張同坤 賈 海 季 昀 楊 鷹 武振龍

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193)

嘔吐毒素(deoxynivalenol，DON)是多種鐮刀菌產(chǎn)生的霉菌毒素之一，具有2種乙?；问?，分別為3-乙酰嘔吐毒素(3-acetyldeoxynivalenol，3-Ac-DON)和15-乙酰嘔吐毒素(15-acetyldeoxynivalenol，15-Ac-DON。DON和乙酰化DON主要產(chǎn)生于禾谷鐮刀菌和鐮刀菌污染的玉米和小麥中，也廣泛存在于受污染的食品和動物飼料中，影響人體和動物健康[1]。2017年，研究人員對來源于我國不同地域的579個小麥樣品和606個玉米樣品的檢測發(fā)現(xiàn)，DON在小麥中的檢出率高達100%，在玉米中的檢出率達到99.83%，且3-Ac-DON在小麥和玉米中的檢出率分別為4.15%和13.53%[2]。攝入DON污染的食物會使人和動物出現(xiàn)嘔吐、腹瀉等胃腸道不良反應(yīng)。DON能夠損害腸上皮細胞，影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和機體健康[3-4]。研究表明，DON能夠造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和腸上皮細胞凋亡，破壞腸屏障功能[5]。比較而言，3-Ac-DON的極性比DON小，因而更容易被十二指腸和空腸吸收并造成腸道損傷[6]。豬對3-Ac-DON敏感性高于其他動物，因此飼糧中的3-Ac-DON污染對養(yǎng)豬生產(chǎn)的影響較大[7-9]。尋找適宜的緩解物質(zhì)，減輕3-Ac-DON對豬腸道健康的影響，是養(yǎng)豬業(yè)急需解決的難題。

姜酮是生姜中的天然提取物，在生姜中的含量占比約為9.25%，屬于甲氧基苯酚家族及其相關(guān)衍生物的成員，有1個堿性酚環(huán)，苯環(huán)上帶有1個甲氧基。姜酮也可以通過姜酚發(fā)生逆醛醇反應(yīng)生成[10]。姜酮的藥理性質(zhì)廣泛，具有抗氧化劑、抗炎等多種生物學(xué)活性[11-12]。研究報道，姜酮能夠改善葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠試驗性結(jié)腸炎[13]。盡管如此，姜酮能否緩解3-Ac-DON造成的腸上皮細胞損傷和屏障功能障礙尚未見報道。因此，本試驗以豬腸上皮細胞IPEC-1為研究對象，探究姜酮對3-Ac-DON引起的腸上皮細胞凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和腸屏障功能的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素和胎牛血清(FBS)購于美國Gibco公司；3-Ac-DON購于青島普瑞邦生物工程有限公司；姜酮購于美國MedChemExpress公司；細胞培養(yǎng)板購于無錫耐思生物科技有限公司；核糖核酸酶A購于上海索萊寶生物技術(shù)有限公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購于北京嘉美臻元生物技術(shù)有限公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8)細胞活力檢測試劑盒購于北京莊盟國際生物基因科技有限公司；Transwell細胞培養(yǎng)小室購于美國Corning Costar公司；異硫氰酸熒光素葡聚糖(FITC-dextran)購于美國Sigma公司；細胞色素C(CytC)、需肌醇酶1α(IRE1α)抗體購于美國Cell Signaling Technology公司；閉鎖小帶蛋白-3(ZO-3)抗體購于美國Invitrogen公司；磷酸化的需肌醇酶1α(p-IRE1α)抗體購于美國Abcam公司；活化型半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved-Caspase-3)、B細胞淋巴瘤2相關(guān)X蛋白(BAX)、閉鎖小帶蛋白-2(ZO-2)、閉合蛋白(occludin)、轉(zhuǎn)錄活化因子6(ATF6)、CCAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)抗體購于美國Proteintech Group公司；封閉蛋白-1(claudin-1)、封閉蛋白-4(claudin-4)和閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)抗體購于生工生物工程(上海)股份有限公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購于上海翊圣生物科技有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗、增強化學(xué)發(fā)光(ECL)超敏發(fā)光試劑盒購于北京華興博創(chuàng)基因技術(shù)有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

