何美翠 張春然,* 黃清東 王宇馳 王瑛瑛 于瑤 張靜霞 李知儀 趙歡 唐克慧

(1 抗生素研究與再評(píng)價(jià)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川抗菌素工業(yè)研究所，藥學(xué)院，成都大學(xué)，成都 610106；2 四川百特文理科技有限公司，成都 611731)

醋酸來法莫林(lefamulin acetate)為來法莫林的原料藥，化學(xué)名為14-O-{[(1R,2R,4R)-4-氨基-2-羥基環(huán)己基硫烷基]乙酰基}-截短側(cè)耳素乙酸鹽[1](圖1)是第一個(gè)系統(tǒng)性給藥的截短側(cè)耳素類抗生素，為Nabriva公司開發(fā)研制。2019年8月19日成功在美國獲批，后又相繼在歐盟和加拿大獲批，用于治療成人社區(qū)獲得性細(xì)菌性肺炎(CABP)[2]。商品名：Xenleta?，作為近20年來FDA批準(zhǔn)的第一款具有獨(dú)特作用機(jī)制的抗生素，其同時(shí)擁有兩種劑型(靜脈注射和口服)，在常見和難治性感染均具潛在療效，未來具有廣闊的應(yīng)用空間[3]。醋酸來法莫林作為截短側(cè)耳素藥物具有獨(dú)特的作用機(jī)制，與當(dāng)前抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成的抗生素均不易產(chǎn)生交叉耐藥性，因而在治療社區(qū)獲得性細(xì)菌性肺炎具有不可替代的作用。目前，各國藥典及標(biāo)準(zhǔn)均未收載該藥與其制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)醋酸來法莫林有關(guān)物質(zhì)檢測的方法未見文獻(xiàn)報(bào)道。本文參考截短側(cè)耳素類藥物的分析方法，建立了適用于醋酸來法莫林有關(guān)物質(zhì)測定的高效液相色譜法。

圖1 醋酸來法莫林的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of lefamulin acetate

1 儀器與試藥

Shimadzu LC-20AB高效液相色譜儀；Agilent 1200 Serial液相色譜儀；島津UV-2450紫外分光光度計(jì)；Sartorius BP211D型天平。

醋酸來法莫林粗品(批號(hào)：20200527)、樣品(批號(hào)：20200915、20200929、20201029)；起始原料Ⅰ(截短側(cè)耳素)，起始原料Ⅱ((R)-3環(huán)己烯甲酸)；中間體Ⅰ(S-((1R,2R,4R)-2-hydroxy-4-(2,2,2-trifluoroacetamido)cyclohexyl)benzothioate)，中間體Ⅱ(來法莫林)；試劑(硫代苯甲酸)。以上試藥試劑均由四川百特文理科技有限公司提供；乙腈為HPLC級(jí)(美國Fisher)；水為純凈水(娃哈哈)；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：中譜紅PR-C18色譜柱(25 cm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相A：60 mmol/L磷酸二氫鉀溶液(磷酸調(diào)pH至2.5)-乙腈(80:20，V/V)，流動(dòng)相B：60 mmol/L磷酸二氫鉀溶液(磷酸調(diào)pH至2.5)-乙腈(50:50，V/V)，梯度洗脫(表1)，流速1 mL/min，檢測波長為210 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣體積為20 μL。

表1 梯度程序Tab.1 Gradient elution program

2.2 溶液配制

溶劑：乙腈:水(2:8，V/V)

供試品溶液：取醋酸來法莫林適量，精密稱定，加溶劑溶解并稀釋制成每1 mL中約含5 mg的溶液。

對(duì)照溶液：精密量取供試品溶液適量，加溶劑稀釋制成每1 mL中含50 μg的溶液。

系統(tǒng)適用性溶液：精密稱取醋酸來法莫林和起始原料Ⅱ各適量，加溶劑溶解并稀釋制成每1 mL中各約含0.5 mg的溶液。

靈敏度溶液：取系統(tǒng)適用性溶液適量，加溶劑稀釋制成每1 mL中各約含2.5 μg的溶液。

2.3 有關(guān)物質(zhì)測定

系統(tǒng)適用性要求：系統(tǒng)適用性溶液色譜圖(圖2)中，理論板數(shù)按來法莫林峰計(jì)算不得低于5000，來法莫林峰與起始原料Ⅱ的分離度大于1.5。靈敏度溶液色譜圖(圖2)中，主成分峰高的信噪比應(yīng)不低于10。

