于 博 車成日 林星（延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，延吉 133002）

肺癌是全球最常見癌癥之一，且致死率最高。每年新增確診患者約180萬，死亡人數(shù)達(dá)160萬。盡管肺癌治療方法不斷更新，但由于其高轉(zhuǎn)移性及原發(fā)性或獲得性耐藥，肺癌患者五年生存率僅為15%左右［1-2］。腫瘤微環(huán)境是促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素。腫瘤微環(huán)境中眾多的浸潤炎癥細(xì)胞中，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages，TAMs）最為豐富，占總數(shù)的30%～50%。惡性腫瘤中的TAMs傾向于M2型極化，從而抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答，促進(jìn)腫瘤侵襲遷移［3-4］。南蛇藤素（celastrol，CEL）是一種提取于傳統(tǒng)中藥雷公藤根部的天然五環(huán)三萜類化合物，具有抗炎、抗氧化等藥理作用［5］。研究表明CEL能夠通過多種信號通路抑制胰腺癌和肺癌增殖、黏附、侵襲、遷移等［6-7］。但CEL是否可通過調(diào)控TAMs極化影響肺癌化療敏感性有待進(jìn)一步研究。本研究旨在探討CEL通過影響M2型巨噬細(xì)胞極化提高人肺癌細(xì)胞A549對順鉑敏感性的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料人肺癌細(xì)胞株A549、巨噬細(xì)胞RAW264.7購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；CEL購自上海源葉生物科技有限公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒購自索萊寶；Easy Pure Viral DNA/RNA Kit購自Transgen Biotech；LY-294002購自貝博生物有限公司；CD163（93498）、p-PI3K（64326）、PI3K（2537）、

p-AKT（5831）、AKT（53270）、Bcl2（15071）、Bax（5023）和GAPDH（5174）抗體購自Cell Signaling Technology；電泳儀及電泳槽購自美國E-C Apparatus Corporation；全波長酶標(biāo)儀、Western blot轉(zhuǎn)膜儀和Gel Doc凝膠成像儀購自美國Bio-Rad。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期RAW264.7細(xì)胞和A549細(xì)胞，以2×104個(gè)/孔接種于96孔板，細(xì)胞生長至70%左右融合時(shí)，加入不同濃度CEL（0、10、20、40、80、100 nmol/L），24 h后10μl/孔加入CCK-8試劑，2 h后測定450 nm處吸光度（OD）。

1.2.2 巨噬細(xì)胞M2型極化誘導(dǎo)取對數(shù)生長期RAW264.7細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，加入IL-4/IL-13（20 ng/ml）處理48 h誘導(dǎo)M2極化，qRT-PCR和細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)。

1.2.3 qRT-PCR RAW264.7經(jīng)極化誘導(dǎo)后，給予40 nmol/L CEL處理24 h，收集并純化所有RNA，合成cDNA，采用Bio-Rad SYBR Premix進(jìn)行qRT-PCR分析。MRC1、Arg1、Actin的鼠引物序列見表1，以Actin為內(nèi)參。PCR循環(huán)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃5 s，60℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。

表1 qRT-PCR引物Tab.1 Primers for qRT-PCR

1.2.4 細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)RAW264.7細(xì)胞接種于6孔板，經(jīng)IL-4/IL-13誘導(dǎo)極化后，給予40 nmol/L CEL處理24 h，4%多聚甲醛固定30 min，3%Triton-X 100孵 育10 min，5%BSA封 閉，加 入CD163抗 體（1∶100）孵育2 h，PBS清洗，加入FITC標(biāo)記的熒光二抗（1∶500）室溫孵育1 h，含DAPI封片液封片，熒光顯微鏡拍照。