IPEC-1細胞培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱，培養(yǎng)液為含10% FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基。細胞達到80%融合度時，進行傳代。選擇10～30代的IPEC-1細胞用于后續(xù)試驗。

1.3 細胞活力檢測

將細胞接種于96孔板，當細胞融合度達到60%左右時，將IPEC-1細胞經(jīng)16 μmol/L的3-Ac-DON和0、80、160、320 μg/mL的姜酮共處理24 h，培養(yǎng)液更換為含5% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，每組設(shè)6個復(fù)孔，試驗重復(fù)3次。處理結(jié)束后，參考CCK-8試劑盒說明書進行操作，最后采用酶標儀在450 nm下測量吸光度值。

1.4 細胞凋亡檢測

將細胞接種于6孔板中，當細胞融合度達到60%左右，用16 μmol/L的3-Ac-DON和320 μg/mL的姜酮處理細胞24 h，細胞凋亡參考試劑盒說明書進行操作，經(jīng)流式細胞儀上機檢測并記錄數(shù)據(jù)。

1.5 單層細胞電阻和通透性測定

將細胞接種到Transwell細胞培養(yǎng)小室，置于24孔板中。當細胞電阻值達到500 Ω·cm2時，更換為5% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，用16 μmol/L的3-Ac-DON和320 μg/mL的姜酮處理細胞。將FITC-dextran溶解于含有320 μg/mL姜酮或16 μmol/L 3-Ac-DON的培養(yǎng)液中，F(xiàn)ITC-dextran的終濃度為1 mg/mL，加入到小室內(nèi)。24孔板中，加入對應(yīng)的含320 μg/mL姜酮或16 μmol/L 3-Ac-DON的培養(yǎng)液。測量相應(yīng)時間單層細胞的電阻值，并通過酶標儀檢測熒光強度，測定單層細胞通透性(激發(fā)波長490 nm，發(fā)射波長520 nm)。

1.6 蛋白免疫印跡檢測

收取處理后的細胞，加入適量的放射免疫沉淀(RIPA)裂解液，振蕩破碎、4 ℃、13 800×g離心15 min，收集細胞上清液。利用二喹啉甲酸(BCA)法檢測蛋白的濃度。制備樣品，隨后進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉和孵育抗體，最后進行顯影。條帶用Image J軟件掃描灰度值，以GAPDH為內(nèi)參。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8軟件中的one-way ANOVA模型進行統(tǒng)計分析，采用Tukey法進行多重比較，結(jié)果用“平均值±標準誤”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 姜酮緩解3-Ac-DON誘導(dǎo)的豬腸上皮細胞活力下降和細胞凋亡

由圖1-A可知，160和320 μg/mL的姜酮顯著緩解3-Ac-DON引起的IPEC-1細胞活力下降(P<0.05)，而姜酮單獨處理不影響細胞活力(P>0.05)。根據(jù)細胞活力結(jié)果，選用濃度320 μg/mL的姜酮用于后續(xù)的試驗。由圖1-B和圖1-C可知，與3-Ac-DON處理相比，姜酮顯著降低了3-Ac-DON引起的豬腸上皮細胞凋亡上升(P<0.05)。由圖1-D和圖1-E可知，與3-Ac-DON處理相比，姜酮顯著下調(diào)了cleaved-Caspase-3、BAX和CytC的蛋白表達水平(P<0.05)。以上結(jié)果表明，姜酮緩解了3-Ac-DON誘導(dǎo)的豬腸上皮細胞活力下降和凋亡。

