張迎輝，凡莉莉，杜溶訖，謝德金，楊旺利，陳禮光，鄭郁善*

31種石斛屬植物及金石斛遺傳多樣性SRAP分析及DNA指紋圖譜研究

張迎輝1，凡莉莉2，杜溶訖2，謝德金2，楊旺利3，陳禮光2，鄭郁善2*

1. 福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術學院，福建福州 350007；2. 福建農(nóng)林大學林學院，福建福州 350002；3. 福安市林業(yè)局，福建福安 355000

石斛屬（Sw.）為蘭科（Orchidaceae）蘭亞科（Subfam. Orchidoideae）植物，在我國有著廣泛的分布與應用，多用于名貴中藥材和觀賞植物，具有較高的經(jīng)濟價值。由于苛刻的生長條件加上過度的開發(fā)利用，導致野生石斛資源破壞嚴重，大部分種類已近枯竭，這也導致市場上出現(xiàn)的石斛種質(zhì)混雜、真?zhèn)舞b定困難等問題亟待解決。石斛屬植物遺傳多樣性的研究和數(shù)字指紋圖譜的建立，可以為石斛的品種鑒定與分類、良種選擇與保護提供理論依據(jù)，對保護藥用植物生物多樣性也具有十分重要的意義。以31種石斛屬植物及金石斛（）為研究對象，應用SRAP-PCR分子標記技術對其開展遺傳多樣性分析并構建DNA指紋圖譜。結果表明：利用篩選出來的15對引物進行擴增，共擴增出264個位點，其中多態(tài)性位點為251個，平均每對引物擴增出16.73個多態(tài)性位點，多態(tài)比率達95.08%，其中Me2-Em5、Me4-Em3、Me4-Em5、Me7-Em3、Me7-Ee7等5對引物的多態(tài)百分率均為100%，這些引物組合對石斛種類的鑒別效率較高；經(jīng)過計算31種石斛屬植物與金石斛間的觀測等位基因數(shù)（a）為1.784，有效等位基因數(shù)（e）為1.430，Nei’s基因多樣性指數(shù)（）為0.202，Shannon’s信息指數(shù)（）為0.386，石斛種間存在較高的遺傳變異度與豐富的遺傳多樣性水平；其遺傳相似系數(shù)的變化范圍為0.591～0.851，親緣關系較近，當遺傳相似性系數(shù)為0.660時，金石斛單獨聚為一類，當遺傳相似性系數(shù)為0.724時，可將31個石斛屬植物進一步分為10組；構建DNA指紋圖譜可單獨鑒別出31種石斛屬植物以及金石斛，為石斛遺傳背景分析和快速鑒別石斛種類提供科學依據(jù)。

石斛屬；SRAP標記；遺傳多樣性；DNA指紋圖譜

石斛屬（）為蘭科（Orchidaceae）植物最大的屬之一，約含1000個種，其中我國分布有74個種，2個變種[1]。雖然我國石斛屬資源在世界上的占有率較低，但因其具有較高的觀賞價值[2-3]和藥用價值[4-5]，在資源開發(fā)與利用方面一直走在前沿。石斛作為傳統(tǒng)珍貴中藥材，在我國已有2000多年的使用歷史。石斛是典型的多基源藥材，《中國藥典》中收載的石斛來源為蘭科植物金釵石斛（）、霍山石斛（）、鼓槌石斛（）或流蘇石斛（）的栽培種及其同屬植物近似種和鐵皮石斛（）的莖[6]。但由于資源缺乏，目前我國商品流通的藥用石斛植物來源有近40種，因此石斛屬植物種質(zhì)混雜、真?zhèn)舞b定困難等問題亟待解決。DNA分子標記技術具有操作簡單、多態(tài)性和重復性好等優(yōu)點，已被廣泛應用于石斛親緣關系鑒別、基因庫構建、指紋圖譜庫等領域[7-10]。崔學強等[11]采用iPBS分子標記技術分析并構建48份石斛蘭種質(zhì)資源DNA指紋圖譜，且利用2對引物可單獨進行鑒別。宋爽等[12]利用ISSR和AFLP兩種分子標記方法分析了石斛種質(zhì)資源的遺傳多樣性，均能有效地將研究材料進行鑒別。蔡莉等[13]對15份金釵石斛栽培種樣品運用SRAP分子標記法檢測其遺傳多樣性，認為SRAP分子標記法能有效地反映金釵石斛栽培種的遺傳多樣性。樊洪泓等[14]利用SRAP和RAPD兩種分子標記技術對9份石斛種質(zhì)進行遺傳多樣性研究，發(fā)現(xiàn)SRAP標記在石斛的遺傳多樣性與親緣關系的研究中表現(xiàn)出了極大的優(yōu)越性。本研究以31種石斛屬植物及金石斛為試驗材料，應用SRAP-PCR分子標記技術對其開展遺傳多樣性分析并構建DNA指紋圖譜，將為石斛的品種鑒定與分類提供理論和技術依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的32種石斛樣品采自福建省福安旺盛經(jīng)濟林研究所石斛種質(zhì)資源圃（表1）。每種石斛取樣7～10株，每株3～5片嫩葉，混合后裝入自封袋中，用變色硅膠（硅膠與葉片體積比例至少10∶1）迅速干燥放入冰盒中，將干燥的樣品快速帶回實驗室，置于–80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 供試材料

