游 萍，肖群英，薛曉輝，劉 賢，戴志東

不同植被對(duì)煤礦復(fù)墾區(qū)域土壤真菌多樣性和酶活性的影響

游 萍1,2，肖群英1,2，薛曉輝1,2，劉 賢1,2，戴志東3

1. 貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院生態(tài)工程學(xué)院，貴州畢節(jié) 551700；2. 貴州省典型高原濕地生態(tài)保護(hù)與修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州畢節(jié) 551700；3. 貴州康騰能源集團(tuán)有限公司，貴州金沙 551800

為了評(píng)價(jià)不同植被對(duì)煤礦廢棄地復(fù)墾區(qū)土壤生態(tài)修復(fù)的效果，本研究開(kāi)展了桃樹(shù)、杉樹(shù)、李樹(shù)等植被對(duì)復(fù)墾區(qū)土壤酶活性和真菌種群多樣性的影響分析。結(jié)果表明：（1）不同植被下，脲酶、酸性磷酸酶和轉(zhuǎn)化酶的活性差異顯著。脲酶在對(duì)照中最高，桃樹(shù)最低；酸性磷酸酶活性對(duì)照最高，杉樹(shù)（0～20、40～60 cm）和桃樹(shù)（20～40 cm）土壤中最低，且一般情況下酶活性隨土層加深而降低，具有表聚性，但不同植被和不同土層的轉(zhuǎn)化酶活性的變化表現(xiàn)不同；該區(qū)域土壤的pH隨土層加深增高，最高為5.67，均呈酸性，除對(duì)照外，均表現(xiàn)出一定程度的差異性。（2）不同植被下，所有土壤樣品的真菌種群優(yōu)勢(shì)門(mén)均為子囊菌門(mén)（Ascomycota）、擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）、毛霉菌門(mén)（Mucoromycota），季也蒙酵母屬（）和芽枝霉屬（）為所有土壤樣品都具有的優(yōu)勢(shì)屬，而孢霉屬（）僅在柳樹(shù)土壤中不是優(yōu)勢(shì)屬，青霉菌屬（）綠核菌屬（）是李樹(shù)土壤中的優(yōu)勢(shì)屬；盤(pán)菌屬（）是杉樹(shù)土壤中的優(yōu)勢(shì)屬；刺毛四枝孢（）是對(duì)照土壤中的優(yōu)勢(shì)屬。通過(guò)綜合非度量多維尺度分析（Non-metric multidimensional scaling, NMDS）表明，不同植被的土壤真菌群落組成差異較大，柳樹(shù)0～20 cm、杉樹(shù)20～40 cm、對(duì)照40～60 cm土壤中的真菌數(shù)量和多樣性較豐富，其中桃樹(shù)土壤中的真菌豐富度和多樣性相對(duì)較低。本研究結(jié)果可以為其他煤礦復(fù)墾區(qū)域土壤生態(tài)修復(fù)研究提供借鑒。

煤礦廢棄地；高通量測(cè)序；真菌；多樣性；群落組成；土壤酶

土壤微生物是自然界中重要的生物類(lèi)群，同時(shí)也是土壤中最活躍的成員，參與了土壤生態(tài)系統(tǒng)中有機(jī)物質(zhì)的分解和養(yǎng)分的吸收利用[1]，改善和調(diào)節(jié)植物營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)植物生長(zhǎng)[2]，是實(shí)現(xiàn)生態(tài)凈化功能及其物質(zhì)和能量轉(zhuǎn)化的重要組成部分。大量的有機(jī)物和氮素均可通過(guò)微生物作用去除[3-4]，有些微生物還具有富集重金屬的能力，推動(dòng)了生物的地球化學(xué)循環(huán)[5]。與土壤的健康狀況密切相關(guān)，可以作為土壤質(zhì)量變化的檢測(cè)指標(biāo)[6-8]，在土壤生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著非常重要的作用。土壤中幾乎所有的生化反應(yīng)都是由酶驅(qū)動(dòng)的[9]，土壤酶源自土壤微生物和動(dòng)植物，是土壤新陳代謝的重要因素，與土壤養(yǎng)分礦化與循環(huán)密切相關(guān)，其活性可以用來(lái)評(píng)估土壤質(zhì)量水平[10]，土壤脲酶活性表征土壤的氮素狀況，過(guò)氧化氫酶在一定程度上反映了土壤微生物過(guò)程的強(qiáng)度，土壤磷酸酶（堿性磷酸酶、中性磷酸酶和酸性磷酸酶）的活性可表征土壤的肥力狀況，土壤轉(zhuǎn)化酶的活性常用來(lái)表征土壤的熟化程度和肥力水平[9]。

