蘭 波,陳 建,陰長發(fā),李湘民,楊迎青
(江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所,江西 南昌 330200)
水稻稻瘟病是一種世界性的重要真菌病害,在病害流行的年份嚴(yán)重影響水稻產(chǎn)量和稻米品質(zhì),嚴(yán)重地區(qū)甚至顆粒無收[1]。選育和利用抗病水稻品種是防治稻瘟病最有效的措施,但稻瘟病菌生理小種不斷變化且變異較快,育成的抗病水稻品種通常在種植3~5年后極易喪失抗性[2]。因此,稻瘟病抗性鑒定工作對(duì)水稻品種的安全布局來說是一項(xiàng)極其重要的工作,只有在水稻育種的源頭明確水稻品種的抗性,才能在實(shí)際生產(chǎn)中選擇抗性好的品種,減少稻瘟病造成的損失[3]。
稻瘟病抗性鑒定主要有田間自然誘發(fā)鑒定與室內(nèi)人工鑒定這2種方法,田間自然誘發(fā)鑒定的稻瘟病菌更符合當(dāng)?shù)鼐旱膶?shí)際情況,且操作簡單實(shí)用,但該方法往往由于當(dāng)年氣候環(huán)境等因素而影響鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性;而室內(nèi)稻瘟病鑒定相對(duì)可以人為地控制溫度、濕度等稻瘟病發(fā)病條件,從而充分保證抗性鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性,但室內(nèi)稻瘟病鑒定的一個(gè)關(guān)鍵因素是稻瘟病菌的選擇,鑒定菌株的篩選必須能夠代表某一地區(qū)菌群的組成情況,這樣才能真實(shí)地測(cè)定水稻品種在該地區(qū)的抗性水平。因此有效地篩選具有代表性的鑒定菌系是稻瘟病抗性鑒定特別是穗頸瘟抗性鑒定成功的關(guān)鍵。我國學(xué)者根據(jù)當(dāng)?shù)貙?shí)際情況選擇不同的稻瘟病抗性鑒定方法開展了水稻種植品種或抗病資源品系稻瘟病的抗性鑒定,為當(dāng)?shù)睾Y選并獲得了豐富的抗病品種(系)。郝中娜等[4]采用人工接種和自然誘發(fā)鑒定方法鑒定了2013~2017年我國長江中下游稻區(qū)水稻品種區(qū)域試驗(yàn)的800個(gè)秈稻參試品種的稻瘟病抗性。鄢圣敏等[5]利用自然病圃誘發(fā)鑒定了9283份水稻品種的稻瘟病抗性,并發(fā)現(xiàn)供試材料的葉瘟與頸瘟表現(xiàn)呈顯著正相關(guān)。李湘民等[6]采用生態(tài)多點(diǎn)分批播種法、離體穗段點(diǎn)滴接種法、活體穗苞注射接種法這3種稻瘟病抗性鑒定方法評(píng)價(jià)了江西省種植面積較大且抗性差異較明顯的9個(gè)早稻品種的抗性水平。
傳統(tǒng)的稻瘟病抗性鑒定菌株篩選是通過苗期接種某些水稻鑒別品系后的抗致病型來確定的,但到目前為止還沒有一套統(tǒng)一的稻瘟病菌鑒別寄主,這為抗性鑒定菌系的選擇帶來了困難。早在1961年日本學(xué)者根據(jù)各水稻品種對(duì)稻瘟病菌株的反應(yīng)型確立了第一套稻瘟病菌小種鑒別品種[7]。在20世紀(jì)60年代中期,美、日兩國合作研究篩選出一套由8個(gè)秈、粳稻品種組成的國際鑒別品種,但其抗性基因組成不明且小種鑒別力低因而未得到廣泛應(yīng)用[8]。在20世紀(jì)70年代,日本學(xué)者山田等[10]根據(jù)Flor[9]的基因?qū)驅(qū)W說,篩選出一套基于抗性基因分析的9個(gè)粳稻“單基因”鑒別品種。