1.2 方法

1.2.1 石斛總DNA的提取 石斛總DNA采用鄭云柯等[15]的改良CTAB法提取，具體如下：取0.1 g嫩葉放入液氮中研磨粉碎并干燥至略發(fā)白色；將粉碎的樣品粉末放入2 mL的離心管中，立即添加預熱的CTAB緩沖液750 μL，16 μL的25 mg/mL R Nase A，65℃水浴50 min，期間輕微顛倒混勻離心管4～6次；取出離心管放至冷卻后加入等體積氯仿-異戊醇（24∶1）混合液，輕微顛倒混勻，并靜放3 min分層；將混合物于12 000 r/min，4℃中離心12 min；取上清液加800 μL無水乙醇（預冷）輕微充分顛倒混勻，直到有大量白色絮狀物析出，放入–20℃冰箱中保存20 min；將離心管于12 000 r/min，4℃中離心5 min，倒出液體后，加入75%乙醇（預冷）清洗2次（12 000 r/min，4℃中離心3 min），室溫晾干；加入100 μL已滅菌的ddH2O溶解，將含有DNA的離心管放入–20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SRAP-PCR反應體系 PCR反應體系采用前期研究結果[16]：Mg2+2.5 mmol/L，dNTPs 0.25 mmol/L，DNA聚合酶1.25 U，引物0.4 μmol/L，模板DNA 30 ng，10×PCR buffer 2.5 μL，其余的用滅菌的ddH2O補齊，形成共25 μL的擴增體系。PCR反應程序：94℃預變性5 min，94℃變性1 min，36℃復性1 min，72℃延伸1 min，5次循環(huán)，94℃變性1 min，根據(jù)不同引物的不同退火溫度復性1 min，72℃延伸1 min，30次循環(huán)，最終72℃延伸7 min，保存于4℃恒溫中。SRAP引物序列見表2。

表2 SRAP引物序列

Tab.2 Primers used in SRAP molecular markers

1.3 數(shù)據(jù)處理

依據(jù)常青等[17]的數(shù)據(jù)分析方法對電泳圖譜進行人工讀帶，同一位點有條帶出現(xiàn)的賦值為“1”，無條帶出現(xiàn)的賦值為“0”，將數(shù)據(jù)輸入Excel表格中制成0-1二元矩陣。使用NTSYS Version 2.1軟件，結合POPGENE Version 1.32軟件計算遺傳距離與遺傳相似性系數(shù)，運用非加權組平均法（UPGMA）進行聚類分析，建立聚類圖。

2 結果與分析

2.1 引物擴增多態(tài)性及遺傳多樣性分析

用篩選出來的15對引物對31種石斛屬植物及金石斛進行擴增（圖1），共擴增出264個位點，其中多態(tài)性位點為251個，平均每對引物擴增出16.73個多態(tài)性位點，多態(tài)率達到95.08%（表3）。31種石斛與金石斛的觀測等位基因數(shù)（a）、有效等位基因數(shù)（e）、Nei’s基因多樣性指數(shù)（）、Shannon’s信息指數(shù)（）分別為1.784、1.430、0.202、0.386，證明石斛種間存在較高的遺傳變異度與豐富的遺傳多樣性水平。在15對引物組合中，Me2-Em5，Me4-Em3，Me4-Em5，Me7-Em3，Me7-Ee7的多態(tài)百分率均為100%，說明這些引物組合對石斛種類的鑒別效率較高，并且SRAP分子標記方法能很好地應用于石斛種類的遺傳多樣性研究中。

