謝景春，趙玥，黃立慧，程祿萍，金奇，謝保平*（.于都縣人民醫(yī)院燒傷整形外科，江西 贛州99；.贛南醫(yī)學(xué)院心腦血管疾病防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 贛州 000；.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院信息科，江西贛州 000；.贛南醫(yī)學(xué)院科研處，江西 贛州 000）

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是骨骼代謝失衡導(dǎo)致的疾病，其特征是骨量減少和骨組織微結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致骨密度下降，骨脆性和骨折發(fā)生概率升高[1-2]。破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞功能失衡是OP的重要發(fā)病機(jī)制，其中破骨細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)唯一具有骨吸收功能的多核巨噬細(xì)胞。因此，破骨細(xì)胞常被作為抗OP 藥物研發(fā)和機(jī)制研究的靶細(xì)胞[3]。

雌激素受體（estrogen receptor，ER）是雌激素和植物雌激素（phytoestrogen，PE）抗骨質(zhì)疏松作用的主要靶點(diǎn)，特別是ERα。李偉娟等[4]報(bào)道淫羊藿苷通過ERα/RANK 信號(hào)通路抑制RANKL 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化和骨吸收功能。Xie 等[5]研究發(fā)現(xiàn)齊墩果酸上調(diào)ERα的表達(dá)，并通過ERα/miR-503/RANK 通路抑制破骨細(xì)胞分化和骨吸收功能。提示ERα信號(hào)通路在破骨細(xì)胞分化和抗OP 中扮演了重要的角色。

杯莧甾酮（結(jié)構(gòu)見圖1）是川牛膝中抗OP 的有效成分之一，有研究表明杯莧甾酮可顯著增加去卵巢SD 大鼠脛骨的骨密度和最大應(yīng)力[6]。紀(jì)親龍等[7]研究顯示，杯莧甾酮能顯著抑制M-CSF 和RANKL 誘導(dǎo)的小鼠源性單核巨噬細(xì)胞（BMMs）向破骨細(xì)胞分化。然而，未見杯莧甾酮抑制破骨細(xì)胞分化和抗OP 的機(jī)制研究，特別是在ER 信號(hào)通路上的研究。因此，本研究擬用MCF-7 細(xì)胞證實(shí)杯莧甾酮的擬雌激素樣作用，并用ER 競(jìng)爭(zhēng)性阻斷劑ICI 阻斷ER，用TRAP 染色、qRT-PCR、Western blot 和分子對(duì)接等方法證實(shí)杯莧甾酮通過ER 信號(hào)通路抑制破骨細(xì)胞分化的機(jī)制，為杯莧甾酮抗OP 的臨床應(yīng)用提供參考。

圖1 杯莧甾酮化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig 1 Chemical structure of cyasterone

1 材料

1.1 儀器

Varioskan Lux 型酶標(biāo)儀、ABI7500 型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀、240i 型培養(yǎng)箱、ST-16R 型離心機(jī)（Thermo Fisher Scientific 公司），HWS12型恒溫水浴鍋（上海一恒），EVOSFLCORE 型倒置顯微鏡（Life Technologies 公司），TS-1 型水平脫色搖床、Vortex-6 型旋渦混合器（江蘇其林貝爾），UVP/Chemstudio 型多功能化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Analytik Jena AG 公司），Trans-Blot 蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（Bio-Rad 公司）。

1.2 試藥

杯莧甾酮對(duì)照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)：A0699-20 mg，純度≥98.83%）；ICI182780（Selleckchem 公司，批號(hào)：S119117，純度≥99%）；TRizol 提取試劑（Life Technology公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Fisher Scientific公司，批號(hào)：00592018）；ERα抗體和GAPDH抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)分別為21244-1-AP 和10494-1-AP）；DMEM 高糖培養(yǎng)基（上海中喬新舟生物技術(shù)有限公司）；RANKL 誘導(dǎo)因子（PEPROTECH 公司，批號(hào)：0815612）；αMEM 完全培養(yǎng)基和無(wú)酚紅αMEM 培養(yǎng)基（武漢普諾賽生命科技有限公司）；青霉素和鏈霉素（北京索萊寶科技有限公司）；CCK-8 試劑（Biosharp生物科技有限公司）；TRAP 染色試劑盒（Sigma公司）；碳吸附胎牛血清（上海傳秋生物，HTFBS-500）；NovoStart? SYBR Green Color qPCR Super Mix（Novoprotein 公司，批號(hào)：0513471）。

1.3 細(xì)胞

小鼠白血病巨噬細(xì)胞RAW264.7（上海中喬新舟生物技術(shù)有限公司）和人乳腺癌細(xì)胞MCF-7（武漢普諾賽生命科技有限公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

RAW264.7 細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS 和1%青霉素/鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基中。在37℃和5%CO2條件下培養(yǎng)，每?jī)扇論Q液一次，取傳代培養(yǎng)3 代的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞毒性檢測(cè)