我國學(xué)者于1980年篩選出特特普、珍龍13、四豐43、東農(nóng)363、關(guān)東51、合江18和麗江新團(tuán)黑谷(LTH)等7個(gè)水稻品種作為中國稻瘟病菌小種鑒別品種,但因其抗性基因組成不明,小種鑒別力低,在國內(nèi)特別是北方粳稻區(qū)的應(yīng)用受到局限[11-12]。凌忠專等[13-14]以普感品種麗江新團(tuán)黑谷(LTH)為輪回親本,選育出6個(gè)單基因近等基因系(LTH-NIL)。2000年,IRRI與日本國際農(nóng)業(yè)科學(xué)研究中心(JIRCAS)合作,將24個(gè)稻瘟病抗性基因?qū)氲絃TH背景,育成31個(gè)單基因系(LTH-monogenic lines,LTH-MLs)[15-16]。前期研究報(bào)道的抗性鑒定菌株篩選都是在苗期接種以鑒別寄主反應(yīng)型來確定的,其對(duì)穗頸瘟抗性是否具有較好的鑒定能力卻無法確定。目前還沒有直接證據(jù)證明水稻對(duì)苗(葉)瘟的抗性與穗頸瘟的抗性具有正相關(guān)性。由于稻瘟病菌的毒性主要由致病基因與無毒基因控制,本研究通過特異性引物標(biāo)記測(cè)定區(qū)域稻瘟病菌群的致病基因與無毒基因情況,根據(jù)測(cè)定結(jié)果聚類劃分成不同的遺傳宗譜,再從不同的宗譜中按比例篩選菌株,組成代表該地區(qū)稻瘟病菌群的抗性鑒定菌系。通過田間自然誘發(fā)鑒定驗(yàn)證其鑒定結(jié)果,表明該方法具有高效、準(zhǔn)確、省時(shí)省力的特點(diǎn),在水稻稻瘟病特別是穗頸瘟的抗性鑒定方面有很大的應(yīng)用潛力。
在江西婺源(贛東北)、都昌(贛北部)、豐城(贛中)、井岡山(贛西南)、萬安(贛南)這5個(gè)地區(qū)稻瘟病自然病圃種植高感品種麗江新團(tuán)黑谷,在半黃熟期采集稻瘟病發(fā)病標(biāo)樣,用牛皮紙袋裝好,記錄好標(biāo)樣的采集地點(diǎn)、時(shí)間、寄主品種、采集人等信息。
取采集的稻瘟病標(biāo)樣剪成寸許,浸水18~24 h,待充分吸水后,用清水沖洗2~3次,再用滅菌水沖洗一次,放入墊有U形玻璃棒的保濕培養(yǎng)皿中,置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)2 d,觀察到標(biāo)樣上有灰色或灰綠色的孢子后,采用眉毛挑單孢法,將病部置于眉毛挑單孢顯微鏡下,挑取單個(gè)孢子在PDA斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)。純培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接到放有滅菌濾紙片的PDA培養(yǎng)基培養(yǎng),待濾紙片長滿菌絲,將菌絲挑出在無菌的羊皮紙袋中,置于-80 ℃超低溫冰箱保存(圖1)。本研究從同一地區(qū)分離保存了189個(gè)稻瘟病菌單孢菌株,編號(hào)為WY1~WY189。
圖1 稻瘟病菌濾紙片保存
將分離保存的稻瘟病菌株活化后,挑取適量菌絲接種到 PDA液體培養(yǎng)基中,置于120 r /min的搖床上28 ℃培養(yǎng)3~6 d,待菌絲體有一定量后用滅菌紗布過濾收集、烘干,于-20 ℃保存?zhèn)溆谩V髮⑹占木z體分裝于2 mL的Eppendorf管中,加2顆5 mm滅菌碳鋼珠后迅速加65 ℃預(yù)熱的CTAB提取液,應(yīng)用全自動(dòng)樣品快速研磨儀進(jìn)行磨樣,按照天根植物基因組提取試劑盒TIANGEN(DP350)說明書中的提取方法對(duì)病菌基因組的DNA進(jìn)行提取,于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
