劉艷，卓維，黃紅燕，任風(fēng)鳴

（重慶市藥物種植研究所特色生物資源研究與利用川渝共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 南川 408435）

牛至（Origanum vulgareL.）是唇形科牛至屬一種重要的經(jīng)濟(jì)植物，在我國(guó)西北、華北及長(zhǎng)江流域以南地區(qū)都有分布，生于海拔500～3 600 m的路旁、山坡、林下及草地，歐、亞兩洲及北非也有分布，北美亦有引入［1］。牛至精油具有抑菌消炎、抗氧化、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、提高動(dòng)物機(jī)體免疫力等作用，是一種理想的抗生素替代品，已是世界范圍內(nèi)公認(rèn)的天然飼料添加劑［2-6］。

牛至在我國(guó)雖分布廣泛，但野生資源量較少，近年來(lái)隨著需求量的增加，野生資源也因被無(wú)序采挖而破壞嚴(yán)重［7］。根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第194號(hào)公告，我國(guó)從2020年7月1日起禁止使用抗生素類飼料添加劑。畜牧養(yǎng)殖業(yè)體量龐大，隨著“禁抗”令的頒布實(shí)施，以牛至精油為代表的“替抗”產(chǎn)品需求將激增，國(guó)內(nèi)牛至精油市場(chǎng)缺口將進(jìn)一步拉大。

牛至在西班牙、墨西哥和地中海地區(qū)的飲食中被作為香料長(zhǎng)期使用，因此人工種植較多［8-9］。國(guó)內(nèi)牛至人工栽培起步晚、規(guī)模?。?0］，目前牛至精油生產(chǎn)仍主要依賴野生資源供給，并且在市場(chǎng)流通中混偽品較多，遠(yuǎn)不能滿足規(guī)模化生產(chǎn)的需求［11］。因此，牛至產(chǎn)業(yè)的發(fā)展首先要解決資源匱乏、供應(yīng)不足的瓶頸問題。

目前國(guó)內(nèi)牛至種植及繁育方面的研究相對(duì)較少，僅有少量育種、人工引種栽培、繁育系統(tǒng)、扦插及組培方面的研究報(bào)道［7，12-17］。利用種子繁殖是植物最重要的繁殖方式，對(duì)種子萌發(fā)特性及其發(fā)芽影響因素的了解是對(duì)其擴(kuò)繁的基礎(chǔ)，種子萌發(fā)情況的好壞會(huì)對(duì)種苗培育效率產(chǎn)生直接的影響。本研究開展了不同環(huán)境因子及不同貯藏條件下牛至種子的萌發(fā)試驗(yàn)，旨在摸清牛至種子在不同萌發(fā)條件下的發(fā)芽情況，為實(shí)際生產(chǎn)中利用種子擴(kuò)繁牛至種苗提供理論依據(jù)，對(duì)于擴(kuò)大牛至資源量，實(shí)現(xiàn)牛至產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

1 材料

試驗(yàn)所用牛至種子來(lái)源于野外采集，于2019年10～11月及2020年10～11月分別采自云南省麗江、大理等地，采回后搓皮凈種。野外植株經(jīng)重慶市藥物種植研究所劉正宇研究員鑒定為牛至（Origanum vulgareL.）。所采牛至的苞片呈現(xiàn)紫色、花為粉紅色，根據(jù)中牛至亞種的檢索表［18］，此亞種為Origanum vulgareL.ssp.vulgareL.。開展試驗(yàn)前對(duì)種子進(jìn)行消毒，用0.5%的高錳酸鉀溶液浸泡30 min，用蒸餾水清洗3遍備用。

2 研究方法

2.1 不同溫度條件下牛至種子萌發(fā)試驗(yàn)

于2021年3～4月開展試驗(yàn)。在培養(yǎng)皿底部鋪墊吸水紙和濾紙，加入適量蒸餾水，挑選大小均勻、飽滿的牛至種子，播撒在濾紙上，用封口膜將培養(yǎng)皿蓋子周圍密封好，保持水分，放進(jìn)RDN-260B型人工氣候箱中進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)。設(shè)置5個(gè)恒溫條件：①15℃、②20℃、③25℃、④30℃、⑤35℃，光照強(qiáng)度2 500 lx，濕度70%。每個(gè)處理50粒，重復(fù)3次。以胚根長(zhǎng)至種子一半長(zhǎng)度視為萌發(fā)，記錄萌發(fā)時(shí)間，在萌發(fā)開始后14 d統(tǒng)計(jì)發(fā)芽數(shù)。

2.2 不同光照強(qiáng)度下牛至種子萌發(fā)試驗(yàn)