測定法：以“2.1”項(xiàng)下的液相色譜方法，按“2.2”項(xiàng)配制供試品溶液和對(duì)照溶液，精密量取對(duì)照溶液20 μL注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的10%～20%；再精密量取供試品溶液和對(duì)照溶液各20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品溶液的液相色譜圖(圖2)中如顯示雜質(zhì)峰，均按不加校正因子的主成分自身對(duì)照法進(jìn)行計(jì)算。

圖2 醋酸來法莫林有關(guān)物質(zhì)測定相關(guān)HPLC圖Fig.2 Related HPLC chart for determination of related substances in lefamulin acetate

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 專屬性考察

(1)與原料、中間體、試劑的分離情況

取醋酸來法莫林樣品(批號(hào)：20200915，方法學(xué)驗(yàn)證均用該批次)適量，再加入適量起始原料、中間體、試劑，加20%乙腈(起始原料或中間體溶解度差時(shí)可加乙腈溶解后，再加20%乙腈稀釋至刻度)溶解并稀釋制成每1 mL中約含5 mg醋酸來法莫林、25 μg來法莫林、10 μg中間體Ⅰ、5 μg硫代苯甲酸、25 μg(R)-3環(huán)己烯甲酸、50 μg的截短側(cè)耳素的混合溶液。

(2)與降解雜質(zhì)的分離情況

酸破壞：精密稱取醋酸來法莫林25 mg于5 mL容量瓶中，以1 mL 4 mol/L HCl溶液水浴60℃條件下破壞樣品1 h，于該酸破壞溶液加入1 mL 4 mol/L NaOH溶液中和，用1 mL乙腈溶解樣品，再以20%乙腈稀釋至刻度。

堿破壞：精密稱取醋酸來法莫林25 mg于5 mL容量瓶中，以1 mL 1mol/L NaOH溶液水浴60℃條件下破壞樣品1 h，于該堿破壞溶液加入1 mL 1 mol/L HCl溶液中和，加1 mL乙腈溶解樣品，再以20%乙腈稀釋至刻度。

氧化破壞：精密稱取醋酸來法莫林25 mg于5 mL容量瓶中，以1 mL 3% H2O2溶液于室溫下破壞樣品30 min，再以20%乙腈稀釋至刻度。

高溫破壞：取醋酸來法莫林適量，在高溫(120℃)條件下放置4 h，取出后于干燥器中冷卻至室溫，精密稱取樣品適量，制成5 mg/mL的溶液。

高濕破壞：取醋酸來法莫林適量，于高濕環(huán)境(25℃，相對(duì)濕度(RH)為75%±5%)中放置10 d，精密稱取樣品適量，制成5 mg/mL的溶液。

光照破壞：取醋酸來法莫林樣品適量，于ChP2020四部通則9001規(guī)定的光照強(qiáng)度(4500±500 Lx)下放置10 d，精密稱取樣品適量，制成5 mg/mL的溶液。

精密量取醋酸來法莫林供試品溶液以及上述6種破壞溶液各20 μL，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣檢測并記錄色譜圖。相應(yīng)圖譜見圖3，由試驗(yàn)結(jié)果可知，醋酸來法莫林于光照破壞、高濕破壞條件下較穩(wěn)定，而在其余4種破壞條件下均會(huì)發(fā)生降解，其中氧化降解產(chǎn)生兩個(gè)雜質(zhì)(氧化降解雜質(zhì)A和氧化降解雜質(zhì)B，以下稱雜質(zhì)A和雜質(zhì)B)，在上述的色譜條件下，起始原料、中間體及各降解產(chǎn)物均能與醋酸來法莫林主峰完全分離，證明所建方法專屬性強(qiáng)。

