孫聰聰，龐道睿，黎爾納，李 倩，鄒宇曉，廖森泰，劉 凡,

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510600；2.江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212018）

低聚半乳糖（Galactooligosaccharides，GOS）是一種具有天然益生元屬性的功能性低聚糖[1]，其分子結(jié)構(gòu)一般是在葡萄糖或半乳糖分子上連接1～7個(gè)半乳糖基，即 Gal-（Gal）n-Glc/Gal（n 為 0～6）。研究表明，低聚半乳糖具有調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)[2-3]、促進(jìn)礦物質(zhì)吸收[4-5]、提高免疫調(diào)節(jié)[6-7]、預(yù)防癌癥[8-9]及改善炎癥性腸病[10-11]等功能，因其具有優(yōu)越的生理功能和理化性質(zhì)而成為近年來國內(nèi)外關(guān)注的熱點(diǎn)。

低聚半乳糖的制備方法主要有如下幾種：一是從自然界中提取，其成本高、產(chǎn)量低且分離困難；二是酸法水解天然多糖，但副反應(yīng)較多，增大了后續(xù)純化的難度；三是化學(xué)合成，步驟繁瑣、得率低，且存在環(huán)境污染的風(fēng)險(xiǎn)，僅限于實(shí)驗(yàn)室研究；四是酶法合成，其操作簡便、成本低，是目前生產(chǎn)GOS最理想的方法[12-15]。但目前GOS的商品化生產(chǎn)旨在生產(chǎn)更純凈和更高效的產(chǎn)品[16]，多以GOS的產(chǎn)率及純度作為衡量標(biāo)準(zhǔn)，對GOS的具體組成及特定健康效應(yīng)沒有太多關(guān)注[17-18]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，聚合度較高的GOS（如聚合度為4的低聚半乳四糖，Degree of Polymerization is 4，DP4），其體外抗炎活性也更強(qiáng)。因此，在保證GOS總產(chǎn)率情況下，提高高聚合度GOS產(chǎn)率成為本文研究的重點(diǎn)。

本研究以乳糖為原料，研究β-半乳糖苷酶的不同來源及酶催化反應(yīng)的不同條件（底物濃度、酶添加量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)pH）對GOS總產(chǎn)率及低聚半乳四糖（DP4）產(chǎn)率的影響，通過Box-Behnken響應(yīng)面分析法對β-半乳糖苷酶法合成GOS工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期在保證GOS總產(chǎn)率的前提下，選擇性地提高低聚半乳四糖產(chǎn)率，為低聚半乳糖的功能性應(yīng)用和特醫(yī)食品的研究開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

β-半乳糖苷酶（黑曲霉、大腸桿菌、米曲霉來源）上海瑞永生物科技有限公司；乳糖、鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG）、鄰硝基苯酚、碳酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水 均為超純水。

LC1200高效液相色譜儀 美國Agilent；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市孝義合眾儀器供應(yīng)站；FE28 pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SHA-8水浴恒溫振蕩器 金壇區(qū)水北科普實(shí)驗(yàn)儀器廠；CR22GⅢ高速冷凍離心機(jī) 日本HITACHI。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同來源的β-半乳糖苷酶對合成GOS的影響首先參考GB/T 33409-2016β-半乳糖苷酶活性檢測方法[19]，對黑曲霉來源、大腸桿菌來源、米曲霉來源的β-半乳糖苷酶的水解活性進(jìn)行測定。然后以0.1 mol/L、pH6.5的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液溶解乳糖，配制100 mL濃度為300 g/L乳糖底物置于250 mL酶反應(yīng)容器中，以6 U/g乳糖的加酶量分別加入黑曲霉來源、大腸桿菌來源、米曲霉來源的β-半乳糖苷酶，置于50 ℃的水浴搖床120 r/min反應(yīng)12 h，反應(yīng)液于沸水浴滅酶20 min，8000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm水相濾膜，利用高效液相色譜法分析產(chǎn)物中糖類物質(zhì)的組成，考察不同來源的β-半乳糖苷酶對GOS產(chǎn)率、DP4產(chǎn)率的影響。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 起始乳糖濃度對合成GOS的影響 以0.1 mol/L、pH6.5的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液溶解乳糖，分別配制成100 mL不同濃度（200、300、400、500、600 g/L）的乳糖底物置于250 mL酶反應(yīng)容器中，在加酶量6 U/g乳糖的條件下，置于50 ℃的水浴搖床120 r/min反應(yīng)12 h，反應(yīng)液于沸水浴滅酶20 min，8000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm水相濾膜，利用高效液相色譜法分析產(chǎn)物中糖類物質(zhì)的組成，考察不同起始乳糖濃度對GOS產(chǎn)率、DP4產(chǎn)率的影響。