土壤微生物的數(shù)量和分布受營(yíng)養(yǎng)物、含水量、氧、溫度、pH等因子的影響[11]。土地利用方式和植物物種，均會(huì)導(dǎo)致微生物種群結(jié)構(gòu)和多樣性的變化。不同陸地生態(tài)系統(tǒng)的自然變異、人為干擾、環(huán)境條件、歷史進(jìn)化因素以及研究的時(shí)空尺度不同，均會(huì)影響土壤微生物群落的地理空間分布；植物通過(guò)光合作用增加生物量，微生物通過(guò)促進(jìn)土壤中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的釋放來(lái)影響植物多樣性和生產(chǎn)力，因此植物物種不同，輸入的營(yíng)養(yǎng)數(shù)量和種類(lèi)不同，引起土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的變化[12]。路穎等[13]研究認(rèn)為，影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的因素在于植被類(lèi)型不同，凋落物的性質(zhì)、數(shù)量和分解速度等不同。張坤等[14]認(rèn)為林下植被通過(guò)分泌物和凋落物影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和組成，同時(shí)也通過(guò)影響土壤微氣候環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)有效性、pH和其他土壤微生物類(lèi)群，間接影響土壤微生物組成。宋賢沖等[15]對(duì)貓兒山亞熱帶常綠闊葉林的研究結(jié)果表明，不同土層深度的土壤微生物群落功能多樣性差異顯著，而造成這種結(jié)果的主要原因在于總有機(jī)碳、速效氨、速效磷和速效鉀的差異。不同林型間土壤微生物群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異，姜雪薇等[16]的研究表明，大興安嶺不同林型間土壤優(yōu)勢(shì)微生物豐度差異較大，擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）和子囊菌門(mén)（Ascomycota）為土壤優(yōu)勢(shì)真菌門(mén)，而屬水平上屬、威氏盤(pán)菌屬（）和空?qǐng)F(tuán)菌屬（）相對(duì)豐度較高。不同生境不同植被的土壤水分、營(yíng)養(yǎng)元素及孔隙結(jié)構(gòu)等土壤環(huán)境因素影響土壤優(yōu)勢(shì)真菌屬的代謝過(guò)程和功能特征，導(dǎo)致真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性呈顯著差異[17]。

煤礦區(qū)是當(dāng)今世界陸地生物圈最典型、退化最嚴(yán)重的生態(tài)系統(tǒng)之一[18]，采礦活動(dòng)及其廢棄物的排放不僅破壞和占用大量的土地資源，且礦山廢棄物的排放和堆存也帶來(lái)一系列影響深遠(yuǎn)的環(huán)境問(wèn)題，制約了當(dāng)?shù)厣鐣?huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展并危害人體健康[19-21]。隨著煤炭的開(kāi)采，礦區(qū)排放的大量尾礦和礦渣占用了大量土地，嚴(yán)重污染水土資源，導(dǎo)致耕地面積進(jìn)一步減少。受資金和技術(shù)的限制，在礦區(qū)開(kāi)采中主要以破壞性開(kāi)采為主，忽視了對(duì)礦區(qū)生態(tài)環(huán)境的保護(hù)[22]，礦產(chǎn)開(kāi)采在污染土壤的同時(shí)，還直接破壞了一些地區(qū)的原生生境，導(dǎo)致生物多樣性喪失，改變了土壤的理化性質(zhì)，影響土壤的微生物組成和菌落結(jié)構(gòu)[23-25]。作為生態(tài)系統(tǒng)中的關(guān)鍵組分，微生物在全球生態(tài)修復(fù)方面具有重要的價(jià)值[2-3]。馬靜等[26]研究認(rèn)為微生物是礦山土壤質(zhì)量提升、生物多樣性恢復(fù)的重要手段，對(duì)礦山生態(tài)恢復(fù)至關(guān)重要。

針對(duì)礦區(qū)開(kāi)采遺留的一系列問(wèn)題，金沙化竹煤礦采取了采空區(qū)臺(tái)階式開(kāi)挖→回收殘煤→采空區(qū)積水抽排到礦山污水處理池處理→分層次回填（中部用粘土層夯實(shí)防滲）→表層覆土→植樹(shù)種草恢復(fù)植被等一系列工程治理措施，回填的土壤均來(lái)自鄰近農(nóng)田，并采取相同處理。本研究對(duì)回填后覆土深度為60 cm的植樹(shù)區(qū)域，使用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)土壤真菌多樣性進(jìn)行研究，目前采用該技術(shù)研究煤礦廢棄地復(fù)墾區(qū)域土壤真菌的研究較少。通過(guò)高通量測(cè)序分析不同植被對(duì)煤礦廢棄地復(fù)墾區(qū)域土壤真菌群落組成和土壤酶的影響，研究結(jié)果將為礦區(qū)復(fù)墾地生態(tài)修復(fù)策略的制訂和實(shí)施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品的采集