選用已公開報(bào)道且克隆的8個(gè)稻瘟病菌致病基因與8個(gè)無毒基因作為檢測(cè)目的基因,8個(gè)稻瘟病菌致病基因分別為MPG1、MPS1、MagB、CPKA、MNH1、MgYCA1、MgS11、MgATG5,8個(gè)稻瘟病菌無毒基因分別為Avr-pia、Avr-pit、Avr-pik、Avr-pi-ta、Avr-pizt、Avr-co39、ACE1、PRE1。
根據(jù)以上基因序列設(shè)計(jì)特異性引物標(biāo)記(表1)[17-19]。PCR總反應(yīng)體系為20 μL,包括DNA模板1 μL(≤200 ng)、0.2~0.4 μmol/L正、反 向 引 物各1 μL、2.5 mmol /L dNTP 0.5 μL、Taq DNA聚合酶 0.2μL、10×Buffer(含Mg2+)2 μL,ddH2O 14.3 μL。PCR反應(yīng)程序: 95 ℃預(yù)變性5 min; 94 ℃變性30 s,55~57 ℃(按引物設(shè)定溫度)退火1 min,72 ℃ 延伸60~90 s (根據(jù)片段大小而定),共35個(gè)循環(huán); 最后72 ℃延伸 10 min。將獲得的PCR產(chǎn)物保存于4 ℃冰箱,用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè),最后在凝膠成像系統(tǒng)的紫外燈下拍照保存。
表1 稻瘟病菌致病基因與無毒基因分子檢測(cè)引物序列
根據(jù)PCR擴(kuò)增條帶的結(jié)果,有條帶則記為“1”,無條帶則記為“0”,構(gòu)建基于SSR的“0-1”數(shù)據(jù)庫;應(yīng)用NTSYS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)計(jì)算遺傳距離,以菌株DNA擴(kuò)增條帶的位置相似水平為基準(zhǔn),用最長距離法對(duì)菌株群體遺傳多樣性進(jìn)行聚類分析。通過聚類可以將菌株歸類成不同的密切相關(guān)的組,每一組稱為一個(gè)遺傳宗譜;根據(jù)不同的相似系數(shù)可以劃分成不同數(shù)量的遺傳宗譜。將每個(gè)宗譜菌株占總菌株的百分比作為在抗性鑒定菌系中的百分比,隨機(jī)挑選菌株組成穗頸瘟抗性鑒定菌系。
室內(nèi)離體接種鑒定:待抗性鑒定菌系確定后,將供試的10個(gè)不同抗性水平的水稻材料在大田正常栽培,待長至孕穗破口初期,從田間每一品種的小區(qū)內(nèi)剪取20個(gè)穗長露出1~2 cm的稻穗,帶回實(shí)驗(yàn)室,剪取長約7~8 cm長的穗段(穗頸節(jié)上部2 cm,下部5~6 cm),然后將4根穗段放入鋪有雙層過濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)(每皿加2 mL的無菌水),用移液器在每根穗段的穗頸節(jié)位點(diǎn)及節(jié)下約4 cm處各滴入5 μL的孢子懸浮液。將培養(yǎng)皿放入26 ℃的光照培養(yǎng)箱中,并用透明的薄膜包被,以保持培養(yǎng)皿內(nèi)的濕度。光暗交替培養(yǎng)10~12 d。離體接種培養(yǎng)12 d后,檢查各培養(yǎng)皿穗頸的發(fā)病情況,分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下:0級(jí):無病斑;1級(jí):病斑長度不超過5 mm;3級(jí):病斑長度6~15 mm;5級(jí):病斑長度超過16 mm,但病斑間不相連;7級(jí):病斑相互連接,大部分穗段發(fā)??;9級(jí):病斑相互連接,80%以上穗段發(fā)病。將平均病級(jí)小于1的定為抗病;在1~3之間的定為中抗;在3~5之間的定為中感;在5~7之間的定為感病;大于7的定為高感??剐灶l率(%)=(抗病菌株數(shù)/總菌株數(shù))×100%。