圖3 專屬性試驗(yàn)HPLC色譜圖Fig.3 The HPLC chromatogram of specificity test

2.4.2 線性

精密稱取醋酸來法莫林樣品適量于10 mL容量瓶，加20%乙腈溶解并稀釋制成每1 mL約含5 mg的儲(chǔ)備液。精密量取醋酸來法莫林儲(chǔ)備液適量分別制成濃度為0.50、1.00、5.02、12.56、25.11、50.22和75.33 μg/mL的醋酸來法莫林溶液，按“2.1”項(xiàng)下液相色譜條件進(jìn)樣分析并記錄譜圖。以主峰峰面積(y)對(duì)醋酸來法莫林濃度(x)進(jìn)行線性回歸，回歸方程：y=2113.4x-173.23，R2(相關(guān)系數(shù))為1.000。由結(jié)果可知，醋酸來法莫林在0.50～75.33 μg/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積呈較好的線性關(guān)系。

2.4.3 檢測限和定量限

取醋酸來法莫林線性溶液逐步稀釋，根據(jù)島津LC solution QAQC計(jì)算操作步驟來計(jì)算信噪比(S/N)，以信噪比S/N=15.62對(duì)應(yīng)的醋酸來法莫林濃度0.50 μg/mL為定量限，以信噪比S/N=7.73對(duì)應(yīng)的醋酸來法莫林濃度0.20 μg/mL為檢測限。

2.4.4 供試品溶液的穩(wěn)定性試驗(yàn)

取醋酸來法莫林一定量，按“2.2”項(xiàng)制備供試品溶液，于室溫放置0、1、2、4、6、8、10、12和24 h，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測并記錄譜圖，供試溶液主峰峰面積RSD(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差)值為0.31%，雜質(zhì)A的RSD為0，雜質(zhì)B含量的RSD值為1.44%，總雜質(zhì)含量的RSD值為1.86%，表明醋酸來法莫林溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取醋酸來法莫林樣品6份，依照“2.2”項(xiàng)制備溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測并記錄譜圖，以醋酸來法莫林樣品中雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、最大單個(gè)未知雜質(zhì)及總雜質(zhì)的含量考察方法的精密度，雜質(zhì)A的RSD值為0，雜質(zhì)B的RSD值為1.74%，最大單個(gè)未知雜質(zhì)的RSD值為0，總雜質(zhì)的RSD值為1.39%。

2.4.6 中間精密度

以同一批醋酸來法莫林樣品，按照“2.2”項(xiàng)制備溶液，在不同時(shí)間由不同分析人員分別在Shimadzu LC-20AB和Agilent 1200 Series儀器上按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣檢測，以醋酸來法莫林樣品中的雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、最大單個(gè)未知雜質(zhì)及總雜質(zhì)含量考察方法的中間精密度，雜質(zhì)A的RSD值為0，雜質(zhì)B的RSD值為1.99%，最大單個(gè)未知雜質(zhì)RSD值為0，總雜質(zhì)RSD值為1.47%。結(jié)果證明所建方法精密度較好。

2.4.7 耐用性試驗(yàn)

依照“2.2”項(xiàng)制備醋酸來法莫林供試品及對(duì)照溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣檢測，分別考察流速、柱溫、波長等條件有微小變化時(shí)，醋酸來法莫林的色譜行為，結(jié)果見表2。由表可知，樣品測定條件有小的變動(dòng)時(shí)，各項(xiàng)測定結(jié)果、雜質(zhì)檢出個(gè)數(shù)相同，證明所建方法耐用性較好。

表2 耐用性試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Durability test results

2.5 有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果

按照“2.2”項(xiàng)制備醋酸來法莫林供試品及其對(duì)照溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析，對(duì)3批醋酸來法莫林樣品有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行檢查，檢查結(jié)果見表3。根據(jù)結(jié)果可知，3批醋酸來法莫林樣品的雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、最大單個(gè)未知雜質(zhì)含量、總雜質(zhì)含量差別不大。