土壤樣品采自貴州省畢節(jié)市金沙化竹煤礦礦區(qū)廢棄地生態(tài)治理土壤修復(fù)的第一期工程（106°04￠552～106°05￠542E, 27°24￠462～27°25￠432N），采集時(shí)間為2020年10月17日，分別以修復(fù)后覆土深度為60 cm的桃樹(shù)[L. var.f.(Lindl.) Schneid]、杉樹(shù)（）、柳樹(shù)（Koidz）和李樹(shù)（L.）種植區(qū)域土壤作為采樣區(qū)，各植被種植時(shí)間為2018年，以臨近地區(qū)農(nóng)田（耕作模式為玉米和辣椒間作）土壤為對(duì)照。在每個(gè)采樣區(qū)隨機(jī)設(shè)置5個(gè)采樣點(diǎn)，每個(gè)采樣點(diǎn)分別采取0～20、20～40、40～60 cm 3個(gè)土層深度的土樣，剔除石塊和雜物，混合后分為2份，1份過(guò)2 mm篩，裝入滅菌采樣袋，低溫保存送檢，另一份自然風(fēng)干后用于檢測(cè)土壤酶活性。具體樣點(diǎn)情況見(jiàn)表1。

1.2 土壤酶活性檢測(cè)

土壤過(guò)氧化氫酶（CAT, BC0105）、脲酶（UE, BC0125）、酸性磷酸酶（ACP, BC0140）和酸性轉(zhuǎn)化酶（AI, BC3075）等活性檢測(cè)采用土壤酶活性試劑盒進(jìn)行，試劑盒均來(lái)自南昌科暢生物科技有限公司。

1.3 土壤真菌高通量測(cè)序

采用E.Z.N.A? Mag-Bind Soil DNA Kit試劑盒提取土壤微生物總DNA，采用引物ITS1F（5-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3）和ITS2（5-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3）對(duì)土壤真菌基因中的ITS1可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物回收后用Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)構(gòu)建文庫(kù)并進(jìn)行高通量測(cè)序。

獲得測(cè)序結(jié)果后，利用Trimmomatic v0.33軟件[27]對(duì)測(cè)序得到的raw reads進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾，利用cutadapt 1.9.1軟件[28]進(jìn)行引物序列的識(shí)別與去除，利用FLASH v1.2.7軟件[29]對(duì)高質(zhì)量的reads進(jìn)行拼接，得到clean reads，再用UCHIME v4.2軟件[30]去除嵌合體有效數(shù)據(jù)（effective reads)。使用Usearch軟件[31]在97.0%的相似度水平下進(jìn)行OTU聚類(lèi)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。通過(guò)QIIME2軟件，對(duì)樣品Alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行評(píng)估，利用Mothur軟件和R語(yǔ)言工具依據(jù)各樣品的測(cè)序量在不同測(cè)序深度時(shí)的Shannon指數(shù)（反映樣品中微生物多樣性的指數(shù)）繪制Shannon多樣性指數(shù)稀釋曲線(xiàn)，以此反映各樣本在不同測(cè)序數(shù)量時(shí)的微生物多樣性。根據(jù)每個(gè)樣品的物種組成和相對(duì)豐度進(jìn)行物種熱圖分析，提取每個(gè)分類(lèi)學(xué)水平上的物種，利用R語(yǔ)言工具進(jìn)行作圖，分別在門(mén)、綱、目、科、屬、種分類(lèi)水平上進(jìn)行Heatmap聚類(lèi)分析。

表1 金沙縣化竹煤礦復(fù)墾區(qū)試驗(yàn)地概況

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS 21軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植被對(duì)煤礦復(fù)墾區(qū)土壤酶活性的影響

pH在同一土層不同植被中，桃樹(shù)與李樹(shù)間差異不顯著，但均顯著低于杉樹(shù)、柳樹(shù)和對(duì)照，并且杉樹(shù)、柳樹(shù)和對(duì)照三者間無(wú)顯著差異；同一植被下，不同土層除對(duì)照pH無(wú)顯著差異外，其余均表現(xiàn)為隨著土層加深，pH增大，且40～60 cm土層顯著高于0～20 cm（表2）。這可能與農(nóng)田耕作模式有關(guān)系，因?yàn)閷?duì)照農(nóng)田會(huì)作翻耕處理。

