喬涵 胡辛欣 聶彤穎 楊信怡 游雪甫 李聰然,*

(1 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所 抗感染藥物研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050； 2 中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 102629)

目前，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是引起醫(yī)院感染的主要條件致病菌[1]。隨著抗菌藥物的廣泛使用，臨床中常常出現(xiàn)多重耐藥和泛耐藥的PA，導(dǎo)致嚴(yán)重且難以治療的醫(yī)院獲得性感染。免疫力低下患者對(duì)PA具有較高的易感性，PA引發(fā)的感染在該類人群中可導(dǎo)致較高的病死率[2]。

抗菌譜廣，抗菌能力強(qiáng)是碳青霉烯類藥物最主要的特征，通常情況下，治療銅綠假單胞菌感染臨床常用β-內(nèi)酰胺類抗生素。致使PA對(duì)碳青霉烯類藥物敏感性越來越低，從而產(chǎn)生耐藥，臨床的醫(yī)治越來越艱難。2017年，WHO強(qiáng)調(diào)要盡快找出對(duì)抗耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌(carbapenem resistantPseudomonas aeruginosa,CRPA)的藥物，從而治療細(xì)菌感染[3]。但異質(zhì)性耐藥PA的出現(xiàn)，給耐藥檢測(cè)和臨床治療帶來了極大的挑戰(zhàn)。

異質(zhì)性耐藥是細(xì)菌耐藥的一種特殊類型，指表面上同源的細(xì)菌表現(xiàn)出對(duì)特定抗生素部分敏感的現(xiàn)象[4]，即在體外的常規(guī)藥敏試驗(yàn)中，菌株表現(xiàn)為敏感，如若改用特殊方法檢測(cè)，則可以發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的大部分亞群屬于敏感，但有一小部分亞群屬于耐藥，極少數(shù)亞群甚至表現(xiàn)為高水平耐藥，這部分耐藥亞群可以導(dǎo)致臨床抗生素治療失敗[5]。由于異質(zhì)性耐藥的特殊性、難以治療性和不可預(yù)測(cè)性，越來越多的學(xué)者開始關(guān)注這一特殊現(xiàn)象，并研究如何快速檢測(cè)與有效治療異質(zhì)性耐藥菌感染。

抗生素異質(zhì)性耐藥第一次被提出，是在1947年的革蘭陰性流感嗜血桿菌中[6]，而革蘭陽(yáng)性葡萄球菌被發(fā)現(xiàn)有異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象大約是在20年以后[7]，但是第一次用“異質(zhì)性耐藥”一詞是在1970年。篩選異質(zhì)性耐藥菌株的方法中最被認(rèn)可的是群體分析法(population analysis profiling，PAP)，被認(rèn)為是鑒定異質(zhì)性耐藥的金標(biāo)準(zhǔn)[5]。菌落計(jì)數(shù)PAP方法與標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌MIC測(cè)定方法相同，目的抗生素濃度梯度設(shè)定為2倍，并通過涂布平板菌落計(jì)數(shù)對(duì)異質(zhì)性耐藥進(jìn)行判定。如果抗生素對(duì)細(xì)菌展現(xiàn)最大抑制效果的最低藥物濃度(highest inhibitory concentration，HIC)高于8倍的對(duì)細(xì)菌沒有抑制效果的最高藥物濃度( highest noninhibitory concentration，HNIC)[4,8-9]，那該菌株就可被定義為異質(zhì)性耐藥菌株。其他方法還包括紙片法或E-test紙條法。E-test紙條法是將菌液調(diào)至2.0麥?zhǔn)蠁挝缓?，均勻涂布于MH平板，貼相應(yīng)的E-test試紙條，37℃孵育48 h后觀察抑菌圈內(nèi)是否有個(gè)別耐藥菌落生長(zhǎng)的方法。

本研究的主要目的是鑒定篩選碳青霉烯類(亞胺培南)異質(zhì)性耐藥臨床分離銅綠假單胞菌，并探究其異質(zhì)性耐藥的可能機(jī)制，為碳青霉烯類異質(zhì)性耐藥銅綠假單胞菌感染的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