1.2.2.2 加酶量對合成GOS的影響 以0.1 mol/L、pH6.5的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液配制100 mL濃度為300 g/L乳糖底物置于250 mL酶反應(yīng)容器中，分別加入 2、4、6、8、10 U/g 的β-半乳糖苷酶，置于50 ℃的水浴搖床120 r/min反應(yīng)12 h，反應(yīng)液于沸水浴滅酶20 min，8000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm水相濾膜，利用高效液相色譜法分析產(chǎn)物中糖類物質(zhì)的組成，考察不同的β-半乳糖苷酶添加量對GOS產(chǎn)率、DP4產(chǎn)率的影響。

1.2.2.3 反應(yīng)溫度對合成GOS的影響 以0.1 mol/L、pH6.5的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液配制100 mL濃度為300 g/L乳糖底物置于250 mL酶反應(yīng)容器中，各加入8 U/g的β-半乳糖苷酶，置于不同反應(yīng)溫度（30、40、50、60、70 ℃）的水浴搖床 120 r/min反應(yīng)12 h，反應(yīng)液于沸水浴滅酶20 min，8000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm水相濾膜，利用高效液相色譜法分析產(chǎn)物中糖類物質(zhì)的組成，考察不同的反應(yīng)溫度對GOS產(chǎn)率、DP4產(chǎn)率的影響。

1.2.2.4 反應(yīng)時(shí)間對合成GOS的影響 以0.1 mol/L、pH6.5的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液配制100 mL濃度為300 g/L乳糖底物置于250 mL酶反應(yīng)容器中，各加入8 U/g的β-半乳糖苷酶，置于50 ℃的水浴搖床 120 r/min分別反應(yīng)（4、8、12、16、20 h），反應(yīng)液于沸水浴滅酶20 min，8000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm水相濾膜，利用高效液相色譜法分析產(chǎn)物中糖類物質(zhì)的組成，考察不同的反應(yīng)時(shí)間對GOS產(chǎn)率、DP4產(chǎn)率的影響。

1.2.2.5 反應(yīng)pH對合成GOS的影響 以0.1 mol/L、不同 pH（4.5、5.5、6.5、7.5、8.5）的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液配制100 mL濃度為300 g/L乳糖底物置于250 mL酶反應(yīng)容器中，各加入8 U/g的β-半乳糖苷酶，置于50 ℃的水浴搖床120 r/min反應(yīng)16 h，反應(yīng)液于沸水浴滅酶20 min，8000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm水相濾膜，利用高效液相色譜法分析產(chǎn)物中糖類物質(zhì)的組成，考察不同的反應(yīng)pH對GOS產(chǎn)率、DP4產(chǎn)率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn) 綜合單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以加酶量（A）、反應(yīng)溫度（B）、反應(yīng)時(shí)間（C）、反應(yīng) pH（D）為自變量，以 GOS 產(chǎn)率（Y1）、DP4 產(chǎn)率（Y2）為響應(yīng)值，采用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)法對合成條件在四因素三水平上進(jìn)行工藝參數(shù)的優(yōu)化。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.4β-半乳糖苷酶的活性檢測 參考GB/T 33409-2016β-半乳糖苷酶活性檢測方法[19]。pH7.3的磷酸緩沖液適用大腸桿菌來源的β-半乳糖苷酶，pH4.5的磷酸緩沖液適用黑曲霉、米曲霉來源的β-半乳糖苷酶。精確稱取酶粉1.0 mg，用相應(yīng)的反應(yīng)緩沖液溶解后，定容至100 mL，利用分光光度計(jì)法測定β-半乳糖苷酶活性。以鄰硝基苯酚為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：YpH7.3=4.0549x+0.0085，R2pH7.3=0.9998；YpH4.5=1.8251x+0.0074，R2pH4.5=0.9992。