將RAW264.7 細(xì)胞接種在96 孔板中，每孔3×103個(gè)。實(shí)驗(yàn)分為空白組、各濃度（0.1、1、2.5、5、10、100 μmol·L－1）杯莧甾酮組。培養(yǎng)24 h 后，按分組給藥處理48 h，每孔加入10 μL CCK-8 試劑，37 ℃避光孵育2 h 后，采用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔的光密度（OD），計(jì)算細(xì)胞增殖率：細(xì)胞增殖率（%）＝（OD實(shí)驗(yàn)組－OD空白溶劑組）/（OD空白組－OD空白溶劑組）×100%。

2.3 杯莧甾酮對(duì)RAW264.7 細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的影響

將RAW264.7 細(xì)胞接種在96 孔板中，每孔3×103個(gè)。實(shí)驗(yàn)分為空白組、模型組、不同濃度（2.5、5、10 μmol·L－1）杯莧甾酮組，并根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[4]，選用雌激素受體阻斷劑ICI 濃度為1μmol·L－1，再設(shè)置模型組，ICI 組和杯莧甾酮（5μmol·L－1）＋I(xiàn)CI 組，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。用50 ng·mL－1RANKL 和各濃度的藥物/培養(yǎng)基處理各組細(xì)胞5 d，每?jī)扇論Q液一次；按TRAP 染色試劑盒說(shuō)明書方法進(jìn)行染色；在顯微鏡下觀察和拍照，統(tǒng)計(jì)每組破骨細(xì)胞數(shù)目。

2.4 qRT-PCR 檢測(cè)破骨細(xì)胞分化相關(guān)基因TRAP、RANK 和ERα 的表達(dá)

將RAW264.7 細(xì)胞接種在24 孔板中（每孔1×104個(gè)細(xì)胞）。常規(guī)培養(yǎng)24 h 后，將RAW264.7細(xì)胞分為空白組、模型組、不同濃度（2.5、5、10 μmol·L－1）杯莧甾酮組，每組均設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。按“2.3”項(xiàng)下方法誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞并加藥處理，誘導(dǎo)5 d 后采用Trizol法提取細(xì)胞中總RNA，用核酸蛋白儀檢測(cè)每組細(xì)胞中總RNA 的濃度和質(zhì)量后，取1 μg 總RNA按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書方法逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以cDNA 為模板，按PCR 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行擴(kuò)增。以GAPDH作為內(nèi)參，破骨細(xì)胞分化相關(guān)基因TRAP、RANK和ERα的mRNA 表達(dá)水平。引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小見表1。

表1 qRT-PCR 所需的引物序列Tab 1 Primer sequences for qRT-PCR

2.5 破骨細(xì)胞中ERα 蛋白表達(dá)水平測(cè)定

采用Western blot 法進(jìn)行檢測(cè)。將RAW264.7細(xì)胞種植于6 孔板（4×104個(gè)/孔）中，培養(yǎng)12 h后，按“2.3”項(xiàng)下方法分組和誘導(dǎo)處理，每?jī)扇論Q液一次，誘導(dǎo)5 d 后，用RIPA 蛋白裂解液提取總蛋白，用BCA 法測(cè)蛋白濃度，99℃變性15 min，并置于－20℃冰箱保存?zhèn)溆?。蛋白在SDS-PAGE凝膠中電泳；然后轉(zhuǎn)至PVDF 膜，以5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；用ERα一抗和GAPDH 一抗，4℃孵育過夜；用TBST 清洗3 次，每次15 min，加入HRP 標(biāo)記二抗，室溫孵育1 h；TBST 清洗3 次，每次15 min，加入高敏ECL 化學(xué)發(fā)光顯色底物、UVP/Chemstudio 型多功能化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中成像，然后采用Image J（v1.8.0）軟件測(cè)定各蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白和內(nèi)參GAPDH 蛋白條帶的灰度值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

2.6 杯莧甾酮擬雌激素樣實(shí)驗(yàn)