脲酶活性在同一土層不同植被中均表現(xiàn)為對(duì)照顯著高于桃樹(shù)、杉樹(shù)、李樹(shù)和柳樹(shù)，桃樹(shù)最低，在0～20 cm和20～40 cm土層中，桃樹(shù)顯著低于杉樹(shù)、李樹(shù)和柳樹(shù)；同一植被不同土層中，脲酶活性均表現(xiàn)為0～20 cm顯著高于20～40 cm和40～60 cm土層，除對(duì)照外，脲酶活性均隨著土層加深而下降（表2）。

過(guò)氧化氫酶在不同土層和不同植被下均無(wú)顯著性差異（表2）。

酸性磷酸酶活性在同一土層不同植被中，各土層的對(duì)照顯著高于桃樹(shù)、杉樹(shù)、李樹(shù)和柳樹(shù)；0～20 cm土層中，桃樹(shù)顯著高于杉樹(shù)、李樹(shù)和柳樹(shù)；20～40 cm土層中，杉樹(shù)和李樹(shù)均顯著高于桃樹(shù)與柳樹(shù)；40～60 cm土層的各植被間差異顯著。酸性磷酸酶活性在同一植被不同土層中，0～20 cm土層顯著高于20～40 cm和40～60 cm土層，除桃樹(shù)外，均表現(xiàn)為隨著土層加深活性下降，且杉樹(shù)和李樹(shù)的各土層間差異顯著（表2）。

轉(zhuǎn)化酶活性在同一土層不同植被下的表現(xiàn)有差異，0～20 cm土層中，桃樹(shù)與柳樹(shù)間無(wú)顯著差異，但二者均顯著高于杉樹(shù)、李樹(shù)和對(duì)照；在20～ 40 cm和40～60 cm土層中，各植被間均存在顯著差異。在同一植被不同土層中，杉樹(shù)、李樹(shù)、柳樹(shù)和對(duì)照均存在顯著差異；桃樹(shù)0～20 cm與40～ 60 cm間無(wú)顯著差異，均顯著高于20～40 cm（表2）。

本研究表明，該煤礦復(fù)墾區(qū)域不同植被對(duì)不同土層脲酶、酸性磷酸酶和轉(zhuǎn)化酶活性的影響不同，對(duì)照相對(duì)較高，可能與人為的耕作模式有關(guān)，但對(duì)過(guò)氧化氫酶的影響均較小。

表2 不同植被、不同土壤深度的土壤酶活性

注：同列不同小寫(xiě)字母表示同一土層不同植間差異顯著（＜0.05）；同列不同大寫(xiě)字母表示同一植被不同土層間差異顯著（＜0.05）。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant differences among different plants in the same soil layer (<0.05); Different capital letters in the same column indicate significant differences among different soil layers of the same plants (<0.05).

2.2 不同植被對(duì)煤礦復(fù)墾區(qū)土壤真菌群落的影響

2.2.1 樣品測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估 本研究采用高通量技術(shù)對(duì)桃樹(shù)、杉樹(shù)、李樹(shù)、柳樹(shù)和對(duì)照5種不同植被下3個(gè)土層深度（0～20、20～40、40～60 cm）的土壤進(jìn)行了土壤真菌群落結(jié)構(gòu)研究，共獲得746 531條raw reads，質(zhì)控后共產(chǎn)生743 367條clean reads，每個(gè)樣品至少產(chǎn)生46 354條clean reads，平均產(chǎn)生49 558條clean reads。優(yōu)化后的序列長(zhǎng)度均占原始數(shù)據(jù)的99%以上，Q20（質(zhì)量值大于等于20的堿基百分）均在99%以上，Q30（質(zhì)量值大于等于30的堿基百分比）為95%以上，滿(mǎn)足試驗(yàn)分析要求（表3）。

樣本測(cè)序數(shù)量達(dá)到5萬(wàn)條時(shí)，曲線(xiàn)趨于平坦，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大，能反映樣品中絕大多數(shù)土壤真菌信息，特征種類(lèi)不會(huì)隨測(cè)序量增加而增長(zhǎng)（圖1，圖2），所以測(cè)序數(shù)據(jù)具有較高的可信度。

在5種不同植被的土壤樣本中，共測(cè)到土壤真菌8門(mén)28綱70目125科201屬259種，還有大量的菌屬于沒(méi)有分類(lèi)的。

表3 真菌測(cè)序結(jié)果

a: 0-20 cm; b: 20-40 cm; c: 40-60 cm.