于2021年6～8月開展試驗(yàn)。培養(yǎng)皿同前處理，設(shè)置7個(gè)光強(qiáng)條件：①黑暗、②500 lx、③1 000 lx、④1 500 lx、⑤2 000 lx、⑥2 500 lx、⑦3 000 lx，播撒牛至種子，用封口膜將培養(yǎng)皿蓋子周圍密封好，黑暗處理為用錫箔紙全部包裹培養(yǎng)皿，放進(jìn)人工氣候箱中。溫度25℃，濕度70%。每個(gè)處理50粒，重復(fù)3次，萌發(fā)后14 d統(tǒng)計(jì)發(fā)芽數(shù)。

2.3 不同土壤含水率條件下牛至種子萌發(fā)試驗(yàn)

于2021年4～5月開展試驗(yàn)。設(shè)置2種土壤條件：Ⅰ土壤、Ⅱ添加沙子的土壤（土壤：細(xì)沙=3：1）。將準(zhǔn)備好的細(xì)土和細(xì)沙進(jìn)行高溫高壓（121℃、105 Pa）滅菌。設(shè)置6個(gè)含水率梯度，處理Ⅰ每個(gè)培養(yǎng)皿中加入50 g細(xì)土，處理Ⅱ加入30 g細(xì)土和10 g細(xì)沙，混勻，加入蒸餾水，使其含水率分別達(dá)到①10%、②20%、③30%、④40%、⑤50%、⑥60%，播撒牛至種子，用封口膜將蓋子周圍密封好，放進(jìn)人工氣候箱中。設(shè)置光照強(qiáng)度為2 500 lx，溫度25℃，濕度70%。每個(gè)處理50粒，重復(fù)3次，萌發(fā)后14 d統(tǒng)計(jì)發(fā)芽數(shù)。

2.4 不同貯藏條件下牛至種子萌發(fā)試驗(yàn)

牛至種子貯藏試驗(yàn)采用4種貯藏方式：Ⅰ室溫干藏、Ⅱ室溫沙藏、Ⅲ4℃沙藏、Ⅳ-20℃沙藏。干藏為將種子放入紙袋中，放置在常溫室內(nèi)。沙藏為將種子放入濕沙（濕度5%左右）中，然后分別放置在常溫室內(nèi)、4℃冰箱冷藏、-20℃冰箱冷凍。經(jīng)常加水，保持沙子濕度。新鮮種子采收后即開展一次萌發(fā)試驗(yàn)，以記錄統(tǒng)計(jì)初始種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)及發(fā)芽指數(shù)。于2019年12月開始貯藏試驗(yàn)，根據(jù)播種季節(jié)（春播、秋播）設(shè)置分別貯藏①90 d、②120 d、③150 d、④300 d、⑤450 d、⑥660 d，取出部分種子進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)，剩余的繼續(xù)貯藏。人工氣候箱溫度設(shè)置為25℃，光照強(qiáng)度2 500 lx，濕度70%。每個(gè)處理50粒，重復(fù)3次，萌發(fā)后每天記錄發(fā)芽數(shù)。

2.5 數(shù)據(jù)計(jì)算及統(tǒng)計(jì)分析

發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、出苗天數(shù)計(jì)算方法如下：

出苗天數(shù)（d）=發(fā)芽日期-播種日期。

采用Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算，使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA）及多重比較（LSD法）（P=0.05），數(shù)據(jù)取平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行繪圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同溫度對(duì)牛至種子萌發(fā)的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示，牛至種子在萌發(fā)溫度為20℃和25℃時(shí)發(fā)芽率比較高，分別為（88.00±3.46）%和（88.67±8.33）%；在溫度35℃時(shí)發(fā)芽率最低，僅為（6.00±2.00）%（圖1A）。就出苗天數(shù)而言，牛至種子在25℃時(shí)出苗時(shí)間最短，為2 d，在15℃、20℃、30℃及35℃時(shí) 出 苗時(shí)間 延 長(zhǎng)，為4～7 d不等（圖1B）。

圖1 不同溫度條件下牛至種子發(fā)芽率（A）及出苗天數(shù)（B）變化Fig.1 Variation of seed germination rate（A）and emergence days（B）of O.vulgare ssp.vulgare under different temperature conditions

綜合牛至種子發(fā)芽率及出苗天數(shù)來(lái)看，在25℃時(shí)發(fā)芽情況最好，出苗時(shí)間最短且發(fā)芽率高，溫度較低或較高其出苗時(shí)間都有所延遲，溫度太高（35℃以上）并不適宜其種子萌發(fā)，因此在播種時(shí)最好選擇25℃左右的環(huán)境溫度，能有較好的出苗效果。