表3 醋酸來法莫林有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果Tab.3 Test results of related substances of lefamulin acetate

3 討論

3.1 色譜條件的選擇與確定

洗脫程序的確定：參考截短側(cè)耳素類藥物的分析方法[4]，以磷酸鹽-乙腈為流動(dòng)相，等度洗脫，雜質(zhì)與主峰未能分開；梯度洗脫，雜質(zhì)與主峰能有效分離，調(diào)節(jié)梯度程序使各雜質(zhì)與主成分的分離度提高。水相的確定：①磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉、②磷酸氫二鉀與磷酸二氫鉀、③磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀、④磷酸二氫鉀、⑤磷酸氫二鈉、⑥0.1%磷酸、⑦0.1%TFA(三氟乙酸)、⑧0.1%甲酸，發(fā)現(xiàn)水相中的鹽離子可以使主峰的峰形收斂，不同的緩沖鹽作為水相，檢出雜質(zhì)個(gè)數(shù)、相鄰雜質(zhì)之間的分離度均相差不大，使用鉀鹽比鈉鹽的基線平穩(wěn)。綜合考慮后，選用磷酸二氫鉀作為緩沖鹽。

3.2 檢測波長的選擇

取醋酸來法莫林粗品(批號(hào)：20200527)適量，精密稱定，以水為稀釋劑，制成1 mg/mL的溶液，在200～800 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果顯示，醋酸來法莫林在203和244 nm處有最大吸收峰，在400～800 nm波長范圍內(nèi)無吸收。由于醋酸來法莫林樣品243 nm波長處的吸收較小，雜質(zhì)檢出數(shù)目少；將檢測波長改為210 nm時(shí)的吸收增大，且210 nm波長下檢出的雜質(zhì)較多，故我們初步將210 nm作為檢測波長。采用二極管陣列檢測器，對(duì)樣品、破壞樣品進(jìn)行全波長掃描，所得圖譜見圖4；結(jié)果顯示，在210 nm波長處，主峰、雜質(zhì)峰的純度因子均大于計(jì)算的閾值，表明各峰均為單峰，同時(shí)，在其他波長處未顯示新的吸收峰，說明無雜質(zhì)漏檢。因此，選定能檢出雜質(zhì)最多、主峰和雜質(zhì)峰均有較大吸收的210 nm作為檢測波長。

圖4 醋酸來法莫林的二極管陣列掃描圖Fig.4 The diode array scannogram of lefamulin acetate

3.3 磷酸二氫鉀溶液pH的選擇

流動(dòng)相中磷酸二氫鉀溶液的pH為2.0、2.5、3.0、4.5和5.5，考察磷酸二氫鉀溶液pH的變化對(duì)醋酸來法莫林(批號(hào)：20200527)主峰保留時(shí)間、主峰理論板數(shù)、主峰與鄰近雜質(zhì)峰分離度及雜質(zhì)檢出個(gè)數(shù)的影響。結(jié)果表明：pH5.5時(shí)，基線漂移嚴(yán)重。pH在2.0至4.5范圍內(nèi)隨著緩沖鹽pH值增加，檢出雜質(zhì)個(gè)數(shù)由8個(gè)變?yōu)?個(gè)，而主峰柱效、拖尾因子、主峰與鄰近雜質(zhì)峰之間的分離度均差異不大。綜合考慮后選擇pH為2.5。

3.4 磷酸二氫鉀溶液濃度的選擇

流動(dòng)相中磷酸二氫鉀的濃度分別為10、25、50、60、68和75 mmol/L，考察磷酸二氫鉀濃度的變化對(duì)醋酸來法莫林(批號(hào)：20200527)主峰保留時(shí)間、主峰理論塔板數(shù)、拖尾因子及主峰與相鄰雜質(zhì)峰分離度的影響。結(jié)果表明，隨著磷酸二氫鉀溶液濃度的增加，拖尾因子降低，理論塔板數(shù)升高、主峰與相鄰雜質(zhì)峰分離度增加。當(dāng)流動(dòng)相中緩沖鹽濃度達(dá)到60 mmol/L時(shí)，繼續(xù)增加磷酸二氫鉀溶液濃度，雖主峰理論板數(shù)稍有增加，但拖尾因子、主峰與鄰近雜質(zhì)峰分離度兩個(gè)指標(biāo)變化不大。綜合考慮，將緩沖鹽濃度定為60 mmol/L。