酶活力計(jì)算公式如下：

式中：c表示測定液中鄰硝基苯酚的濃度，從對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線中得出，mmol/L；8為反應(yīng)試劑的總體積，mL；D表示稀釋倍數(shù)；1表示參與反應(yīng)酶液的體積，mL；10為反應(yīng)時(shí)間，min；V表示溶解酶粉的液體體積，mL；m表示稱取酶粉的質(zhì)量，g。

1.2.5 GOS產(chǎn)率的測定和DP4產(chǎn)率的測定 測定方法采用高效液相色譜法（HPLC）。色譜條件：Agilent 1200型高效液相色譜，蒸發(fā)光散射檢測器（霧化溫度30 ℃，蒸發(fā)溫度30 ℃，氣體流速1.6 SLM），色譜柱為 Agilent Hi-Plex（300 mm×7.7 mm，8 μm），柱溫80 ℃，流動相為超純水，流速0.6 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。按照以上色譜條件對反應(yīng)樣品進(jìn)行測定分析。

根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物中各糖類物質(zhì)在HPLC上的峰面積，用外標(biāo)法對GOS與DP4產(chǎn)率進(jìn)行絕對定量計(jì)算。其計(jì)算公式如下：

式中：cGOS表示反應(yīng)產(chǎn)物中GOS的濃度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中得出，μg/mL；V表示反應(yīng)終止時(shí)反應(yīng)液的體積，mL；D表示稀釋倍數(shù)；mLac表示乳糖初始添加的質(zhì)量，mg；cDP4表示反應(yīng)產(chǎn)物中DP4的濃度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中得出，μg/mL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次重復(fù)平均值，采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan's多重差異顯著分析，顯著性水平P＜0.05，不同字母代表組間顯著性差異。采用GraphPad Prism 7軟件做圖，Design Expert 12.0進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 GOS和DP4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

各標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖見圖1，以標(biāo)準(zhǔn)品峰面積的自然對數(shù)值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg/mL）的自然對數(shù)值為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2，以低聚半乳三糖和低聚半乳四糖的峰面積之和為總GOS峰面積）。經(jīng)回歸處理得線性回歸方 程 ：YGOS=1.523x-1.8329，R2GOS=0.9996；YDP4=1.5172x-1.7069，R2DP4=0.9993。

圖1 糖標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of sugar standard

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve

2.2 不同酶來源對合成GOS的影響

GOS的合成與β-半乳糖苷酶的反應(yīng)機(jī)制密切相關(guān)，GOS合成過程中發(fā)生兩類反應(yīng)：一是乳糖的水解反應(yīng)，二是轉(zhuǎn)半乳糖基反應(yīng)，而GOS正是轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)的產(chǎn)物，因此GOS產(chǎn)率取決于這兩種反應(yīng)的平衡[18]。不同來源的酶具有不同的特性，對于水和糖具有不同的選擇性，不同酶之間的結(jié)構(gòu)特征或其反應(yīng)機(jī)制也有所差異，從而導(dǎo)致GOS產(chǎn)率和高聚合度GOS（如DP4）的產(chǎn)率有所不同[20-21]。通過酶水解活力測定發(fā)現(xiàn)三種β-半乳糖苷酶的水解活性強(qiáng)弱：米曲霉來源（酶Ⅲ）＞黑曲霉來源（酶Ⅰ）＞大腸桿菌來源（酶Ⅱ）（圖3A）；在酶添加量、底物濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)pH、反應(yīng)時(shí)間完全相同的條件下，測定比較GOS總產(chǎn)率及DP4產(chǎn)率，分析得出三種β-半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)糖基活性強(qiáng)弱：大腸桿菌來源（酶Ⅱ）＞米曲霉來源（酶Ⅲ）＞黑曲霉來源（酶Ⅰ）（圖3B）。綜上可知，相同酶添加量（U/g乳糖）的條件下，雖然大腸桿菌來源的β-半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)糖基活性更強(qiáng)，但因其單位質(zhì)量的酶活力很低，故需消耗的酶量大，成本較高，因此兼顧到GOS產(chǎn)率以及經(jīng)濟(jì)成本，選用米曲霉來源的β-半乳糖苷酶進(jìn)行接下來的實(shí)驗(yàn)。