MCF-7 細(xì)胞培養(yǎng)于無(wú)酚紅αMEM 完全培養(yǎng)基（含5% HT-FBS 和1%青霉素/鏈霉素）中培養(yǎng)2 d，以耗盡內(nèi)源性的擬雌激素[8]，取傳代培養(yǎng)3 代的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，將MCF-7 細(xì)胞種植于96 孔板，并根據(jù)杯莧甾酮對(duì)RAW264.7 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分為空白組、各濃度（0.01、0.1、1、2.5、5、10 μmol·L－1）杯莧甾酮組以及空白組＋I(xiàn)CI（1μmol·L－1）組、杯莧甾酮（5 μmol·L－1）＋I(xiàn)CI（1 μmol·L－1）組，每組平行設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔，用CCK-8 試劑檢測(cè)杯莧甾酮對(duì)MCF-7 細(xì)胞增殖的影響，方法同“2.2”項(xiàng)下。將MCF-7 細(xì)胞接種在24孔板中（每孔1×104個(gè)細(xì)胞）培養(yǎng)24 h 后，分為空白組、各濃度（2.5、5、10 μmol·L－1）杯莧甾酮組，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，各組細(xì)胞加入相應(yīng)藥液/培養(yǎng)基處理2 d 后，按“2.4”項(xiàng)下方法檢測(cè)細(xì)胞中ERαmRNA 表達(dá)水平。將MCF-7 細(xì)胞接種在6 孔板中（每孔1×105個(gè)細(xì)胞）。培養(yǎng)24 h 后，分為空白組和杯莧甾酮（5 μmol·L－1）組，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。各組細(xì)胞加入相應(yīng)藥液/培養(yǎng)基處理2 d 后，按“2.5”項(xiàng)下方法檢測(cè)細(xì)胞中ERα蛋白表達(dá)水平。

2.7 杯莧甾酮與雌激素受體模擬對(duì)接

分子對(duì)接用Moe.2019 將杯莧甾酮與ERα（PDB：1ERE）對(duì)接，首先檢查蛋白序列完整性，特別是對(duì)接口袋蛋白完整性，并對(duì)蛋白進(jìn)行加氫加電荷和能量最小化處理，將杯莧甾酮分子能量最小化后進(jìn)行構(gòu)型搜索；然后選擇分子與蛋白對(duì)接模式，將構(gòu)象搜索后得的杯莧甾酮與能量最小化后的1ERE 蛋白在雌激素作用口袋處進(jìn)行模擬對(duì)接，觀察小分子和蛋白的相互作用位點(diǎn)。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用 SPSS 17.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用（±s）表示，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。各組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，方差齊時(shí)采用單因素方差分析，Students't檢驗(yàn)；方差不齊時(shí)采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 杯莧甾酮對(duì)RAW264.7 和MCF-7 細(xì)胞增殖的影響

與空白組相比，杯莧甾酮100 μmol·L－1顯著抑制RAW264.7 細(xì)胞的增殖（P＜0.01），其他濃度的杯莧甾酮對(duì)RAW264.7 細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響，結(jié)果見圖2。因此，選用2.5、5、10 μmol·L－1用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 杯莧甾酮對(duì)RAW264.7 細(xì)胞增殖的影響Fig 2 Effect of cyasterone on the proliferation of RAW264.7 cells

3.2 杯莧甾酮抑制破骨細(xì)胞分化及其相關(guān)基因的表達(dá)

與模型組相比，各濃度的杯莧甾酮顯著抑制RANKL 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞（P＜0.001）。qRT-PCR 和Western blot 結(jié)果表明，與空白組相比，模型組TRAP 和RANK 表達(dá)顯著增加，提示破骨細(xì)胞誘導(dǎo)成功。與模型組相比，各濃度的杯莧甾酮顯著抑制TRAP和RANK表達(dá)，且杯莧甾酮（5、10 μmol·L－1）顯著上調(diào)ERαmRNA 和蛋白水平的表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），并具有劑量依賴性，提示杯莧甾酮可能具有擬雌激素樣作用，可通過ER 信號(hào)抑制破骨細(xì)胞分化（見圖3）。

圖3 杯莧甾酮對(duì)破骨細(xì)胞分化（A）及其相關(guān)基因和蛋白表達(dá)（B）的影響Fig 3 Effect of cyasterone on the differentiation of osteoclasts（A）and expression of related genes and protein（B）

3.3 杯莧甾酮具有擬雌激素樣作用

與空白組相比，5、10 μmol·L－1杯莧甾酮顯著促進(jìn)MCF-7 細(xì)胞的增殖（見圖4A，P＜0.05），用ER 受體阻斷劑ICI 阻斷雌激素受體后，與杯莧甾酮（5 μmol·L－1）組相比，杯莧甾酮（5μmol·L－1）＋I(xiàn)CI（1 μmol·L－1）抑制MCF-7 細(xì)胞的增殖（P＜0.01），提示杯莧甾酮具有擬雌激素樣作用。qRT-PCR 和Western blot 檢測(cè)結(jié)果表明，與空白組相比，各組杯莧甾酮顯著促進(jìn)ERαmRNA 水平的表達(dá)，并具有劑量依賴性（P＜0.05，P＜0.01），且杯莧甾酮（5 μmol·L－1）上調(diào)ERα蛋白水平的表達(dá)（P＜0.05），見圖4B。表明杯莧甾酮（5、10 μmol·L－1）具有擬雌激素樣作用，因此選擇杯莧甾酮（5 μmol·L－1）用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖4 杯莧甾酮對(duì)MCF-7 細(xì)胞增殖（A）和ERα 表達(dá)（B）的影響Fig 4 Effect of cyasterone on the proliferation of MCF-7 cells（A）and ERα expression（B）