1.2.5 Western blot收集細(xì)胞碎片進(jìn)行裂解，每孔30μg蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE電泳（120 V，90 min），根據(jù)分子量分離蛋白，轉(zhuǎn)至PVDF膜（300 mA，60 min），5%脫脂奶粉TBST緩沖液室溫封閉2 h，分別加入抗體p-PI3K（1∶2 000）、PI3K（1∶2 000）、p-AKT（1∶2 000）、AKT（1∶2 000）、Bcl-2（1∶3 000）、Bax（1∶2 000）和GAPDH（1∶3 000）室溫孵育2 h，TBST清洗3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔和羊抗鼠二抗（1∶8 000）室溫孵育2 h，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.2.6 CEL對A549細(xì)胞順鉑敏感性的影響將A549細(xì)胞分為對照組、CEL組、M2組（A549細(xì)胞與M2型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)）、M2+CEL組（A549細(xì)胞與CEL處理的M2型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)）和M2+LY-294002組（A549細(xì)胞與LY-294002處理的M2型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)），將不同組A549細(xì)胞接種于96孔板，80μmol/L順鉑處理24 h，CCK-8檢測細(xì)胞活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Graphpad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以xˉ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CEL對RAW264.7細(xì)胞和A549細(xì)胞活性的影響當(dāng)CEL達(dá)到80 nmol/L時(shí)抑制RAW264.7細(xì)胞活性，但對A549細(xì)胞活性無影響（圖1）。因此，為排除CEL對RAW264.7細(xì)胞活性的影響，選擇40 nmol/L進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 CEL對RAW264.7細(xì)胞和A549細(xì)胞活性的影響Fig.1 Effect of CEL on cell viabilities of RAW264.7 and A549 cells

2.2 CEL對RAW264.7細(xì)胞M2型標(biāo)志物MRC1和Arg1 mRNA水平的影響與對照組相比，IL-4/13組RAW264.7細(xì)胞MRC1和Arg1 mRNA水平 明 顯升高，與IL-4/13組相比，CEL組RAW264.7細(xì)胞MRC1和Arg1 mRNA水平顯著降低（圖2）。

圖2 CEL對RAW264.7細(xì)胞M2型標(biāo)志物MRC1和Arg1 mRNA水平的影響Fig.2 Effect of CEL on mRNA expressions of M2-type markers MRC1 and Arg1 of RAW264.7 cells

2.3 CEL對RAW264.7細(xì)胞M2型標(biāo)志物CD163蛋白表達(dá)的影響免疫熒光檢測CD163表達(dá)，結(jié)果表明，IL-4/13組RAW264.7細(xì)胞CD163表達(dá)明顯高于對照組，而CEL處理后，細(xì)胞CD163表達(dá)低于IL-4/13組（圖3）。

圖3 CEL對RAW264.7細(xì)胞M2型標(biāo) 志物CD163蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of CEL on M2-type marker CD163 protein expression in RAW264.7 cells

2.4 CEL對RAW264.7細(xì) 胞PI3K/AKT的 影 響Western blot檢測PI3K/AKT蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，IL-4/13組RAW264.7細(xì) 胞p-PI3K和p-AKT表 達(dá) 明顯高于對照組，而加入CEL后p-PI3K和p-AKT表達(dá)下降，表明CEL能夠抑制M2型巨噬細(xì)胞PI3K/AKT信號通路（圖4A）。為進(jìn)一步探討CEL是否通過PI3K/AKT信號通路抑制M2型極化，M2型巨噬細(xì)胞中加入LY-294002阻滯PI3K/AKT信號通路，qRTPCR檢 測MRC1和Arg1水 平，結(jié) 果 與CEL作 用 類似，LY-294002也能抑制MRC1和Arg1 mRNA表達(dá)（圖4B）。

圖4 CEL對RAW264.7細(xì)胞PI3K/AKT的影響Fig.4 Effect of CEL on PI3K/AKT of RAW264.7 cells