圖3 不同酶來源對合成GOS的影響Fig.3 Effect of enzymes from different sources on the synthesis of GOS

2.3 不同反應(yīng)條件對GOS合成的影響

2.3.1 起始乳糖濃度對合成GOS的影響 在一定的加酶量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)pH條件下，以不同起始濃度的乳糖合成GOS，其結(jié)果如圖4所示。隨著乳糖起始濃度的增加，GOS產(chǎn)率逐漸增加，于300 g/L時(shí)達(dá)到最大值10.74%，這可能是隨著乳糖起始濃度的提高，一方面增加了半乳糖受體的量，另一方面降低了水活度，從而更容易發(fā)生轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)，生成GOS[22]；當(dāng)乳糖初始濃度從300 g/L繼續(xù)增加到600 g/L時(shí)，其GOS產(chǎn)率逐漸下降，這可能是由于在高乳糖濃度下，β-半乳糖苷酶催化活性受到抑制，致使其水解和轉(zhuǎn)苷作用同時(shí)降低[23]。同時(shí)，隨著乳糖濃度的增加，DP4產(chǎn)率逐漸降低。綜合考慮原料的充分利用以及GOS產(chǎn)率等因素，選用300 g/L的乳糖起始濃度進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

圖4 不同起始乳糖濃度對合成GOS的影響Fig.4 Effect of different concentrations of galactose on the synthesis of GOS

2.3.2 加酶量對合成GOS的影響 在乳糖起始濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)pH一定的條件下，以不同加酶量合成GOS，其結(jié)果如圖5所示。當(dāng)加酶量為8 U/g時(shí)，GOS產(chǎn)率為 11.09%±0.19%，DP4產(chǎn)率為1.53%±0.02%；繼續(xù)提高酶添加量，GOS產(chǎn)率與DP4產(chǎn)率沒有明顯增加?？傮w而言，在一定的加酶量范圍內(nèi)，隨著β-半乳糖苷酶添加量的增多，GOS產(chǎn)率、DP4產(chǎn)率也隨之提高。這可能是因?yàn)樵诜磻?yīng)體系中，酶與底物絡(luò)合，使得GOS產(chǎn)率增加；而當(dāng)加酶量過高時(shí)，不能充分利用β-半乳糖苷酶，同時(shí)產(chǎn)生的副產(chǎn)物影響GOS的合成[24]。綜合考慮酶的利用效率、GOS產(chǎn)率及DP4產(chǎn)率，選用加酶量8 U/g進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖5 不同加酶量對合成GOS的影響Fig.5 Effect of different enzyme addition on the synthesis of GOS

2.3.3 反應(yīng)溫度對合成GOS的影響 在乳糖濃度、加酶量、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)pH固定的條件下，以不同的反應(yīng)溫度合成GOS，結(jié)果如圖6所示。當(dāng)反應(yīng)溫度低于50 ℃時(shí)，GOS產(chǎn)率及DP4產(chǎn)率隨反應(yīng)溫度的升高而增加，這是因?yàn)檫m當(dāng)升高溫度不僅可以增加乳糖的溶解度，而且促進(jìn)反應(yīng)體系中分子間相互作用，從而促進(jìn)GOS的合成，使得GOS產(chǎn)率及DP4產(chǎn)率提高。而當(dāng)溫度高于50 ℃時(shí)，高溫使得β-半乳糖苷酶變性失活，不利于GOS合成[25]。因此，考慮到酶的熱穩(wěn)定性，選取最適溫度為50 ℃進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖6 不同反應(yīng)溫度對合成GOS的影響Fig.6 Effect of different reaction temperature on the synthesis of GOS