表3 SRAP引物序列及其擴增結果

Tab.3 Sequences and amplification results of SRAP primers

圖1 E7M7凝膠成像圖

2.2 聚類分析

為了確定石斛種間的遺傳關系，將統(tǒng)計好的石斛SRAP-PCR反應數(shù)據(jù)錄入NTSYS Version 2.1軟件中進行聚類分析（UPMGA），建立遺傳關系聚類圖（圖2）。31種石斛屬植物及金石斛的遺傳距離范圍為0.138～0.522，均值為0.317，遺傳相似性的變化范圍為0.591～0.851，均值是0.733，說明31種石斛屬植物及金石斛的品種間存在一定的遺傳變異。從圖2可以看出，當遺傳相似性系數(shù)為0.660時，31個石斛屬植物聚為一類，記為Ⅰ類；金石斛單獨聚為一類記為Ⅱ類，表明其遺傳基礎與石斛屬植物存在著較大的差異。當遺傳相似性系數(shù)為0.724時，Ⅰ類中的31個石斛屬植物又可再分為10組，分別記為A、B、C、D、E、F、G、H、I、J，其中A組為海南石斛、少花石斛；B組為長蘇石斛、束花石斛、小雙花石斛、美花石斛、竹枝石斛、疏花石斛、曲軸石斛、尖刀唇石斛、喇叭唇石斛、金釵石斛、鐵皮石斛、霍山石斛、細葉石斛、短棒石斛、杓唇石斛；C組為鼓槌石斛、聚石斛、小黃花石斛；D組為羅河石斛和黃花石斛；E組為劍葉石斛；F組為反瓣石斛；G組為矮石斛、長距石斛；H、I、J組分別為叉唇石斛、鉤狀石斛和景洪石斛。

圖2 31種石斛屬植物及金石斛基于SRAP的遺傳相似性聚類分析

2.3 DNA指紋圖譜構建

據(jù)引物品種鑒別率公式對15個引物組合進行鑒別結果統(tǒng)計，其中引物組合Me1-Em3、Me3-Em3、Me1-Em6均能將31種石斛及金石斛完全鑒別出來，而其他引物組合鑒別率則在68.75%～93.75%之間，未達到完全鑒別。利用引物Me1-Em3構建石斛種類的DNA數(shù)字指紋圖譜（圖3），其中黑色表示該位點有條帶，即該位點0-1矩陣中為“1”，無色表示該位點無條帶，即該位點在0-1矩陣中為“0”。構建的指紋圖譜可以為石斛遺傳背景分析和種類鑒定提供依據(jù)。

3 討論

分子標記技術已廣泛應用于石斛類植物的研究中。劉玲等[18]采用TRAP分子標記技術，篩選出7對引物可將6個鐵皮石斛野生居群以及雜交后代進行鑒別。付濤等[19]開發(fā)鐵皮石斛EST-SSR分子標記方法，設計的43對引物能夠擴增出多態(tài)性條帶。肖文芳等[20]采用P-M13-SSR分子標記技術將29份石斛蘭劃分為6個類群，并利用3對引物獲得29份石斛蘭種質(zhì)獨有、可辨的分子身份證。SRAP標記方法是由美國加州大學蔬菜作物系的LI等[21]創(chuàng)立的一種新型的分子標記方法，該方法的基礎雖然也是依靠PCR技術，但其克服了成本高昂、技術繁雜、重復性差等缺點，兼具了簡單、可靠、中等信息量和易于對相應片段測序等優(yōu)點[22]，作為理想的分子標記技術在植物遺傳多樣性分析[23-26]、種質(zhì)鑒定[27-29]等方面得到廣泛應用。

