成艷芬 馬 菁 朱偉云

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，動物消化道營養(yǎng)國際聯(lián)合研究中心，南京 210095)

作為世界十大產(chǎn)糧國之一，烏克蘭有著“歐洲糧倉”的美譽(yù)，2021年糧食總產(chǎn)量約為8 600萬t，糧食出口約5 000萬t，是世界第四大糧食出口國，在國際糧食供給與糧食價格穩(wěn)定方面具有舉足輕重的作用。今年，俄烏沖突令世界糧食安全受到挑戰(zhàn)，國際糧食價格飛漲。對我國來說，烏克蘭是我國重要的玉米、小麥進(jìn)口來源國，每年對我國出口玉米、小麥等谷物以數(shù)十萬噸計[1]，俄烏沖突凸顯了我國飼料糧短缺和“人畜爭糧”這個迫切需要解決的糧食安全問題[2]。

近年來，我國相繼發(fā)布《關(guān)于促進(jìn)畜牧業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的意見》《關(guān)于推進(jìn)玉米豆粕減量替代工作的通知》等文件，旨在通過加強(qiáng)飼料加工、促進(jìn)秸稈等非糧飼料資源的高效利用等，調(diào)整優(yōu)化我國飼料配方結(jié)構(gòu)，從糧食安全高度解決“人畜爭糧”的問題。秸稈等非糧飼料資源的高效利用中普遍存在的問題是其粗纖維含量高而降解效率低下，其中半纖維素、纖維素、木質(zhì)素等多糖交錯復(fù)雜，導(dǎo)致這些飼料難以被降解。此外，大量酚酸類物質(zhì)的附著提高了多糖的分支程度以及多糖之間的交聯(lián)程度，進(jìn)一步降低了其酶解特性，增加了其酶解難度。阿魏酸(ferulic acid，F(xiàn)A)是秸稈等非糧飼料中常見的酚酸類物質(zhì)，在禾本科秸稈中的含量相當(dāng)高[3]，通常與含L-阿拉伯呋喃糖的多糖(如L-阿拉伯糖基-D-木糖、L-阿拉伯聚糖)的分支或側(cè)鏈通過酯鍵連接，也可以附著在木質(zhì)素和蛋白質(zhì)上[4-5]，降低其消化率。阿魏酸酯酶(feruloyl esterase，F(xiàn)AE)是水解阿魏酸和半纖維素以及木質(zhì)素之間酯鍵的酶，可以釋放阿魏酸及其二聚體，同時也使這些多糖的酶解位點暴露出來，促進(jìn)其降解[6]。由此可見，F(xiàn)AE不僅具有降解支鏈釋放游離阿魏酸的作用，還具有協(xié)同其他粗纖維降解酶(如木聚糖酶、纖維素酶)促進(jìn)其粗纖維降解能力的作用。目前，關(guān)于FAE的研究報道較少，其產(chǎn)業(yè)應(yīng)用也處于起步階段，其中的瓶頸在于高效FAE基因資源的挖掘和開發(fā)。本文綜述了FAE的分類和來源、作用機(jī)理及其與其他粗纖維降解酶之間的協(xié)同作用，并對其在飼料工業(yè)中的應(yīng)用進(jìn)行了分析與思考，旨在促進(jìn)FAE在飼料工業(yè)中的應(yīng)用，提高秸稈等非糧飼料在畜禽養(yǎng)殖中的消化利用率。

1 FAE的分類和來源

1.1 FAE的定義

FAE(EC 3.1.1.73)是羧酸酯酶的一個子類，屬于碳水化合物酯酶(carbohydrate esterase，CE)亞家族，通過水解粗纖維內(nèi)阿魏酸和多糖之間的酯鍵釋放阿魏酸[7-8]，也可以從粗纖維中釋放其他羥基肉桂酸[6]，如咖啡酸、對香豆酸、芥子酸等[9]。