2.2.2 不同植被對(duì)煤礦復(fù)墾區(qū)土壤真菌群落多樣性的影響 由表4可知，各樣本的覆蓋率均在99%以上，指數(shù)信息能較好地反映真菌群落多樣性。Chao1和Ace指數(shù)用來(lái)衡量物種豐度，即物種數(shù)量的多少。Shannon和Simpson指數(shù)用于衡量物種多樣性，受樣品群落中物種豐度和物種均勻度的影響[11]。Shannon和Chao1指數(shù)越大，說(shuō)明樣品的物種多樣性也高[32]。研究表明，0～20 cm土層中，柳樹(shù)的真菌群落豐富度和多樣性最高，而李樹(shù)最低；20～40 cm土層中各指數(shù)表現(xiàn)不一，可能均勻度差別較大，但除了Chao1指數(shù)外，均為杉樹(shù)中的指數(shù)最高，相對(duì)豐富度和多樣性較高，而桃樹(shù)較低；40～60 cm土層中對(duì)照的Chao1和Ace指數(shù)指數(shù)最大，真菌群落豐富度高，而柳樹(shù)較小，Shannon和Simpson指數(shù)表現(xiàn)為對(duì)照最高，真菌群落多樣性最大，而桃樹(shù)多樣性最?。ū?）?？傮w來(lái)說(shuō)，柳樹(shù)0～20 cm、杉樹(shù)20～40 cm、對(duì)照40～60 cm的土壤真菌群落數(shù)量和多樣性較豐富。

a: 0-20 cm; b: 20-40 cm; c: 40-60 cm.

表4 不同植被真菌群落多樣性分析

2.2.3 不同植被對(duì)煤礦復(fù)墾區(qū)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響 不同植被土壤真菌類(lèi)群中，子囊菌門(mén)（Ascomycota）、擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）、毛霉菌門(mén)（Mucoromycota）（李樹(shù)0～20 cm除外）和未分類(lèi)（Unclassified）為所有樣本都具有的優(yōu)勢(shì)真菌門(mén)類(lèi)（相對(duì)豐度大于1%），這與靳東升等[33]的研究結(jié)果一致。比較不同分類(lèi)水平各真菌群落相對(duì)豐度發(fā)現(xiàn)：不同植被及其各土層的真菌群落組成和分布有差異。其中子囊菌門(mén)的平均豐度最高，依次為李樹(shù)（78.40%）>杉樹(shù)（61.80%）>桃樹(shù)（56.20%）>柳樹(shù)（56.16%）>對(duì)照（53.02%）（圖3），李樹(shù)土壤的平均相對(duì)豐度遠(yuǎn)高于對(duì)照，說(shuō)明李樹(shù)根系分泌物有利于子囊菌門(mén)種群的生存。子囊菌門(mén)多為腐生菌，能夠促進(jìn)動(dòng)植物遺骸的腐爛和分解而被重吸收[34]，對(duì)降解復(fù)雜有機(jī)物起關(guān)鍵作用[35]。毛霉菌門(mén)的平均豐度依次為桃樹(shù)（6.79%）>對(duì)照（6.61%）>杉樹(shù)（6.30%）>柳樹(shù)（4.76%）>李樹(shù)（1.76%）（圖3）。擔(dān)子菌門(mén)的平均豐度依次為桃樹(shù)（6.82%）>李樹(shù)（3.77%）>杉樹(shù)（3.61%）>柳樹(shù)（2.34%）>對(duì)照（2.03%）（圖3）。擔(dān)子菌門(mén)是真菌中高等菌門(mén)，可以與植物形成共生菌根，有利于作物的栽培和造林[36]，分解木質(zhì)素的能力較強(qiáng)。所有土壤樣品中未分類(lèi)的平均豐度僅次于子囊菌門(mén)，依次為對(duì)照（35.82%）>柳樹(shù)（35.12%）>桃樹(shù)（26.25%）>杉樹(shù)（25.88%）>李樹(shù)（14.40%），在對(duì)照（農(nóng)田）中的相對(duì)豐度最高。

a: 0?20 cm; b: 20?40 cm; c: 40?60 cm.

在門(mén)水平上將樣品中的真菌相對(duì)豐度情況聚類(lèi)后繪制熱圖（圖4），結(jié)果顯示，根據(jù)土壤真菌各物種相對(duì)豐度的相似情況分為兩簇：球囊菌門(mén)（Glomeromycota）、捕蟲(chóng)霉門(mén)Zoopagomycota、毛霉門(mén)（Mucoro-m-y-cota）、被孢霉門(mén)（Mortierellomycota）等4個(gè)門(mén)聚為一簇，羅茲菌門(mén)（Rozellomycota）、擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）、子囊菌門(mén)（Ascomycota）、壺菌門(mén)（Chytridiomycota）等聚為另一簇；根據(jù)不同樣品土壤中真菌群落的組成情況聚為兩簇：桃樹(shù)0～20 cm單獨(dú)聚為一簇，而其余樣品聚為另一簇，且同一土層5種不同植被的土壤真菌在門(mén)水平上的群落組成不同，且同一植被不同土層的群落組成也不同。