2.3.4 反應(yīng)時(shí)間對合成GOS的影響 如圖7所示，在乳糖濃度、加酶量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)pH一定時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，其GOS合成產(chǎn)率呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，這可能是反應(yīng)時(shí)間過長，底物濃度降低，導(dǎo)致轉(zhuǎn)糖苷作用減弱，而合成的GOS可能又會發(fā)生水解，最終使得GOS總產(chǎn)率下降[26]。隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，DP4產(chǎn)率卻逐漸升高，可能是反應(yīng)時(shí)間的延長有利于高聚合度GOS的合成。綜合考慮GOS產(chǎn)率及DP4產(chǎn)率，選取反應(yīng)16 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.3.5 反應(yīng)pH對合成GOS的影響 由圖8可知，反應(yīng)pH為4.5～5.5時(shí)，GOS合成產(chǎn)率增加，在反應(yīng)pH5.5時(shí)，GOS產(chǎn)率為 12.03%±0.53%，達(dá)到最高；當(dāng)pH高于5.5時(shí)，GOS產(chǎn)率隨著pH的升高而下降，造成這種現(xiàn)象的原因可能是：米曲霉來源的β-半乳糖苷酶在酸性條件下，酶的催化活性更強(qiáng)，具有最適反應(yīng)pH。而當(dāng)反應(yīng)pH提高，DP4產(chǎn)率逐漸下降，可能是高聚合度的GOS發(fā)生了水解的緣故。綜上所述，確定該反應(yīng)體系的最適pH為5.5。

圖7 不同反應(yīng)時(shí)間對合成GOS的影響Fig.7 Effect of different reaction time on the synthesis of GOS

圖8 不同反應(yīng)pH對合成GOS的影響Fig.8 Effect of different reaction pH on the synthesis of GOS

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選定加酶量8 U/g、反應(yīng)溫度50 ℃、反應(yīng)時(shí)間16 h、反應(yīng)pH5.5為響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)的中心點(diǎn)，GOS產(chǎn)率（Y1）與DP4產(chǎn)率（Y2）為響應(yīng)值，對Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析和多元線性回歸二項(xiàng)式擬合，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2。

2.4.1 GOS產(chǎn)率的回歸模型及方差分析 對表2中GOS產(chǎn)率（Y1）相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合及方差分析，分析結(jié)果見表3。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值Table 2 Design and response value of Box-Behnken experiment

根據(jù)表3試驗(yàn)結(jié)果，得到回歸方程（1）為：

由表3的方差分析結(jié)果可知，模型的P＜0.0001，極顯著；失擬項(xiàng)P=0.1198＞0.05，不顯著，說明該模型成立。模型的決定系數(shù)R2=0.9909，校正決定系數(shù)R2Adj=0.9807，變異系數(shù)為2.42%，說明擬合度較好，置信度較高，實(shí)驗(yàn)操作可行，可以用此模型來預(yù)測低聚半乳糖合成工藝。

表3 Y1回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis of regression model of Y1

該回歸模型中的一次項(xiàng)A、B、D，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2的P值均小于0.01，具極顯著性，由F值可知，四個(gè)因素對GOS產(chǎn)率的影響大小依次為B（反應(yīng)溫度）＞A（加酶量）＞D（反應(yīng) pH）＞C（反應(yīng)時(shí)間）。交互項(xiàng)中 AD、BC的P值小于 0.01，BD的P值小于0.05，說明加酶量和反應(yīng)pH、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間及反應(yīng)溫度和反應(yīng)pH交互作用顯著。