1.2 FAE的來源

自然界中FAE的來源大致可分為微生物源和植物源。微生物源FAE主要包含細(xì)菌源和真菌源。細(xì)菌源FAE多來自于梭菌(Clostridium)、鏈霉菌(Streptomyces)、假單胞菌(Pseudomonas)、乳酸桿菌(Lactobacillus)等，而真菌源FAE多來自于曲霉(Aspergillus)、青霉(Penicillium)、脈孢菌(Neurospora)、裸節(jié)菌(Talaromyces)等絲狀真菌[4,10]。本團(tuán)隊對細(xì)菌源和真菌源FAE功能域(FAE domain)序列研究分析發(fā)現(xiàn)，2種微生物源FAE的氨基酸序列相似度較低，不同微生物源FAE的氨基酸序列在發(fā)育樹中明顯被聚類到不同的簇(圖1)，這表明真菌源和細(xì)菌源FAE的不同的進(jìn)化過程。目前，被表征的FAE多來源于真菌[4]，這可能是由于真菌在粗纖維降解過程中發(fā)揮了十分重要的作用。分泌FAE的有益微生物可以直接添加，促進(jìn)青貯或生物發(fā)酵中粗纖維的降解[11-12]。不能直接添加微生物的FAE，可以進(jìn)行重組與異源表達(dá)后再利用。例如，Abokitse等[13]利用大腸桿菌異源表達(dá)了來自熱厭氧桿菌屬(Thermoanaerobacter)的FAE，該酶表現(xiàn)出高度的熱穩(wěn)定性。Moukouli等[14]在畢赤酵母中表達(dá)出了來自鐮刀菌屬(Fusarium)的FAE，該酶顯示出廣泛的pH穩(wěn)定性。為了促進(jìn)FAE的利用，Oliveira等[15]系統(tǒng)整理了近年來被表征的微生物源FAE及其特性。

目前，關(guān)于植物中FAE的報道較少。1999年，Sancho等[16]從大麥中檢測到了FAE活性，且提取到的FAE對4種典型的甲酯底物和阿魏酰化寡糖均表現(xiàn)出明顯的降解活性，隨后，大麥芽[17]、龍爪稷[18]、水稻細(xì)胞[19]和玉米[20]中FAE的酶學(xué)性質(zhì)被報道。植物源FAE的鑒定、提取和濃縮過程比較耗時，且過程中蛋白質(zhì)損失較大[20]，限制了它們的挖掘和利用，但這些FAE對植物體的生長和發(fā)育發(fā)揮了重要作用。Buanafina等[21]研究顯示，玉米花粉中FAE的分泌可能通過對柱頭細(xì)胞壁去阿魏?；鴧f(xié)助其他內(nèi)源酶對其進(jìn)行降解，從而為花粉管穿透創(chuàng)造一個開口，促進(jìn)花粉受精。

圖1 真菌源和細(xì)菌源FAE進(jìn)化樹Fig.1 Evolutionary tree of fungal and bacterial origin FAE

1.3 FAE的分類

Crepin等[9]基于FAE對4種芳香基底物——阿魏酸甲酯(methyl ferulate，MFA)、咖啡酸甲酯(methyl caffeate，MCA)、芥子酸甲酯(methyl sinapate，MSA)和對香豆酸甲酯(methylp-coumarate，MpCA)的水解特異性以及從底物中釋放阿魏酸脫氫二聚體的能力，將FAE分為A、B、C、D 4類(表1)。該分類系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的系統(tǒng)，但隨著被挖掘的FAE數(shù)量不斷增多，大量FAE無法依據(jù)該分類系統(tǒng)進(jìn)行具體分類[22-23]。近年來，基于計算分析和機(jī)器學(xué)習(xí)將365個細(xì)菌、真菌和植物來源的FAE分為了12個家族，但這些家族的底物特異性研究還是依賴于A～D型分類[23]。