2.5 CEL對A549細(xì)胞順鉑敏感性的影響IL-4/13組細(xì)胞活性明顯高于對照組，而加入CEL或LY-294002后，IL-4/13組細(xì)胞活性明顯降低，表明CEL能夠增強(qiáng)A549細(xì)胞對順鉑的化療敏感性（圖5）。

圖5 CEL對A549細(xì)胞順鉑敏感性的影響Fig.5 Effect of CEL on cisplatin sensitivity of A549 cells

2.6 CEL對順鉑誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡的影響A549細(xì)胞與M2型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，分別加入40 nmol/L CEL和10μmol/L LY-294002，24 h后給予10μmol/L順鉑孵育24 h，收集細(xì)胞提取蛋白，Western blot檢測細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與對照組比較，IL-4/13組細(xì)胞Bcl-2表達(dá)升高而Bax表達(dá)下降，與IL-4/13組相比，CEL和LY-294002處理后Bcl-2表達(dá)下降而Bax表達(dá)升高（P＜0.01，圖6）。表明CEL可促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡。

圖6 CEL對順鉑誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡的影響Fig.6 Effect of CEL on cisplatin-induced apoptosis in A549 cells

3 討論

肺癌臨床治療仍以手術(shù)治療和化療為主要方案，原發(fā)性或獲得性耐藥是肺癌患者治療失敗和復(fù)發(fā)的主要原因之一。由于標(biāo)準(zhǔn)抗癌療法療效較差及副作用嚴(yán)重，天然藥物成為新的研究熱點(diǎn)。大量研究表明，CEL在體內(nèi)外均具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性。但相關(guān)研究通常強(qiáng)調(diào)CEL對腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的直接影響，關(guān)于CEL是否可影響腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞極化從而影響肺癌細(xì)胞化療敏感性的研究尚未見報(bào)道。

腫瘤進(jìn)展伴隨微環(huán)境改變。TAMs是腫瘤微環(huán)境的重要組成，也是腫瘤進(jìn)展的主要原因。研究表明，M2型巨噬細(xì)胞具有抗炎、抗腫瘤、促進(jìn)腫瘤免疫逃逸等作用［8］。因此，調(diào)節(jié)M2型TAMs可能是腫瘤治療的潛在方法。CEL能夠通過阻滯M2型巨噬細(xì)胞極化抑制小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1肺轉(zhuǎn)移。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，40 nmol/L CEL能夠明顯抑制M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物mRNA和蛋白表達(dá)。

越來越多研究表明多種細(xì)胞信號通路參與巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。因此，本研究進(jìn)一步探索了CEL抑制M2型巨噬細(xì)胞極化的潛在機(jī)制。ZHAO等［9］表明巨噬細(xì)胞清道夫受體1通過激活PI3K/AKT/GSK3β/β-catenin通路促進(jìn)M2型極化。此外，ZHU等［10］報(bào)道CEL通過阻斷PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制膠質(zhì)瘤血管模擬形成和血管生成。本研究顯示，CEL顯著降低M2型巨噬細(xì)胞p-PI3K和p-AKT水平，且CEL與LY-294002均能抑制M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志 物MRC1和Arg1 mRNA表達(dá)，表明CEL通過PI3K/AKT信號通路抑制巨噬細(xì)胞M2型極化。

順鉑是肺癌的主要化療藥物之一，通過誘導(dǎo)DNA損傷和凋亡抑制腫瘤生長，但順鉑耐藥已成為高效治療的主要障礙［11-12］。WEI等［13］研究表明，M2型巨噬細(xì)胞能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞對5-氟尿嘧啶耐藥。因此，基于CEL對M2型巨噬細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)作用，課題組進(jìn)一步研究了CEL對A549順鉑敏感性的作用，結(jié)果表明CEL能夠抑制M2型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的A549細(xì)胞對順鉑的耐藥性，且LY-294002與CEL作用相同。

綜上所述，CEL通過PI3K/AKT信號通路抑制M2型巨噬細(xì)胞極化，從而提高A549細(xì)胞對順鉑的敏感性。