3-Ac-DON：3-乙酰嘔吐毒素 3-acetyldeoxynivalenol；Zingerone：姜酮；c-Casp3：活化型半胱氨酸蛋白酶-3 cleaved-Caspase-3；BAX：B細胞淋巴瘤2相關(guān)X蛋白 B cell lymphoma 2 associated X protein；CytC：細胞色素C cytochrome C；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase。數(shù)據(jù)柱標記不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下圖同。Data columns marked with different letters indicated significant difference (P<0.05), the same as below.圖1 姜酮對3-Ac-DON誘導(dǎo)的IPEC-1細胞活力下降和細胞凋亡的影響Fig.1 Effects of zingerone on 3-Ac-DON-induced decrease in viability and apoptosis of IPEC-1 cells (n=3)

2.2 姜酮緩解3-Ac-DON誘導(dǎo)的豬腸上皮細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

由圖2可知，與3-Ac-DON處理相比，姜酮顯著下調(diào)了3-Ac-DON引起的ATF6、p-IRE1α和CHOP的蛋白表達上升(P<0.05)。以上結(jié)果表明，姜酮緩解了3-Ac-DON引起的IPEC-1細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。

2.3 姜酮緩解3-Ac-DON誘導(dǎo)的豬腸上皮細胞屏障功能損傷

由圖3可知，與未處理相比，姜酮單獨處理細胞12和24 h，豬單層腸上皮細胞跨膜電阻顯著下降(P<0.05)，這可能由于姜酮及其代謝產(chǎn)物對腸上皮屏障功能產(chǎn)生了影響，具體原因需要進一步探究。與3-Ac-DON處理相比，姜酮和3-Ac-DON共處理在12和24 h顯著提高了單層腸上皮細胞跨膜電阻(P<0.05)，顯著降低了單層腸上皮細胞的通透性(P<0.05)。另外，姜酮顯著上調(diào)了部分緊密連接蛋白的表達，如occludin和claudin-4(P<0.05)，但沒有緩解ZO-1、ZO-2、ZO-3和claudin-1蛋白表達的下降(P>0.05)。以上結(jié)果進一步表明，姜酮緩解了豬腸上皮細胞屏障功能，并增強了部分緊密連接蛋白的表達。

3-Ac-DON：3-乙酰嘔吐毒素 3-acetyldeoxynivalenol；Zingerone：姜酮；ATF6：轉(zhuǎn)錄活化因子6 activating transcription factor 6；p-IRE1α：磷酸化的需肌醇酶1α phosphorylated inositol-requiring transmembrane kinase/endoribonuclease 1α；IRE1α：需肌醇酶1α inositol-requiring transmembrane kinase/endoribonuclease 1α；CHOP：CCAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白 CCAAT/enhancer binding protein homologous protein;GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase。圖2 姜酮對3-Ac-DON誘導(dǎo)的IPEC-1細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響Fig.2 Effects of zingerone on 3-Ac-DON-induced endoplasmic reticulum stress in IPEC-1 cells (n=3)

3-Ac-DON：3-乙酰嘔吐毒素 3-acetyldeoxynivalenol；Zingerone：姜酮；ZO：閉鎖小帶蛋白 zonula occludens；occludin：閉合蛋白；claudin：封閉蛋白;GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase。圖3 姜酮對3-Ac-DON誘導(dǎo)的IPEC-1細胞屏障功能損傷的影響Fig.3 Effects of zingerone on 3-Ac-DON-induced barrier function injury in IPEC-1 cells (n=3)

3 討 論

3-Ac-DON是食品和飼料中常見的霉菌毒素之一，能夠引起腸上皮細胞凋亡，破壞腸道屏障的完整性，并降低營養(yǎng)物質(zhì)吸收和轉(zhuǎn)運[6]。針對3-Ac-DON對腸上皮細胞損傷作用，迫切的需要有效的緩解策略。姜酮作為生姜中的活性物質(zhì)，能夠減輕大鼠結(jié)腸炎并恢復(fù)腸道屏障功能[13]。本試驗以豬腸上皮細胞為模型，探究姜酮對3-Ac-DON引起腸屏障功能損傷的緩解作用。