隨著真菌源FAE研究的大量積累，近年來研究者們也嘗試對真菌源FAE進(jìn)行系統(tǒng)的分類。Benoit等[24]從系統(tǒng)發(fā)育的角度將真菌源FAE分成了7個亞類(SF1～7)，這種分類方法將不同功能的真菌源FAE做了進(jìn)一步細(xì)分，但沒有區(qū)分出D型FAE。Dilokpimol等[22]通過引入一些已經(jīng)表征的乙酰木聚糖酯酶、脂肪酶和單寧酸酶對真菌源FAE進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，將其分為了13個亞類(SF1～13)，并揭示了FAE與這些酶的關(guān)系。其中，屬于SF1～4和SF9～11的酶與單寧酶有關(guān)，說明大多數(shù)FAE是從單寧酶進(jìn)化而來的。雖然該分類方式依然無法包含所有FAE，但這種從系統(tǒng)發(fā)育和功能上對FAEs分類的方式為后續(xù)新FAE的分類提供了參考。

表1 A～D型FAE分類Table 1 Classification of A to D types of FAE

2 FAE的理化性質(zhì)和作用機(jī)制

2.1 FAE的理化性質(zhì)

目前，研究人員已經(jīng)表征出了許多FAE，不同微生物來源的FAE表現(xiàn)出不同的理化性質(zhì)，例如最適溫度、最適pH以及酶活穩(wěn)定性等。這些FAE的最適溫度和最適pH的差異較大，分別為30～65 ℃和pH 4.0～9.0，而大多數(shù)FAE在40～55 ℃和pH 6.5～7.5下表現(xiàn)出較好的催化活性[15]。此外，酶的穩(wěn)定性也是酶的利用價值的重要方面。酶的穩(wěn)定性除了和酶本身的氨基酸組成有關(guān)外，還與表達(dá)載體對酶的修飾有關(guān)，例如，畢赤酵母等真核表達(dá)系統(tǒng)對酶的糖基化位點的修飾會改變肽鏈骨架的柔韌性以及酶分子的聚合狀態(tài)，因此可能會對酶的活性以及穩(wěn)定性產(chǎn)生積極影響[25-27]，從而提高酶的工業(yè)利用價值。這種修飾對真核來源的FAE的異源表達(dá)尤為重要，能夠使這些FAE更有效地發(fā)揮作用。

2.2 FAE的結(jié)構(gòu)

晶體結(jié)構(gòu)解析對理解酶功能相關(guān)的特定結(jié)構(gòu)或者氨基酸殘基十分重要，當(dāng)前已知的FAE晶體結(jié)構(gòu)較少。以丁酸弧菌來源的FAE蛋白(PDB_ID:2WTM)(https://www.rcsb.org/structure/2WTM)為例，Goldstone等[28]利用X射線技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，該FAE的活性形式為二聚體，其單體分子具有典型的α/β水解酶折疊，即β-折疊和α-螺旋由環(huán)交替連接在一起，其中近乎平行或反平行排列的β-折疊位于被α-螺旋包圍的核心區(qū)域(圖2)。FAE的活性位點位于這些α-螺旋和β-折疊的柔性轉(zhuǎn)角形成的狹長空腔中，空腔內(nèi)還包含有一些穩(wěn)定底物芳香部分的疏水殘基。除了α/β水解酶折疊，該FAE在其活性位點附近還有一個蓋域結(jié)構(gòu)，這個蓋域結(jié)構(gòu)在很多FAE中都存在[26,28-30]，與脂肪酶的蓋域結(jié)構(gòu)相似，可能與酯酶的活性狀態(tài)有關(guān)。蓋域結(jié)構(gòu)的覆蓋限制了活性位點的作用，蓋域結(jié)構(gòu)移動后會引起疏水殘基的暴露和活性位點腔的活化[29-30]。蓋域結(jié)構(gòu)的移動與其兩側(cè)2個鉸鏈區(qū)域二面角的轉(zhuǎn)動有關(guān)，這提示，對兩側(cè)鉸鏈區(qū)內(nèi)氨基酸進(jìn)行優(yōu)化來增加其剛性或許可以設(shè)計具有永久打開蓋域結(jié)構(gòu)的FAE[30]。另外，根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)特點，也可以通過加強(qiáng)這些酶蛋白質(zhì)內(nèi)的相互作用來提高它們的穩(wěn)定性[31]或者改變底物結(jié)合口袋的性質(zhì)或形狀[7,32]來提高它們的活性，從而為獲得具有更高利用價值的FAE提供有力指導(dǎo)。