自然病圃鑒定:將10個(gè)供試水稻品種按正常田間操作種植在抗性鑒定菌系來源地區(qū)大田,在種植過程中不施殺菌劑,待長至半黃熟期時(shí)隨機(jī)調(diào)查每個(gè)品種的31個(gè)穗,計(jì)算平均病級(jí)(按國家稻瘟病穗頸瘟分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查)以及病穗率。病穗率(%)=(發(fā)病穗數(shù)/總穗數(shù))×100%。
采用16對(duì)特異性引物標(biāo)記檢測(cè)包括8個(gè)稻瘟病菌無毒基因與8個(gè)致病基因共16個(gè)稻瘟病毒性相關(guān)基因在供試的189個(gè)稻瘟病菌中的分布情況,并計(jì)算每個(gè)基因在所有菌株中的檢測(cè)頻率。檢測(cè)結(jié)果(圖2、圖3)顯示,16個(gè)稻瘟病菌毒性相關(guān)基因在江西稻瘟病菌中的檢測(cè)頻率為0%~96.29%,存在顯著差異,其中最高檢測(cè)頻率的基因是MPG1,為96.29%,最低的是MNH1,為0%。結(jié)果表明江西稻瘟病菌遺傳結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜,存在多種不同的致病類型。
圖2 稻瘟病菌毒性相關(guān)基因的分子檢測(cè)頻率
圖3 部分稻瘟病菌無毒基因與致病基因的分子檢測(cè)結(jié)果
根據(jù) PCR 擴(kuò)增條帶的結(jié)果構(gòu)建基于SSR的“0-1”數(shù)據(jù)庫,用最長距離法對(duì)菌株群體遺傳多樣性進(jìn)行聚類分析。通過聚類結(jié)果(圖4)可知,不同的相似系數(shù)可以將江西稻瘟病菌劃分成不同的遺傳宗譜單元,本研究確定在相似系數(shù)0.75時(shí)供試的稻瘟病菌株劃分成的遺傳宗譜數(shù)較為合理,聚類結(jié)果顯示,在相似系數(shù)0.75時(shí)供試的189個(gè)稻瘟病菌株被聚類成7個(gè)遺傳宗譜(表2)。其中優(yōu)勢(shì)宗譜為L1與L4,菌株占比分別為21.69%與63.49%;其他5個(gè)宗譜為小宗譜或稀有宗譜。
圖4 稻瘟病菌致病基因與無毒基因分子檢測(cè)結(jié)果的聚類結(jié)果
表2 遺傳相似系數(shù)0.75水平下稻瘟病菌的遺傳宗譜聚類結(jié)果
根據(jù)上述聚類結(jié)果,初步確定稻瘟病抗性鑒定菌系總菌株數(shù)為20個(gè),挑選菌株的原則:將每個(gè)宗譜的稻瘟病菌株占所有菌株的百分比作為菌系中各宗譜菌株所占的百分比,隨機(jī)挑選菌株;如果宗譜總菌株數(shù)與百分比的乘積小于1,則只挑選1個(gè)作為鑒定菌株;其他宗譜按照宗譜菌株數(shù)與其占比確定篩選鑒定菌株數(shù)。本研究確定的20個(gè)稻瘟病菌株組成的抗性鑒定菌系包括L1宗譜3個(gè)、L2宗譜1個(gè)、L3宗譜1個(gè)、L4宗譜12個(gè)、L5宗譜1個(gè)、L6宗譜1個(gè)、L7宗譜1個(gè)(表3)。
表3 稻瘟病抗性鑒定菌系的篩選結(jié)果