標(biāo)準(zhǔn)菌株：銅綠假單胞菌ATCC 27853；實(shí)驗(yàn)菌株：銅綠假單胞菌臨床分離株30株，來自于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原微生物菌(毒)種保藏中心藥用微生物相關(guān)菌(毒)種保藏分中心(CAMS-CCPM-A)。

1.2 E-test 試紙條法

臨床菌株的培養(yǎng)按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》操作[10]，E-test試紙條按照說明書操作，37℃培養(yǎng)48 h后，觀察抑菌圈形狀，和抑菌圈內(nèi)是否有零星菌落。若抑菌圈內(nèi)有零星菌落或抑菌圈邊緣不清，則判斷為可能異質(zhì)性耐藥菌株。若沒有，則按照抑菌圈與E-test紙條的交界讀數(shù)。若在紙條兩邊有不同的交點(diǎn)，讀取較高值，如果差值大于1稀釋度，則為無法正確讀數(shù)。E-test結(jié)果為耐藥的菌株和無法正確讀數(shù)的菌株也列入異質(zhì)性耐藥疑似菌株中。通過E-test試紙條法檢測(cè)為異質(zhì)性耐藥的菌苔特征示意圖見圖1(抑菌圈內(nèi)有零星菌落)。

圖1 E-test試紙條法檢測(cè)為異質(zhì)性耐藥的菌苔特征Fig.1 Bacterial characteristics of the heteroresistant strains by E-test

1.3 群體分析法(PAP)

挑取新鮮平皿中的各菌株單菌落接種至CAMH培養(yǎng)基中37℃靜置培養(yǎng)過夜。配制含不同濃度藥物平皿，藥物濃度為0、0.06、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64和128 μg/mL。將過夜菌液10倍系列稀釋，分別涂布于含不同濃度亞胺培南的各個(gè)平皿上，37℃培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)各平皿上菌落數(shù)，異質(zhì)性耐藥菌株判定標(biāo)準(zhǔn)為：對(duì)細(xì)菌最大抑制效果的最低藥物濃度(HIC)與對(duì)細(xì)菌沒有抑制效果的最高藥物濃度(HNIC)的比值大于8[9]。

1.4 最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定

參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)[10]，測(cè)定菌株對(duì)鹽酸環(huán)丙沙星、多黏菌素B、頭孢他啶、美羅培南、慶大霉素、左氧氟沙星的MIC值，濃度測(cè)定范圍為0.06～128 μg/mL。

1.5 全基因組三代測(cè)序與二代重測(cè)序

1.5.1 全基因組測(cè)序菌株

將銅綠假單胞菌16-24進(jìn)行PAP試驗(yàn)，將在含 4 μg/mL亞胺培南平皿上生長(zhǎng)的單菌落保存并命名為銅綠假單胞菌24-4；用銅綠假單胞菌24-4進(jìn)行PAP實(shí)驗(yàn)，在4 μg/mL和8 μg/mL亞胺培南含藥平皿上生長(zhǎng)的單菌落保存并命名為銅綠假單胞菌24-4-4和銅綠假單胞菌24-4-8；將銅綠假單胞菌24-4在無藥平板上連續(xù)傳代5 d后再用PAP法篩選菌株，在含8 μg/mL亞胺培南平皿上生長(zhǎng)的單菌落保存并標(biāo)號(hào)為銅綠假單胞菌24-45-8。

通過PAP試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這5株同源菌株在亞胺培南誘導(dǎo)下，異質(zhì)性變大，但當(dāng)無藥物誘導(dǎo)連續(xù)傳代后，異質(zhì)性有變小趨勢(shì)，如表3。將銅綠假單胞菌16-24做三代基因組測(cè)序后作為對(duì)照組，銅綠假單胞菌24-4、銅綠假單胞菌24-4-4、銅綠假單胞菌24-4-8、銅綠假單胞菌24-45-8做二代基因組重測(cè)序作為實(shí)驗(yàn)組，比對(duì)實(shí)驗(yàn)組是否有與異質(zhì)性耐藥相關(guān)的基因突變。