圖2 FAE(PDB_ID:2WTM)單體的三維結(jié)構(gòu)Fig.2 Three-dimensional structure of FAE (PDB_ID:2WTM) monomer[23]

2.3 FAE的催化機(jī)制

FAE活性狀態(tài)以單體或多聚體的形式存在，其活性位點是包含天冬氨酸(Asp)、組氨酸(His)以及親核的絲氨酸(Ser)形成的催化三聯(lián)體(圖2)。Ser殘基位于一個保守的具有親核性的五肽中心，即G-X-S-X-G(X=任何氨基酸)[23]。在催化過程中，His首先從Ser的羥基中去除1個質(zhì)子，由此被極化的Ser對底物羰基碳進(jìn)行親核攻擊，形成一個不穩(wěn)定的四面體中間體。中間體中帶負(fù)電荷的氧原子被氫鍵穩(wěn)定，形成氧陰離子孔，可以穩(wěn)定過渡態(tài)和四面體中間體中正在形成的負(fù)電荷。之后，四面體中間體解離，水分子進(jìn)入反應(yīng)體系，其氧原子攻擊羰基碳，從而又形成了一個由水分子參與的四面體中間物。最終，?；兔赣伤庾饔媒怆x，形成的阿魏酸從復(fù)合物中被釋放出來。這種脫酯機(jī)制與Ser型脂肪酶和蛋白酶的作用機(jī)制相同[33-35]。

3 FAE在飼料工業(yè)中的應(yīng)用

3.1 與其他纖維降解酶協(xié)同作用，促進(jìn)粗飼料降解

粗飼料的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)復(fù)雜，除了多糖的錯綜復(fù)雜，其中酚酸類物質(zhì)與多糖之間的共價交聯(lián)進(jìn)一步增加了細(xì)胞壁的剛性和機(jī)械性能[36]，這使得單一的糖苷水解酶(glycoside hydrolase，GH)對粗飼料的降解能力十分有限。FAE作為一類重要的輔助酶，不僅能夠從粗飼料底物中高效釋放阿魏酸[7,37]，還能通過降解支鏈提高其他纖維素酶或半纖維素酶降解主鏈多糖的效率[38](表2)。在半纖維素酶(主要是木聚糖酶)與FAE的協(xié)同作用中，木聚糖酶裂解木聚糖的主鏈，得到短阿魏?；途厶?，這使得這些低聚糖更容易被FAE水解，同時，阿魏酸殘基的釋放使木聚糖鏈更容易被木聚糖酶水解[8]。大量研究表明，在降解復(fù)雜底物時，F(xiàn)AE與半纖維素酶之間有顯著的協(xié)同作用，能釋放更多的阿魏酸和還原性單糖[39-41](圖3)。FAE和酶互作的酶解位點不同，其降解效率也不同。例如，當(dāng)在甜菜果膠的降解系統(tǒng)中加入FAE、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和α-1,5-阿拉伯聚糖內(nèi)切酶后，F(xiàn)AE從底物中釋放的阿魏酸明顯增多，這是由于后2種酶對底物中阿拉伯聚糖的酶切作用首先產(chǎn)生了阿魏?；?L-阿拉伯呋喃糖，該產(chǎn)物能更好地被FAE降解[39]。此外，GH10和GH11家族的木聚糖酶與FAE協(xié)作產(chǎn)生阿魏酸和還原糖的效率也有所差異[41-42]，可能是由于GH10更容易在木聚糖鏈上靠近取代基的位點切割糖苷鍵，而GH11對未被取代的區(qū)域表現(xiàn)出更高的特異性，所以，盡管2個家族的木聚糖酶都對阿拉伯木聚糖產(chǎn)生相當(dāng)?shù)慕到饽芰?，但GH10產(chǎn)生的在非還原端連接有阿拉伯阿魏酸基團(tuán)的低聚木糖相比于GH11產(chǎn)生的在內(nèi)部位置有這些取代基的低聚木糖，更有利于FAE發(fā)揮作用[41]。所以，根據(jù)復(fù)雜底物的組成和結(jié)構(gòu)特點，選擇合適的酶組合對高效去除支鏈的阿魏酸以打開植物細(xì)胞壁的微觀結(jié)構(gòu)十分重要。除了半纖維素酶，F(xiàn)AE也能夠與纖維素酶協(xié)同作用，通過改善粗飼料的降解效率和糖化程度來改善青貯飼料的質(zhì)量[11-12,43]，這可能是由于阿魏酸的水解移走了部分半纖維素或木質(zhì)素，從而提高纖維素酶對纖維素的結(jié)合能力。此外，添加FAE促進(jìn)了纖維素酶和半纖維素酶對復(fù)雜底物的降解[38,44]，同樣也是由于該酶裂解了木質(zhì)纖維素中的半纖維素后，其表面積和孔隙率增加，使纖維素酶更容易結(jié)合纖維素的作用。