圖3 31種石斛屬植物及金石斛DNA指紋圖譜

楊貞等[30]利用SRAP分子標記法從13份鐵皮石斛種質(zhì)中擴增出的多態(tài)性條帶為96.75%，遺傳相似系數(shù)為0.44～0.79，并根據(jù)親緣關系劃分為3個類群。林榕燕等[31]從48份石斛蘭種質(zhì)擴增出的多態(tài)性條帶高達97.48%，多態(tài)性信息含量為0.718～0.903，石遺傳距離為0.15～0.97，并將48個石斛蘭品種分為7大聚類群。朱勝男等[2]采用RAPD分子標記技術對31種石斛屬植物進行了遺傳多樣性分析，根據(jù)聚類圖結果可以有效地將32個石斛屬植物區(qū)分開。崔學強等[11]利用iPBS標記對麝香石斛（）等18份石斛蘭原生種以及30份石斛蘭商品種構建的DNA指紋圖譜可區(qū)分出這48份石斛蘭種質(zhì)資源。本研究采用SRAP分子標記技術對31份石斛屬植物原生種以及金石斛開展研究，利用篩選出來的15對引物進行擴增，共擴增出264個位點，其中多態(tài)性位點為251個，多態(tài)率達到95.08%，其中5對引物的多態(tài)百分率達到100%，表明這些石斛屬品種的遺傳豐富度較高，遺傳范圍較為廣泛。遺傳距離與遺傳相似性系數(shù)是衡量個體間相似程度的重要指標，31種石斛屬植物及金石斛的遺傳距離范圍為0.138～0.522，表明品種間存在豐富的遺傳多樣性，遺傳相似系數(shù)的變化范圍為0.591～0.851，說明31種石斛及金石斛的親緣關系較近，其中石斛屬植物間羅河石斛與黃花石斛的親緣關系最近，景洪石斛與金石斛的親緣關系最遠。在聚類分析中金石斛單獨聚為一類，剩余的31種石斛屬聚為一大類，表明SRAP可有效鑒別出石斛屬植物。當遺傳相似性系數(shù)為0.724時，可將31個石斛屬植物為10組，這與植物志中石斛屬的分類較為符合。

構建DNA指紋圖譜已成為植物品種鑒定的有效方法之一，利用分子標記技術構建石斛蘭DNA指紋圖譜有少量報道，其中關鍵是篩選出可鑒別供試材料的引物[2, 18, 20]。本研究篩選的15對引物組合均能鑒別31個石斛屬植物及金石斛，應用引物Me1-Em3構建出的DNA指紋圖譜，能為石斛的分子鑒別提供參考。

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SRAP Analysis and DNA Fingerprinting of Genetic Diversity of 31 Species ofand

ZHANG Yinghui1, FAN Lili2, DU Rongqi2, XIE Dejin2, YANG Wangli3, CHEN Liguang2, ZHENG Yushan2*

1.Fujian Vocational College of Agriculture, Fuzhou, Fujian 350007, China; 2. College of Forestry, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China; 3. Forestry Bureau of Fu’an City, Fu’an, Fujian 355000, China

Sw. belongs to the Orchidaceae (Subfam. Orchidoideae), which has a wide distribution and application in China. Most are precious Chinese medicinal materials and ornamental plants with high economic values. Due to harsh growth conditions and excessive development and utilization, wildresources have been severely damaged, and most species have been nearly depleted, which also lead to problems such as mixed germplasm ofin the market and difficulties in authenticity identification. The research on the genetic diversity ofplants and the establishment of digital fingerprints can provide a theoretical basis for the identification and classification ofspecies, the selection, and protection of fine varieties, and it is also of great significance to protect the biodiversity ofresources. Taking 31 species ofandas the research objects, the genetic diversity was analyzed by the SRAP-PCR molecular marker technology and DNA fingerprints were constructed. 15 pairs of primers were used for amplification, and a total of 264 loci were amplified, including 251 polymorphic loci, and an average of 16.73 polymorphic loci with a 95.08% ratio were amplified for each pair of primers. The polymorphism percentage of 5 pairs of primers including Me2-Em5, Me4-Em3, Me4-Em5, Me7-Em3, Me7-Ee7 was 100%, and the primer combinations had higher identification efficiency forspecies. After calculation, the number of observed alleles (a) between 31 species ofandwas 1.784, the number of effective alleles (e) was 1.430, the Nei’s gene diversity index () was 0.202, and Shannon’s information index () was 0.386, which showed there was a high degree of genetic variability and rich genetic diversity amongspecies. The variation range of the genetic similarity coefficient was 0.591–0.851, and the genetic relationship was relatively close. When the genetic similarity coefficient was 0.66,could be clustered into one group. When the genetic similarity coefficient was 0.724, 31species could be divided into 10 groups. The DNA fingerprints constructed by three pairs of primers, including Me1-Em3, Me3-Em3, and Me1-Em6, could identify 31 species ofandindependently, providing a scientific basis for the analysis of the genetic background and the rapid identification ofspecies.

; SRAP markers; genetic diversity; DNA fingerprint

S567.239

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.10.008

2022-02-16；

2022-03-22

福建省科技創(chuàng)新平臺項目（No. 2008Y2001）；福建農(nóng)林大學科技創(chuàng)新專項基金項目（No. CXZX2016043）。

張迎輝（1979—），女，博士，副教授，研究方向：園林植物栽培與應用。*通信作者（Corresponding author）：鄭郁善（ZHENG Yushan），E-mail：zys1960@163.com。