1.5.2 測(cè)序方法

三代測(cè)序：按照Wizard?基因組DNA純化試劑盒(Promega)說明書進(jìn)行基因組DNA提取，純化后建庫(kù)測(cè)序。制備的文庫(kù)在Illumina HiSeq X Ten儀器上進(jìn)行雙端測(cè)序。利用PacBio RS Ⅱ?qū)llumina平臺(tái)生成的數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。利用Glimmer對(duì)基因組中的編碼序列(CDS)進(jìn)行預(yù)測(cè)，質(zhì)?；虿捎肎eneMarkS軟件預(yù)測(cè)，用tRNAscan-SE進(jìn)行tRNA預(yù)測(cè)，用Barrnap進(jìn)行rRNA預(yù)測(cè)。利用BLAST、Diamond、HMMER等序列比對(duì)工具，從NR、Swiss-Prot、Pfam、GO、COG、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)預(yù)測(cè)到的CDS進(jìn)行蛋白功能注釋。

二代重測(cè)序：提取并檢測(cè)DNA樣本后構(gòu)建DNA文庫(kù)，通過橋式 PCR后，Illumina Xten測(cè)序，利用trimmomatic軟件對(duì)原始下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，以保證后續(xù)分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。通過 BWA 軟件將有效測(cè)序與參考基因組比對(duì)，并利用SAM tools軟件標(biāo)記重復(fù)序列。使用BreakDancer對(duì)SV進(jìn)行檢測(cè)，過濾PE reads支持?jǐn)?shù)小于4的SV，并使用ANNOVAR對(duì)其中的DEL、INS、INV進(jìn)行注釋。與此同時(shí)，利用Cnvnator軟件對(duì)CNV 進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 PCR檢測(cè)耐藥相關(guān)基因突變

通過全式金細(xì)菌基因組提取試劑盒提取原始菌株和耐藥菌株全基因組DNA，PCR檢測(cè)誘導(dǎo)耐藥株中是否確有基因突變，所需引物見表1。

2 結(jié)果

2.1 E-test紙條法初篩異質(zhì)性耐藥疑似株

采用E-test紙條對(duì)30株臨床分離銅綠假單胞菌進(jìn)行異質(zhì)性耐藥初篩，得到表2數(shù)據(jù)，40%(12株)的菌株為異質(zhì)性耐藥疑似菌株。

2.2 PAP法確定異質(zhì)性耐藥菌株

將異質(zhì)性耐藥疑似菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株銅綠假單胞菌ATCC 27853同時(shí)用PAP法驗(yàn)證菌株是否為異質(zhì)性耐藥，結(jié)果如表3，從12株異質(zhì)性耐藥疑似菌株中通過PAP方法確定了8株異質(zhì)性耐藥菌。

表3 PAP法驗(yàn)證異質(zhì)性耐藥菌株Tab.3 Validation of the heteroresistant strains by PAP method

2.3 異質(zhì)性耐藥株對(duì)其他藥物的敏感性

用肉湯微量稀釋法測(cè)各菌株對(duì)其他藥物的MIC值，得出各菌株對(duì)其他藥物敏感性的累計(jì)百分率，結(jié)果如圖2所示。根據(jù)CLSI中銅綠假單胞菌對(duì)各藥物的耐藥標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算出各異質(zhì)性耐藥菌株對(duì)其他藥物的耐藥率，結(jié)果顯示，異質(zhì)性耐藥株對(duì)多黏菌素B、頭孢他啶、美羅培南耐藥率較高，對(duì)其他藥物相對(duì)更敏感。

圖2 異質(zhì)性耐藥菌株對(duì)其他藥物的敏感性Fig.2 Susceptibility of heteroresistant strains to other drugs

2.4 全基因組測(cè)序及PCR驗(yàn)證結(jié)果

將銅綠假單胞菌16-24做三代基因組測(cè)序后，采用Circos v0.64(http://circos.ca/)軟件繪制基因組圈圖(圖3)。其余菌株做二代基因組重測(cè)序，比對(duì)銅綠假單胞菌16-24數(shù)據(jù)，利用BWA比對(duì)軟件將質(zhì)控后的測(cè)序片段比對(duì)回參考基因組；利用Picard-tools去除PCR duplication 產(chǎn)生的測(cè)序片段。分析4479個(gè)不同基因片段，未發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)組中發(fā)生多拷貝的片段或基因。