圖3 阿魏酸酯酶協(xié)同其他半纖維素酶降解半纖維素示意圖Fig.3 Schematic diagram of hemicellulose degraded by hemicellulases with FAE

表2 FAE與其他纖維降解酶在粗飼料降解中的協(xié)同作用Table 2 Synergistic effects of FAE and other fiber-degrading enzymes in roughage degradation

3.2 預(yù)處理粗纖維含量高的粗飼料，提高其利用價值

酶處理是提高粗飼料降解率常見的生物預(yù)處理方法。不論是從粗飼料中回收高價值的阿魏酸產(chǎn)品，還是生產(chǎn)高消化降解率的高品質(zhì)飼料，使用FAE進(jìn)行預(yù)處理都是一條可行的途徑。相比于傳統(tǒng)的物理和化學(xué)預(yù)處理，酶處理高效、節(jié)能、環(huán)境友好的優(yōu)點突出。FAE預(yù)處理途徑包括高效分泌FAE菌株的直接使用和FAE工程菌株的利用。高效分泌FAE菌株的直接使用是指將自然界中篩選出來的能夠高效分泌FAE的微生物經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后直接接種到粗飼料底物上，其FAE伴隨菌株生長分泌到周圍環(huán)境中，促進(jìn)纖維降解。產(chǎn)FAE的乳桿菌經(jīng)常被用于青貯飼料的接種劑，以提高青貯飼料的纖維降解率[49-50]。例如，一株篩選自青藏高原青貯飼料的產(chǎn)FAE的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)A1能夠協(xié)同纖維素酶促進(jìn)青貯飼料的糖化效率和可降解性，從而顯著改善青貯飼料質(zhì)量[11,43]。此外，一些高效生產(chǎn)FAE的真菌，例如泡盛曲霉(Aspergillusawamori)[51]、草酸青霉(Penicilliumoxalicum)M1816[52]也被用于農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品的固體發(fā)酵，以促進(jìn)這些副產(chǎn)品的生物轉(zhuǎn)化。盡管這些菌株的利用潛力已經(jīng)被評估，但是它們的工業(yè)利用仍需要菌株工程的協(xié)助，即對其基因進(jìn)行定向改造或者對其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化來提高其胞外蛋白產(chǎn)量，達(dá)到更好的酶解性能。

FAE工程菌株的利用指將高效的FAE基因在某些特定的表達(dá)菌株中異源表達(dá)，收集其上清液(粗酶液)或者將粗酶液進(jìn)行純化、濃縮后混合其他酶制劑一起混入粗飼料底物中，協(xié)同降解粗纖維。經(jīng)這種酶制劑預(yù)處理后的粗飼料，由于其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)被破壞，可以被反芻動物瘤胃微生物高效降解利用，從而提高其飼料效率。此外，處理后的產(chǎn)品由于阿魏酸含量增加以及糖化程度提高，也可以顯著提高動物健康與機(jī)體免疫力[53]。研究表明，適度的物理或化學(xué)處理可以提高FAE對粗纖維的酶解效果，如汽爆的高溫、高壓蒸汽作用能夠溶解半纖維素，增加底物空間，擴(kuò)大木質(zhì)纖維素與酶的接觸面積，從而提高FAE的酶解作用。曾薇等[48]將FAE和纖維素酶同時添加到汽爆后的稻草中得到了理想的不溶性底物失重率。Wu等[54]發(fā)現(xiàn)汽爆能夠從木質(zhì)纖維素底物中釋放出可溶的阿魏酰化低聚糖，從而提高其被FAE降解的效率，快速釋放大量酚酸。