左側(cè)聚類(lèi)樹(shù)為物種聚類(lèi)樹(shù)，上方聚類(lèi)樹(shù)為樣品聚類(lèi)樹(shù)；a: 0～20 cm; b: 20～40 cm; c: 40～60 cm。

為進(jìn)一步區(qū)分5種植被土壤樣品的差異，對(duì)總相對(duì)豐度排名前10的屬進(jìn)行分析，不同植被真菌群落的豐度情況見(jiàn)圖5。未分類(lèi)（Unclassified）、季也蒙酵母屬（）和芽枝霉屬（）3個(gè)屬均為各植被土壤中的優(yōu)勢(shì)屬，孢霉屬（）僅在柳樹(shù)土壤中不是優(yōu)勢(shì)屬，青霉菌屬（）綠核菌屬（）在李樹(shù)土壤中為優(yōu)勢(shì)屬；盤(pán)菌屬（）在杉樹(shù)土壤中為優(yōu)勢(shì)屬；刺毛四枝孢（）在對(duì)照中為優(yōu)勢(shì)屬。季也蒙酵母屬在桃樹(shù)土壤中的相對(duì)豐度為7.30%～ 44.47%，而在李樹(shù)土壤中為26.76%～65.30%，對(duì)照中為9.71%～19.40%。孢霉屬在桃樹(shù)土壤中相對(duì)豐度為1.91%～25.67%，李樹(shù)中為0.43%～3.76%，對(duì)照中為3.10%～14.01%（圖5）。在0～20 cm和20～40 cm土層中，對(duì)照的未分類(lèi)在屬水平上的相對(duì)豐度大于桃樹(shù)、杉樹(shù)、李樹(shù)和柳樹(shù)，而40～60 cm土層中，對(duì)照小于桃樹(shù)、杉樹(shù)、李樹(shù)和柳樹(shù)。

在屬水平上將相對(duì)豐度排名前100的真菌根據(jù)相對(duì)豐度情況進(jìn)行聚類(lèi)后繪制熱圖（圖6），結(jié)果顯示，根據(jù)樣品中的豐度相似情況將真菌群落聚為兩簇，藍(lán)狀菌屬（）、柄孢殼屬（）綠核菌屬（）等50個(gè)屬聚為一簇，暗球腔菌屬（）、紅曲菌屬（）擲孢酵母屬（）等50個(gè)屬聚為另一簇；不同樣品中真菌的組成情況聚為兩簇，桃樹(shù)0～20 cm、柳樹(shù)0～ 20 cm和對(duì)照40～60 cm聚為一簇，而其余樣品聚為另一簇。

a: 0?20 cm; b: 20?40 cm; c: 40?60 cm.

采用NMDS分析土壤真菌群落組成的相似度，除李樹(shù)外，桃樹(shù)、杉樹(shù)、柳樹(shù)和對(duì)照各土層土壤的真菌群落組成均聚類(lèi)于相同的象限，說(shuō)明同一植被下各土層的真菌組成差異較小，但不同植被的土壤真菌群落組成均位于不同象限內(nèi)，說(shuō)明不同植被下的差異較大（圖7）。

左側(cè)聚類(lèi)樹(shù)為物種聚類(lèi)樹(shù)，上方聚類(lèi)樹(shù)為樣品聚類(lèi)樹(shù)；a: 0～20 cm; b: 20～40 cm; c: 40～60 cm。

圖7 不同樣品真菌群落N(xiāo)MDS分析

3 討論

煤礦區(qū)是當(dāng)今世界陸地生物圈最典型、退化最嚴(yán)重的生態(tài)系統(tǒng)之一[18]。針對(duì)煤礦開(kāi)采遺留的一系列問(wèn)題，根據(jù)礦區(qū)的具體情況，煤礦區(qū)采取采空區(qū)臺(tái)階式開(kāi)挖→回收殘煤→采空區(qū)積水抽排到礦山污水處理池處理→分層次回填（中部用粘土層夯實(shí)防滲）→表層覆土→植樹(shù)種草恢復(fù)植被等一系列治理措施，用于回填的土壤均來(lái)自鄰近農(nóng)田，并采取相同處理。本研究對(duì)回填后覆土（覆土深度60 cm）植樹(shù)區(qū)域，開(kāi)展了桃樹(shù)、杉樹(shù)、李樹(shù)等植被對(duì)復(fù)墾區(qū)土壤酶活性和真菌種群多樣性的影響分析，發(fā)現(xiàn)不同植被的脲酶、酸性磷酸酶和轉(zhuǎn)化酶活性差異顯著，脲酶和酸性磷酸酶活性在對(duì)照土壤中最高，而桃樹(shù)最低，且一般情況下酶活性隨土層加深而降低，具有表聚性，但不同植被和不同土層轉(zhuǎn)化酶活性的變化有差異；土壤pH隨土層加深而增高，均呈酸性。樣本中所含真菌OTU隸屬于8個(gè)門(mén)，共有201屬，優(yōu)勢(shì)真菌種群門(mén)均為子囊菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)、毛霉菌門(mén)，不同植被土壤的優(yōu)勢(shì)屬存在一定差異；不同植被土壤真菌的群落組成差異較大，物種數(shù)量和物種多樣性也有差異。該煤礦廢棄地修復(fù)時(shí)間僅2 a左右，長(zhǎng)期的修復(fù)效果有待進(jìn)一步研究。