細胞增殖是反映細胞活力和更新的重要指標[14]。細胞凋亡是細胞程序性死亡，根據(jù)其發(fā)生機制可分為死亡受體途徑和線粒體途徑。細胞發(fā)生線粒途徑細胞凋亡時，線粒體中的CytC釋放到細胞質(zhì)中，從而活化細胞凋亡蛋白半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)，促進細胞凋亡。BAX屬于B細胞淋巴瘤2家族的促凋亡成員，其蛋白表達升高通常代表細胞發(fā)生了線粒體途徑的凋亡[15]。本試驗中，姜酮恢復(fù)了3-Ac-DON引起的細胞活力下降和細胞凋亡升高，降低了凋亡相關(guān)蛋白BAX、cleaved-Caspase-3的表達，抑制了線粒體中CytC的釋放。之前的研究表明，DON能夠引起仔豬海馬神經(jīng)細胞發(fā)生線粒途徑的凋亡[16]。DON處理引起豬腸上皮細胞IPEC-J2線粒體膜電位的下降，提示其發(fā)生線粒體途徑的凋亡，白藜蘆醇能抑制DON處理引起的凋亡蛋白的升高，從而緩解細胞凋亡[17]。本試驗發(fā)現(xiàn)，姜酮緩解了3-Ac-DON誘導(dǎo)的線粒體途徑凋亡，提示線粒體功能異常與3-Ac-DON引起的豬腸上皮細胞損傷密切相關(guān)。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)加工修飾的場所，也是外界各種應(yīng)激的感受器。機體受到有害刺激時，細胞會發(fā)生未折疊蛋白反應(yīng)，從而誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[18]。當細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，IRE1α和ATF6會被激活，從而上調(diào)CHOP的蛋白表達，最終引起細胞發(fā)生線粒體途徑凋亡[19]。最近的研究表明，DON能夠增加牛乳腺上皮細胞中CHOP的表達，促進細胞發(fā)生線粒體途徑的凋亡。蒲公英甾醇處理能緩解了DON引起的凋亡[20]。本試驗與之前的研究結(jié)果一致，3-Ac-DON能夠誘導(dǎo)豬腸上皮細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。姜酮通過下調(diào)p-IRE1α、ATF6和CHOP蛋白的表達，緩解3-Ac-DON引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。因此，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是3-Ac-DON造成豬腸上皮細胞損傷的重要途徑，而姜酮能夠通過恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，保護豬腸上皮細胞。

緊密連接蛋白能夠維持腸道上皮屏障功能和通透性，并且是調(diào)節(jié)腸道屏障功能的重要靶點[21]。本試驗中，3-Ac-DON降低了單層腸上皮細胞的電阻，增加了腸上皮細胞的通透性，而姜酮處理細胞后，顯著逆轉(zhuǎn)了這一現(xiàn)象。與未處理相比，姜酮單獨處理細胞12和24 h，單層細胞電阻值顯著下降，這一點與預(yù)期相反，這可能與腸上皮細胞代謝姜酮產(chǎn)生的中間產(chǎn)物或終產(chǎn)物可能會影響腸上皮屏障功能，確切的機制需要進一步探究。本試驗中，姜酮處理提高了緊密連接蛋白occludin、claudin-4的表達，緩解了3-Ac-DON引起的細胞屏障功能損傷，這一研究結(jié)果與之前的結(jié)果[22]相一致。

4 結(jié) 論

姜酮通過增強細胞活力、降低細胞線粒體途徑的凋亡、緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和恢復(fù)腸上皮細胞屏障功能保護IPEC-1細胞免受3-Ac-DON誘導(dǎo)的損傷。