3.5 進(jìn)樣濃度的選擇

取醋酸來法莫林(批號(hào)：20200527)適量，分別配制成濃度為1.0、2.5、5.0、6.0、7.0、8.0和10.0 mg/mL的溶液，同法進(jìn)樣分析。結(jié)果顯示，溶液濃度為5 mg/mL時(shí)，再繼續(xù)增加樣品濃度，檢出的雜質(zhì)個(gè)數(shù)不變，故將醋酸來法莫林有關(guān)物質(zhì)檢查濃度定為5 mg/mL。

3.6 雜質(zhì)A、B分析

圖6 雜質(zhì)B的高分辨質(zhì)譜圖Fig.6 HR-MS chart of impurity B

在樣品中，雜質(zhì)B的歸一化含量大于0.1%，根據(jù)ICH的文件Q3A和中國藥典四部通則藥品雜質(zhì)分析指導(dǎo)原則，需要對(duì)該雜質(zhì)進(jìn)行研究。首先采用起始原料與中間體定位雜質(zhì)，結(jié)果表明雜質(zhì)A、B既不是原料也不是中間體；進(jìn)而采用最后一步反應(yīng)剩余的母液分析雜質(zhì)來源，也未能成功定位歸一化含量大于0.1%的雜質(zhì)；最后根據(jù)降解試驗(yàn)產(chǎn)生的降解雜質(zhì)分析雜質(zhì)來源，其中氧化降解產(chǎn)生2個(gè)較大的雜質(zhì)，兩雜質(zhì)與樣品中歸一化含量較大及該雜質(zhì)前一相鄰雜質(zhì)保留時(shí)間一致。通過半制備高效液相色譜法收集雜質(zhì)A溶液與雜質(zhì)B溶液，再將所得的兩溶液進(jìn)行高分辨質(zhì)譜分析，兩雜質(zhì)的高分辨質(zhì)譜圖見圖5～6。兩雜質(zhì)的ESI正離子譜圖顯示其分子離子峰有m/z524.3023、546.2839、562.2574，分別對(duì)應(yīng)[M+H]+、[M+Na]+、[M+K]+離子峰，表明其分子量為523，而來法莫林的分子量為507，氧化降解產(chǎn)生的兩雜質(zhì)剛好比來法莫林多了一個(gè)氧原子的分子量16，研究證明雜質(zhì)A、雜質(zhì)B為氧化降解雜質(zhì)，結(jié)合醋酸來法莫林的結(jié)構(gòu)與合成路線，推測雜質(zhì)A、B可能為醋酸來法莫林硫醚鍵氧化成亞砜或碳碳雙鍵環(huán)氧化的產(chǎn)物，結(jié)構(gòu)見圖7。在氧化劑(過氧化氫)存在的條件下，醋酸來法莫林結(jié)構(gòu)中的硫醚鍵會(huì)被氧化成亞砜，碳碳雙鍵則被氧化成環(huán)氧乙烷。結(jié)合醋酸來法莫林的合成路線分析樣品中雜質(zhì)A與雜質(zhì)B的來源，推測是空氣中的氧氣將硫醚氧化成亞砜，有研究表明[5]在沒有氧化劑的條件下可以利用氧氣將硫醚氧化成亞砜，因空氣中氧氣占比較大，可能在反應(yīng)過程中將硫醚氧化成亞砜。同理，碳碳雙鍵環(huán)氧化也是空氣中氧氣的作用[6]。

圖5 雜質(zhì)A的高分辨質(zhì)譜圖Fig.5 HR-MS chart of impurity A

圖7 雜質(zhì)A或雜質(zhì)B可能的結(jié)構(gòu)Fig.7 Possible structure of impurity A or impurity B