脲酶與土壤微生物數(shù)量、有機(jī)質(zhì)含量、全氮和速效氮含量呈正相關(guān)，常用來(lái)表征土壤的氮素狀況；土壤酸性磷酸酶主要來(lái)源于植物根系，其活性可以表征土壤的肥力情況，特別是磷的狀況[37-38]。本研究發(fā)現(xiàn)，各土壤酶活性在0～20 cm土層中普遍高于其余2個(gè)土層，這與曹越等[39]研究認(rèn)為的土壤酶活性具有很強(qiáng)的表聚性結(jié)果一致。其主要原因在于表層土壤透氣性較好，植物殘留物也多位于土壤表層，易形成腐殖質(zhì)，有利于微生物的生長(zhǎng)。但不同植被下，除過(guò)氧化氫酶外，其余幾種土壤酶活性存在顯著差異。脲酶和酸性磷酸酶活性在對(duì)照各土層中均顯著高于桃樹(shù)、杉樹(shù)、李樹(shù)和柳樹(shù)，可能與對(duì)照耕地施用氮肥有一定關(guān)系，二者之間是否能相互促進(jìn)有待進(jìn)一步研究。本研究中桃樹(shù)土壤中的脲酶活性最低，復(fù)墾區(qū)的桃樹(shù)長(zhǎng)勢(shì)較差，病蟲(chóng)害較嚴(yán)重，而李樹(shù)、柳樹(shù)和杉樹(shù)沒(méi)有這種現(xiàn)象。桃樹(shù)的最適生長(zhǎng)pH為6.0～6.5，而復(fù)墾區(qū)桃樹(shù)土壤的pH均低于5.3，說(shuō)明煤礦廢棄地復(fù)墾區(qū)域的土壤不利于桃樹(shù)的生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)化酶活性在不同植被下的差異較大，具體原因有待進(jìn)一步研究。

由于不同植被類(lèi)型輸入到土壤中的有機(jī)物質(zhì)不同，從而影響了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及其多樣性[36, 40]。植物通過(guò)根系向土壤輸入各種次生代謝產(chǎn)物，對(duì)微生物的種類(lèi)、數(shù)量等產(chǎn)生促進(jìn)或抑制作用[13]。微生物群落結(jié)構(gòu)受土壤理化性質(zhì)、季節(jié)變化、海拔、植被類(lèi)型等綜合因素的影響，在相同氣候條件和土壤類(lèi)型下，土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)仍存在差異[41-43]。本研究分析了煤礦復(fù)墾區(qū)域不同植被下土壤真菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)的差異，結(jié)果表明，0～20 cm土層中，對(duì)照的真菌群落多樣性低于桃樹(shù)、柳樹(shù)和杉樹(shù)；40～60 cm土層中的真菌群落多樣性最高。其原因可能是耕地施用大量肥料，而肥料基本施于土壤表層，由于氮含量偏高，反而抑制了真菌生長(zhǎng)。在20～40 cm和40～60 cm土層中，桃樹(shù)土壤中的真菌群落多樣性最低。