圖3 銅綠假單胞菌16-24基因組圈圖Fig.3 Genome circle map of P.aeruginosa 16-24

根據(jù)測(cè)序結(jié)果并排除組裝錯(cuò)誤，我們篩選出可能與異質(zhì)性相關(guān)的基因突變并通過PCR擴(kuò)增進(jìn)行驗(yàn)證。擴(kuò)增長(zhǎng)度為1～1.5 kb的片段，PCR產(chǎn)物送生工生物工程上海股份有限公司測(cè)序并與原始菌株的PCR產(chǎn)物序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果如表4所示，得到的PCR產(chǎn)物與母體菌株銅綠假單胞菌16-24相比，除gene3279、gene5991、gene5622 3個(gè)基因更換引物后仍未擴(kuò)增出外，其余基因均未突變。

表4 確證SNP位點(diǎn)結(jié)果數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表Tab.4 Confirmed SNP locus result data statistics table

gene5991是與?；撍赣嘘P(guān)的基因，但關(guān)于這個(gè)細(xì)菌蛋白質(zhì)家族沒有已知的功能。gene5622是一個(gè)假定蛋白，目前還沒有關(guān)于其功能的描述。因此，我們把研究重點(diǎn)放在gene3279上，一個(gè)與雙功能乙醛酸/羥基丙酮酸還原酶有關(guān)的基因。由于gene3279長(zhǎng)度為985 bp，片段長(zhǎng)度較短，若基因內(nèi)部片段發(fā)生翻轉(zhuǎn)，會(huì)導(dǎo)致測(cè)序時(shí)可以正常拼接，但擴(kuò)增時(shí)，更換多個(gè)引物也不能有效擴(kuò)增出產(chǎn)物的情況，因此我們判斷gene3279有可能為基因內(nèi)部片段發(fā)生翻轉(zhuǎn)，或基因內(nèi)形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)等原因不能有效擴(kuò)增，但不論如何，都可能使該基因編碼的蛋白發(fā)生改變甚至失活。

最外面一圈為基因組大小的標(biāo)識(shí)，每一個(gè)刻度為0.1 Mb；第二圈和第三圈為正鏈、負(fù)鏈上的 CDS，不同的顏色表示CDS不同的COG的功能分類；第四圈為 rRNA 和 tRNA；第五圈為GC含量。

3 討論

β-內(nèi)酰胺類抗生素，到目前為止是臨床治療重癥PA感染的一線用藥，若臨床治療中遇到藥敏試驗(yàn)顯示碳青霉烯類敏感的異質(zhì)性耐藥菌，很可能錯(cuò)過最佳治療時(shí)間，甚至發(fā)展成多重耐藥菌，對(duì)臨床治療造成巨大風(fēng)險(xiǎn)。因此，探索異質(zhì)性耐藥PA在臨床分離菌株的分布情況和異質(zhì)性耐藥的產(chǎn)生機(jī)制十分必要。

E-test紙條法篩查異質(zhì)性耐藥菌株簡(jiǎn)便快捷，但紙條價(jià)格偏高，且根據(jù)實(shí)驗(yàn)，篩查異質(zhì)性的假陽(yáng)性率為9.09%。PAP法雖然是實(shí)驗(yàn)室鑒定異質(zhì)性耐藥菌株的金標(biāo)準(zhǔn)，但所消耗的時(shí)間與人力財(cái)力極大，現(xiàn)實(shí)臨床治療中難以實(shí)現(xiàn)。故根據(jù)本研究結(jié)果，E-test紙條法是目前相對(duì)較為合理的臨床篩查異質(zhì)性耐藥的方法。

