIB可能成為肝癌診斷或預后新的生物標志物，并在肝臟炎癌轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用.