3.3 畜禽飼糧中的有益添加劑，改善動物健康和生產(chǎn)

秸稈類非糧飼料資源中富含阿魏酸，其中玉米麩皮中阿魏酸含量約為30 g/kg，小麥麩和黑麥麩中阿魏酸含量約為5.3、2.8 g/kg[7,55]，這些阿魏酸大多與細(xì)胞壁組分結(jié)合[52]，難以被釋放出來。利用高催化效率的FAE可以將阿魏酸從秸稈類非糧飼料資源中釋放出來，不僅可以提高秸稈類非糧飼料的利用效率，還能極大地提高飼料中阿魏酸含量。阿魏酸具有抗炎、抗氧化和抗癌的功效，此外，相關(guān)研究顯示，很多秸稈類非糧飼料中的阿魏酸以二聚體形式存在，如黑麥和小麥麩中都有高含量的8-O-4-阿魏酸二聚體，該二聚體在一定的劑量下表現(xiàn)出比單體更強(qiáng)的抗氧化能力[56-57]，因此，F(xiàn)AE的合理利用在這些非糧飼料的生物轉(zhuǎn)化中具有很大的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)效益。目前，F(xiàn)AE及產(chǎn)FAE菌株作為畜禽飼料的有益添加劑的作用已經(jīng)被廣泛評估(表2)。一方面，F(xiàn)AE對飼料的預(yù)處理減少了飼料中的阿魏酸酯鍵，改善了畜禽對纖維組分的降解效果，進(jìn)而提高了飼料的利用效率；另一方面，釋放的阿魏酸不僅能轉(zhuǎn)化成香草酸和香草醛等飼料風(fēng)味物質(zhì)，提高飼料適口性，且會導(dǎo)致畜禽血清中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶等活性的上升以及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)等一些促炎因子濃度的下降，從而對畜禽的抗氧化能力和免疫功能產(chǎn)生積極的影響。

表3 FAE及產(chǎn)FAE菌株作為畜禽飼料的有益添加劑的應(yīng)用Table 3 Application of FAE and FAE producing strains as beneficial additives for livestock and poultry feed

4 小結(jié)與展望

在木質(zhì)纖維素降解過程中，F(xiàn)AE作為一類高效的輔助酶，與其他木質(zhì)纖維素酶具有良好的協(xié)同作用，因此，研究FAE的結(jié)構(gòu)、作用機(jī)理及與其他酶的相互作用，在秸稈等非糧飼料的高效利用中顯得至關(guān)重要且前景廣闊。目前，如何獲得高活性、高穩(wěn)定性的FAE仍是提高其工業(yè)利用價值的重要瓶頸。近年來，越來越多的計算機(jī)工具如AlphaFold、Autodock、PoPMuSiC等被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測或蛋白質(zhì)內(nèi)、蛋白質(zhì)與配體間相互作用的模擬，來指導(dǎo)蛋白質(zhì)的突變或設(shè)計理想蛋白質(zhì)，因此，除不斷加強(qiáng)FAE晶體結(jié)構(gòu)及其作用機(jī)理研究外，還可聯(lián)合上述計算機(jī)算法來指導(dǎo)優(yōu)質(zhì)酶的篩選和突變。此外，進(jìn)一步深入研究穩(wěn)定且低成本的酶固定化技術(shù)也可以提高FAE產(chǎn)品在多個降解循環(huán)中的可利用性。