微量肉湯稀釋法測(cè)各菌株對(duì)其他藥物的MIC結(jié)果顯示，對(duì)于亞胺培南異質(zhì)性耐藥的PA，似乎顯示出對(duì)多黏菌素B、頭孢他啶、美羅培南耐藥率較高，而對(duì)其他藥物的耐藥率并不高。誠(chéng)然，可能因?yàn)楫愘|(zhì)性耐藥菌樣本數(shù)量不足導(dǎo)致的結(jié)果誤差。但就目前結(jié)果看來，亞胺培南異質(zhì)性耐藥菌株對(duì)環(huán)丙沙星等的敏感性似乎很高，與文獻(xiàn)中推薦的在臨床治療中，若某菌株初步鑒定為異質(zhì)性耐藥菌，則可優(yōu)先考慮環(huán)丙沙星等藥物進(jìn)行聯(lián)合治療[11]，為挽救重癥患者生命爭(zhēng)取寶貴的治療時(shí)間相一致。

遺傳分析表明，大多數(shù)異質(zhì)性耐藥是不穩(wěn)定的，通常由自發(fā)串聯(lián)擴(kuò)增已知的耐藥基因，引起細(xì)菌亞群的耐藥性增加[12]。且實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌16-24在PAP實(shí)驗(yàn)過程中，雖結(jié)果為異質(zhì)性，但每次異質(zhì)性范圍有一定差距，故我們將銅綠假單胞菌16-24作為重點(diǎn)研究對(duì)象進(jìn)行進(jìn)一步的機(jī)制研究。根據(jù)對(duì)異質(zhì)性耐藥菌株的全基因組測(cè)序和重測(cè)序數(shù)據(jù)分析，未發(fā)現(xiàn)突變體中發(fā)生多拷貝的大片段，也未發(fā)現(xiàn)在突變體中發(fā)生多拷貝的基因。

異質(zhì)性耐藥在基因?qū)用娴臋C(jī)制還有可能是某重要基因突變?cè)斐伞８鶕?jù)三代基因測(cè)序結(jié)果并排除組裝錯(cuò)誤，除gene3279、gene5991、gene5622 3個(gè)基因更換引物后PCR未擴(kuò)增出片段外，其余基因均未突變。gene3279是一個(gè)與雙功能乙醛酸/羥基丙酮酸還原酶有關(guān)的基因，編碼EF-P(延伸因子 P)是一種必需蛋白質(zhì)，在細(xì)菌中可刺激蛋白質(zhì)合成中第一個(gè)肽鍵的形成[13-14]。EF-P由Glick和Ganoza于1975年發(fā)現(xiàn)[15]，它可能通過改變核糖體對(duì)氨酰-tRNA 的親和力間接發(fā)揮作用，從而增加它們作為肽基轉(zhuǎn)移酶受體的反應(yīng)性[14]。EF-P不是最小體外翻譯系統(tǒng)的必要組成部分，但EF-P 的缺失會(huì)限制翻譯速率、抗生素敏感性和細(xì)菌的生長(zhǎng)速率都會(huì)被影響。gene5991可能是與?；撍赣嘘P(guān)的基因，但關(guān)于這個(gè)細(xì)菌蛋白質(zhì)家族沒有已知的功能。一些成員將蛋白質(zhì)注釋為Mn2+/Zn2+轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的滲透酶成分，但這無法得到證實(shí)。Gene5622是一個(gè)假定蛋白，目前還沒有關(guān)于其功能的描述。對(duì)于靶基因不能通過常規(guī)手段擴(kuò)增問題，近期有研究表明，基因中某些片段的倒位翻轉(zhuǎn)有可能導(dǎo)致正常設(shè)計(jì)引物后，靶基因無法擴(kuò)增。若基因片段翻轉(zhuǎn)，該基因編碼的蛋白則無法正常表達(dá)，致基因失活，從而可能導(dǎo)致細(xì)菌的異質(zhì)性耐藥。因此，銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類藥物的異質(zhì)性耐藥有可能與EF-P有關(guān)。

綜上所述，探索PA對(duì)碳青霉烯類藥物異質(zhì)性耐藥的機(jī)制，以發(fā)現(xiàn)更有效的對(duì)抗耐藥的靶點(diǎn)是極為必要的。后續(xù)我們會(huì)繼續(xù)從基因、轉(zhuǎn)錄以及翻譯等層面，探索PA異質(zhì)性耐藥的機(jī)制。本文中闡述的方法、結(jié)果及機(jī)制希望可以對(duì)臨床治療和基礎(chǔ)探究提供參考。