3.4 杯莧甾酮與ERα 模擬對(duì)接

為了進(jìn)一步驗(yàn)證杯莧甾酮的擬雌激素樣作用，我們采用分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)杯莧甾酮與17-β雌二醇具有相同的作用位點(diǎn)是在Glu-353 和His-524（見圖5A、圖5B）。此外，杯莧甾酮在17-β雌二醇作用口袋還有Ala-350、Met-388 和Met-421 等作用位點(diǎn)（見圖5B），進(jìn)一步證實(shí)了杯莧甾酮具有擬雌激素樣作用，提示杯莧甾酮可能通過ER信號(hào)通路抑制破骨細(xì)胞分化。

圖5 杯莧甾酮與ERα 分子對(duì)接Fig 5 Molecular docking of cyasterone and ERα

3.5 杯莧甾酮通過ERα 信號(hào)通路抑制破骨細(xì)胞分化

采用TRAP 染色和qRT-PCR 檢測(cè)ICI 阻斷ER 后，杯莧甾酮對(duì)破骨細(xì)胞分化及其相關(guān)基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明，與模型組相比，杯莧甾酮（5 μmol·L－1）顯著抑制破骨細(xì)胞的分化，以及TRAP和RANKmRNA 水平的表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01）；與杯莧甾酮組相比，杯莧甾酮＋I(xiàn)CI 組抑制破骨細(xì)胞分化的作用顯著降低，上調(diào)TRAP和RANKmRNA 水平的表達(dá)（P＜0.01），證實(shí)杯莧甾酮可能是通過ER 信號(hào)通路抑制破骨細(xì)胞的分化（見圖6）。

圖6 ICI 對(duì)杯莧甾酮抑制破骨細(xì)胞分化及其相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig 6 Effect of ICI on cyasterone inhibiting the osteoclast differentiation

4 討論

雌激素分泌不足是婦女絕經(jīng)后誘發(fā)OP 的主要原因。因此，雌激素替代療法是治療絕經(jīng)后OP 的主要方法。近年來(lái)，大量研究發(fā)現(xiàn)諸多中藥含有PE，有擬雌激素樣作用，具有療效好、副作用小、效優(yōu)價(jià)廉的特點(diǎn)，并應(yīng)用于OP 的治療[9]。杯莧甾酮是一類甾體化合物，具有植物雌激素β-蛻皮甾酮相似的結(jié)構(gòu)[10]。因此，本研究首先用MCF-7 細(xì)胞證實(shí)了杯莧甾酮（5、10 μmol·L－1）促進(jìn)MCF-7 細(xì)胞的增殖，上調(diào)ERαmRNA 和蛋白水平的表達(dá)，且雌激素受體競(jìng)爭(zhēng)性阻斷劑ICI可阻斷該作用，證實(shí)了杯莧甾酮具有擬雌激素樣作用。其中，MCF-7 細(xì)胞是ER 陽(yáng)性表達(dá)的人源乳腺癌細(xì)胞，是PE 和擬雌激素藥物研究的主要靶細(xì)胞，一般來(lái)說(shuō)，具有擬雌激素樣作用的藥物可以顯著促進(jìn)MCF-7 細(xì)胞的增殖及其相關(guān)基因（ERα和ERβ）的表達(dá)[11-12]。

ER 是雌激素和PE 作用的直接靶點(diǎn)，特別是在破骨細(xì)胞和OP 中，ERα是發(fā)揮作用的主要靶點(diǎn)，有研究表明，在ERα敲除的去卵巢大鼠中，雌激素?zé)o抗OP 作用，不能減少去卵巢大鼠骨丟失，而在敲除ERβ的去卵巢大鼠中，雌激素具有骨保護(hù)作用，且效果和對(duì)照組無(wú)差異[13-15]。本研究通過TRAP 染色和qRT-PCR、Western blot 檢測(cè)證實(shí)杯莧甾酮顯著抑制RANKL 誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞和TRAP、RANK基因的表達(dá)，上調(diào)ER 信號(hào)通路上關(guān)鍵靶點(diǎn)ERα基因和蛋白水平的表達(dá)，而ICI 阻斷杯莧甾酮對(duì)破骨細(xì)胞分化的抑制效應(yīng)。此外，分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)杯莧甾酮與17-β雌二醇具有相同的作用位點(diǎn)是在Glu-353 和His-524，且杯莧甾酮在17-β雌二醇作用口袋還有Ala-350、Met-388 和Met-421 等作用位點(diǎn)，因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明杯莧甾酮可能是通過ER 通路抑制破骨細(xì)胞的分化，且ERα是杯莧甾酮的作用靶點(diǎn)。