2.4.2 GOS產(chǎn)率的響應(yīng)面分析 利用Design-Expert 12.0軟件對四個(gè)因素的交互作用進(jìn)行分析，選取了AD、BC、BD這三組響應(yīng)面圖和等高線圖，直觀表示這四個(gè)因素對Y1（GOS產(chǎn)率）的交互作用[27-28]。其中響應(yīng)面坡度越陡峭，表示該因素對于其他因素的改變越敏感，對GOS產(chǎn)率的影響越大。等高線可以直觀地反應(yīng)兩因素交互作用的顯著程度，其中橢圓形表示兩因素之間作用顯著，而接近圓形則表示不顯著[27,29]。利用軟件做出的響應(yīng)面與等高線圖如圖9所示，顯示四個(gè)變量中任取兩個(gè)變量為0水平時(shí)，其余兩個(gè)變量同時(shí)變化對GOS產(chǎn)率的影響。

由圖9可知，當(dāng)反應(yīng)溫度為50 ℃、反應(yīng)時(shí)間16 h時(shí)，從響應(yīng)面坡度可以看出，A和D的交互作用對GOS產(chǎn)率有顯著影響；而當(dāng)加酶量為8 U/g、反應(yīng)pH5.5固定不變時(shí)，B小于50 ℃，C小于16 h時(shí)，等高線較密集，表明在此范圍內(nèi)B和C的交互作用對GOS產(chǎn)率的影響顯著；當(dāng)固定加酶量8 U/g、反應(yīng)時(shí)間16 h時(shí)，B小于50 ℃，D小于5.5時(shí)，等高線較密集，表明在此范圍內(nèi)B和D的交互作用對GOS產(chǎn)率的影響顯著。以上結(jié)果與方差分析的結(jié)果一致。2.4.3 DP4產(chǎn)率的回歸模型及方差分析 對表2中DP4產(chǎn)率（Y2）相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合及方差分析，分析結(jié)果見表4。

圖9 加酶量和反應(yīng)pH、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和反應(yīng)pH的交互作用對GOS產(chǎn)率的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.9 Response surface and contour plots of the interaction effect between enzyme addition and reaction pH values, reaction temperature and reaction time, reaction temperature and reaction pH values on the yield of GOS

根據(jù)表4實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得到回歸方程（2）為：

由表4的方差分析結(jié)果可知，模型的P＜0.0001，極顯著；失擬項(xiàng)P=0.2043＞0.05，不顯著，說明該模型成立。模型的決定系數(shù)R2=0.9586，校正決定系數(shù)R2Adj=0.9172，變異系數(shù)為8.04%，說明擬合度較好，置信度較高，實(shí)驗(yàn)操作可行，可以用此模型來預(yù)測低聚半乳糖合成工藝。

表4 Y2回歸模型方差分析結(jié)果Table 4 Variance analysis of regression model of Y2

該回歸模型中的一次項(xiàng)A、D的P值均小于0.05，具有顯著性；二次項(xiàng) A2、B2、C2、D2的P值均小于0.01，具極顯著性。由F值可知，四個(gè)因素對DP4產(chǎn)率的影響大小依次為A（加酶量）＞D（反應(yīng)pH）＞B（反應(yīng)溫度）＞C（反應(yīng)時(shí)間）。交互項(xiàng)中 AD、BC的P值小于0.01，BD的P值小于0.05，說明加酶量和反應(yīng)pH、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間及反應(yīng)溫度和反應(yīng)pH交互作用顯著。

2.4.4 DP4產(chǎn)率的響應(yīng)面分析 利用Design-Expert 12.0軟件對四個(gè)因素的交互作用進(jìn)行分析，選取了AD、BC、BD這三組響應(yīng)面圖和等高線圖，直觀表示這四個(gè)因素對Y2（DP4產(chǎn)率）的交互作用[27-28]。其中響應(yīng)面坡度越陡峭，表示該因素對于其他因素的改變越敏感，對DP4產(chǎn)率的影響越大。等高線可以直觀地反應(yīng)兩因素交互作用的顯著程度，其中橢圓形表示兩因素之間作用顯著，而接近圓形則表示不顯著[27,29]。利用軟件做出的響應(yīng)面與等高線圖如圖10所示，顯示四個(gè)變量中任取兩個(gè)變量為0水平時(shí)，其余兩個(gè)變量同時(shí)變化對DP4產(chǎn)率的影響。