5種植被土壤均含有的優(yōu)勢(shì)真菌門(mén)為子囊菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)、毛霉菌門(mén)和未分類(lèi)，與靳東升等[33]的研究結(jié)果一致。不同土壤生境會(huì)對(duì)微生物群落的整體組成產(chǎn)生一定影響，但優(yōu)勢(shì)菌群較為相似[44-45]。陳秀波等[46]、郭雄飛等[47]、沈清清等[48]研究表明，子囊菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)真菌是土壤真菌群落中排在前兩名的優(yōu)勢(shì)菌群，這與本研究結(jié)果相似。本研究中，李樹(shù)、桃樹(shù)、柳樹(shù)和杉樹(shù)土壤中的子囊菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)的平均相對(duì)豐度均大于對(duì)照，且李樹(shù)土壤中的相對(duì)豐度遠(yuǎn)高于對(duì)照，表明李樹(shù)能促進(jìn)土壤中子囊菌門(mén)的生長(zhǎng)。子囊菌門(mén)主要分解植物殘?bào)w，促進(jìn)動(dòng)植物遺骸的腐爛和分解而被重吸收，對(duì)降解復(fù)雜有機(jī)物起關(guān)鍵作用[48-51]；擔(dān)子菌門(mén)可以與植物形成共生菌根，有利于作物的栽培和造林[36]，擔(dān)子菌門(mén)分解木質(zhì)素的能力較強(qiáng)[49-50]；同時(shí)不同的植被類(lèi)型凋落物的養(yǎng)分分解與歸還也不同，凋落物的養(yǎng)分分解與歸還會(huì)改變根際土壤理化性質(zhì)和酶活性進(jìn)而影響真菌群落結(jié)構(gòu)組成及其多樣性[35]。本研究的土樣采自煤礦廢棄地生態(tài)修復(fù)過(guò)程中經(jīng)過(guò)土壤剝離和回填后的樣地，土壤的原始結(jié)構(gòu)已發(fā)生改變，同時(shí)由于耕作模式不同，對(duì)照為耕地，管理比較精細(xì)，在作物種植過(guò)程中會(huì)施以各種肥料，而李樹(shù)、桃樹(shù)、柳樹(shù)、杉樹(shù)等為木本植物，管理比較粗放，沒(méi)有施以任何肥料，加上植物種類(lèi)不同，分泌的化學(xué)物質(zhì)也有差異，導(dǎo)致土壤理化性質(zhì)的差異，以及土壤真菌群落多樣性發(fā)生變化。由于子囊菌門(mén)的適應(yīng)性較廣[52]，試驗(yàn)區(qū)中幾種木本植物的種植年限不長(zhǎng)，土壤中落葉居多，而枝條等含木質(zhì)素的凋落物較少，對(duì)照中作物秸稈的木質(zhì)素含量也偏低，有利于子囊菌門(mén)的生長(zhǎng)和繁殖，致使所有樣地中子囊菌門(mén)平均豐度遠(yuǎn)高于擔(dān)子菌門(mén)，但對(duì)于李樹(shù)土壤樣品中的子囊菌門(mén)平均豐度最高的原因有待于進(jìn)一步研究。

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Effects of Different Vegetation on Soil Fungal Diversity and Enzyme Activity in the Reclamation Area of Coal Mine Wasteland

YOU Ping1,2, XIAO Qunying1,2, XUE Xiaohui1,2, LIU Xian1,2, DAI Zhidong3

1. School of Ecological Engineering, Guizhou University of Engineering Science, Bijie, Guizhou 551700, China; 2. Guizhou Province Key Laboratory of Ecological Protection and Restoration of Typical Plateau Wetlands, Bijie, Guizhou 551700, China; 3.Guizhou Kangteng Energy Group Co., Ltd, Jinsha, Guizhou 551800, China

In order to evaluate the effect of different vegetation on soil ecological restoration in reclaimed areas of coal mine wasteland, the effects ofL, Taxodiaceae Warming andLon soil enzyme activity and fungal population diversity in reclaimed areas were analyzed. The activity of urease, acid phosphatase and invertase was significantly different in different vegetation. Urease activity was the highest in the control and the lowest inLAcid phosphatase activity was the highest in the control, and the lowest in Taxodiaceae Warming (0?20, 40?60 cm) andL. (20?40 cm), and the enzyme activity generally decreased with the deepening of soil layer, showing surface aggregation, but the changes of invertase activity in different vegetation and different soil layers were different. pH of soil in this area increased with the depth of soil layer, the highest was 5.67, all were acidic, and all showed some differences except the control. Under different treatments,were the dominant phylum.andwere the dominant genus in all soil fungi populations.was the dominant genus, only not inandwere the dominant genera inLwas the dominant genus in Taxodiaceae Warmingwas the dominant genus in the control. However,Non-metric multidimensional scaling (NMDS) analysis showed that the community composition of soil fungi in different vegetation was quite different, and the species number and diversity of 0?20cm soil in, 20?40 cm soil in Taxodiaceae Warming and 40?60cm soilin the control were rich, while the species richness and diversity inL.were relatively low. The results of this study could provide some reference for the study of the soil ecological restoration in other coal mine reclamation areas.

coal mine wasteland; high-throughput sequencing; fungus; diversity; community composition; soil enzyme

S154.3

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.10.024

2021-12-09；

2022-03-07

貴州省教育廳項(xiàng)目（黔教合KY字[2020]066，黔教合KY字[2020]147）；貴州省科技廳項(xiàng)目（黔科合平臺(tái)人才[2020]2002）。

游 萍（1976—），女，碩士，副教授，研究方向：土壤微生物。E-mail：1037889542@qq.com。