利用篩選到的20個(gè)抗性鑒定菌系,在室內(nèi)采用離體穗段點(diǎn)滴接種法與田間自然病圃誘發(fā)鑒定2種方法對(duì)10個(gè)水稻品種進(jìn)行穗頸瘟抗性鑒定。結(jié)果(表4、圖5)顯示:源豐A、昌A、泰香A、蓮CS、昌香A、33S靚占、望S靚占、兩優(yōu)靚占、九香粘、唐S靚占這10個(gè)供試品種利用本研究篩選的抗性鑒定菌系鑒定穗頸瘟的結(jié)果分別為中感、感病、感病、中抗、抗病、高感、中感、感病、高感、抗病,與田間自然誘發(fā)鑒定結(jié)果的表現(xiàn)完全一致。鑒定結(jié)果表明利用本研究篩選的稻瘟病鑒定菌系對(duì)水稻品種的穗頸瘟抗性鑒定準(zhǔn)確度高。
圖5 抗性鑒定菌系室內(nèi)離體穗頸瘟抗性鑒定結(jié)果
表4 抗性鑒定菌系室內(nèi)鑒定與田間自然誘發(fā)鑒定的結(jié)果比對(duì)驗(yàn)證
利用抗病品種防治稻瘟病是目前最經(jīng)濟(jì)有效的方法,但隨著抗病品種大面積的持續(xù)推廣,田間稻瘟病菌生理小種在寄主品種定向選擇的壓力下會(huì)不斷變異產(chǎn)生新的致病小種,從而致使抗病品種的抗性喪失。另一方面,單一水稻品種的大面積連續(xù)推廣也會(huì)改變當(dāng)?shù)氐纳硇》N結(jié)構(gòu)以及優(yōu)勢(shì)生理小種種群,因此為克服稻瘟病菌生理小種變異帶來的病害流行,需要不斷篩選新的抗病品種并加以推廣應(yīng)用。水稻品種的推廣應(yīng)用、稻種遺傳資源的評(píng)價(jià)、抗病基因的發(fā)掘和利用等均需要一套長期穩(wěn)定且具有代表性的稻瘟病菌鑒別體系。
室內(nèi)人工稻瘟病抗性鑒定相較于自然病圃抗性鑒定具有多方面的優(yōu)點(diǎn),目前多采用水稻苗瘟期鑒定。而用于抗性鑒定的菌株篩選最早是通過接種鑒別品系的抗感反應(yīng)來劃分類群,但這種方法由于受接種環(huán)境與操作人員素質(zhì)的影響較大,結(jié)果會(huì)出現(xiàn)一定的偏差。本研究中的方法是基于稻瘟病菌本身遺傳基因水平上的差異,通過特異性分子標(biāo)記技術(shù)測(cè)定與稻瘟病菌毒性相關(guān)的一些基因的存在或缺失,根據(jù)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行聚類,從中篩選一套與當(dāng)?shù)氐疚敛【航M成結(jié)構(gòu)一致的代表性鑒定菌系并應(yīng)用于水稻品種的稻瘟病抗性鑒定。從實(shí)際應(yīng)用效果來看,從江西省5個(gè)具有代表性的不同地理生態(tài)型病圃分離篩選20個(gè)菌株組成的江西稻瘟病抗性鑒定菌系,在室內(nèi)離體接種穗頸段測(cè)定當(dāng)?shù)?0個(gè)抗性不同的水稻種質(zhì)資源品種的穗頸瘟抗性水平,其結(jié)果與田間自然誘發(fā)鑒定的結(jié)果基本一致,抗性水平的劃分也完全屬于同一級(jí)別。因此,本研究基于稻瘟病菌毒性相關(guān)基因篩選的稻瘟病抗性鑒定菌系是可行的,其鑒定準(zhǔn)確度高,在稻瘟病抗病育種與抗病品種篩選等方面應(yīng)用前景廣闊。
菌株的來源是稻瘟病抗性鑒定代表菌系構(gòu)建成功與否的關(guān)鍵。本研究是從江西省5個(gè)代表性地區(qū)的稻瘟病自然病圃采集發(fā)病標(biāo)本分離菌株,通過分子測(cè)定毒性相關(guān)基因篩選稻瘟病抗性鑒定菌系。然而由于稻瘟病菌的致病性分化嚴(yán)重以及易變性的特點(diǎn),在后續(xù)研究中需要從更多地區(qū)采集標(biāo)本分離菌株,不斷更新和補(bǔ)充已篩選構(gòu)建的稻瘟病抗性鑒定菌系,從而保證抗性鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。