由圖10可知，當(dāng)反應(yīng)溫度為50 ℃、反應(yīng)時(shí)間16 h時(shí)，從響應(yīng)面坡度可以看出，A和D的交互作用對DP4產(chǎn)率有顯著影響；而當(dāng)加酶量為8 U/g、反應(yīng)pH5.5固定不變時(shí)，B小于50 ℃，C小于16 h時(shí)，等高線較密集，表明在此范圍內(nèi)B和C的交互作用對DP4產(chǎn)率的影響顯著；當(dāng)固定加酶量8 U/g、反應(yīng)時(shí)間16 h時(shí)，B小于50 ℃，D小于5.5時(shí)，等高線較密集，表明在此范圍內(nèi)B和D的交互作用對DP4產(chǎn)率的影響顯著。以上結(jié)果與方差分析的結(jié)果一致。

圖10 加酶量和反應(yīng)pH、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和反應(yīng)pH的交互作用對DP4產(chǎn)率的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.10 Response surface and contour plots of the interaction effect between enzyme addition and reaction pH values, reaction temperature and reaction time, reaction temperature and reaction pH values on the yield of DP4

2.4.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 通過響應(yīng)面試驗(yàn)所獲得的GOS產(chǎn)率和DP4產(chǎn)率的二次回歸數(shù)學(xué)模型進(jìn)行分析，其結(jié)果顯示，低聚半乳糖合成最佳工藝為：加酶量8.253 U/g、反應(yīng)溫度 49.244 ℃、反應(yīng)時(shí)間 16.011 h、反應(yīng)pH5.616。在此工藝下，GOS產(chǎn)率預(yù)測值為14.692%，DP4產(chǎn)率預(yù)測值為3.334%。為了驗(yàn)證響應(yīng)面結(jié)果的準(zhǔn)確性，采用上述低聚半乳糖合成工藝進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，為方便實(shí)際操作，將條件調(diào)整為加酶量8.25 U/g、反應(yīng)溫度49 ℃、反應(yīng)時(shí)間16 h、反應(yīng)pH5.6，測定GOS產(chǎn)率及DP4產(chǎn)率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果表明GOS產(chǎn)率為14.61%±0.19%，DP4產(chǎn)率為3.31%±0.15%，與理論值相差不大，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型切合度較好。因此，此響應(yīng)面所獲得的低聚半乳糖合成工藝準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)論

本研究在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以GOS產(chǎn)率和DP4產(chǎn)率為響應(yīng)值，對低聚半乳糖合成工藝進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，并建立了響應(yīng)值和各個(gè)因素之間的數(shù)學(xué)模型。此模型能夠較好地預(yù)測GOS產(chǎn)率及DP4產(chǎn)率，通過實(shí)驗(yàn)與模型驗(yàn)證，很好地證明了模型的可靠性，并得到低聚半乳糖合成最佳工藝：加酶量8.25 U/g、反應(yīng)溫度49 ℃、反應(yīng)時(shí)間16 h、反應(yīng)pH5.6。在此條件下，GOS產(chǎn)率達(dá)到14.61%±0.19%，DP4產(chǎn)率為3.31%±0.15%。結(jié)果表明，優(yōu)化后的工藝參數(shù)具有可行性，能夠在提高GOS總產(chǎn)率的前提下，有效地選擇性提高了DP4產(chǎn)率，這可為高聚合度低聚半乳糖的定向合成及功能性應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)，有望為功能性低聚糖類特醫(yī)食品的研發(fā)提供一定的數(shù)據(jù)參考。

本研究僅在實(shí)驗(yàn)室水平考察了選擇性提高高聚合度GOS的工藝參數(shù)優(yōu)化，而對β-半乳糖苷酶的高效利用尚缺乏深入研究，導(dǎo)致反應(yīng)過程中酶及底物的利用率不高。因此，后續(xù)將進(jìn)一步開展β-半乳糖苷酶活性強(qiáng)化研究及酶固定化工藝研究[30-32]，提高酶及底物利用率，以期達(dá)到更高的生產(chǎn)效率。