3.2 不同光照強(qiáng)度對(duì)牛至種子萌發(fā)的影響

牛至種子在黑暗～光照強(qiáng)度3 000 lx下發(fā)芽率均較高，沒有顯著差異（圖2，A），最高達(dá)到（91.33±8.33）%（光照強(qiáng)度2 000 lx）。黑暗～光照強(qiáng)度1 000 lx時(shí)出苗天數(shù)為2 d，1 500 lx～3 000 lx時(shí)為3 d（圖2，B）。

圖2 不同光照強(qiáng)度下牛至種子發(fā)芽率（A）及出苗天數(shù)（B）變化Fig.2 Variation of seed germination rate（A）and emergence days（B）of O.vulgare ssp.vulgare under different illumination intensity

結(jié)果表明，黑暗和光照條件下牛至種子均能很好萌發(fā)，光照強(qiáng)度對(duì)牛至種子發(fā)芽率影響較小，總體出苗天數(shù)也相近，說明光照強(qiáng)度對(duì)其發(fā)芽過程的作用較小，不是影響其種子萌發(fā)的主導(dǎo)因素。光照強(qiáng)度1 500 lx以上時(shí)存在一定的影響，出苗時(shí)間有所延遲。

3.3 不同土壤含水率對(duì)牛至種子萌發(fā)的影響

在處理Ⅰ（土壤）中，牛至種子在土壤含水率50%時(shí)發(fā)芽率最高，為（66.00±14.42）%；在10%時(shí)發(fā)芽率最低，僅為（6.67±9.87）%（圖3，A）。出苗天數(shù)結(jié)果顯示，土壤含水率10%～20%時(shí)出苗很慢，需要10 d時(shí)間才能出苗；30%～60%時(shí)出苗時(shí)間為3～5 d左右（圖3，B）。在處理Ⅱ（土壤：細(xì)沙=3：1）中，牛至種子在土壤含水率10%時(shí)未出苗，在20%～60%時(shí)發(fā)芽率均較高，40%時(shí)發(fā)芽率最高達(dá)到（72.67±9.45）%（圖3，A）。出苗時(shí)間較一致，均為4 d（圖3，B）。

圖3 不同土壤含水率條件下牛至種子發(fā)芽率（A）及出苗天數(shù)（B）變化Fig.3 Variation of seed germination rate（A）and emergence days（B）of O.vulgare ssp.vulgare under different soil moisture content

綜合而言，牛至種子在土壤含水率40%～50%左右時(shí)發(fā)芽率較高，出苗時(shí)間較短，適合萌發(fā)。在土壤含水率10%～20%時(shí)發(fā)芽率很低且出苗很慢，因此在實(shí)際生產(chǎn)播種時(shí)要經(jīng)常澆水，保證足量的水分供應(yīng)。

3.4 不同貯藏方式、時(shí)間對(duì)牛至種子萌發(fā)的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示，新采收種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)及發(fā)芽指數(shù)最高（圖4），說明牛至種子不具明顯的休眠現(xiàn)象。隨著貯藏時(shí)間的增加，其發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)及發(fā)芽指數(shù)總體呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)（圖4）。四個(gè)處理在貯藏120 d前后，發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)均出現(xiàn)低谷（圖4），同時(shí)均出現(xiàn)發(fā)芽延遲（圖5）。在貯藏0～660 d之間，四個(gè)處理的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)均呈現(xiàn)波狀分布。處理Ⅰ、Ⅳ呈現(xiàn)降升降的波狀規(guī)律，處理Ⅱ、Ⅲ比處理Ⅰ、Ⅳ波動(dòng)周期短，頻率高，處理Ⅱ在貯藏450 d和660 d時(shí)出現(xiàn)波幅增加，處理Ⅲ在貯藏660 d時(shí)出現(xiàn)波幅增加（圖4）。

圖4 不同貯藏條件下牛至種子發(fā)芽率（A）、發(fā)芽勢(shì)（B）及發(fā)芽指數(shù)（C）變化Fig.4 Variation of seed germination rate（A），germination energy（B）and germination index（C）of O.vulgare ssp.vulgare under different storage conditions

總體而言，貯藏0～300 d，處理Ⅲ、Ⅳ（低溫貯藏）比處理Ⅰ、Ⅱ（室溫貯藏）的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)及發(fā)芽指數(shù)高，貯藏300～660 d，處理Ⅰ、Ⅱ比處理Ⅲ、Ⅳ的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)及發(fā)芽指數(shù)高（圖4），說明低溫冷藏或冷凍在1年內(nèi)效果比常溫貯藏好，超過1年后效果下降。

整體出苗時(shí)間為3～5 d左右，隨著貯藏時(shí)間的增加均呈現(xiàn)出延長(zhǎng)的趨勢(shì)，-20℃沙藏660 d時(shí)出苗時(shí)間明顯延長(zhǎng)至9 d（圖5）。因此牛至種子貯藏時(shí)間不宜過長(zhǎng)，貯藏超過2年其出苗時(shí)間越來(lái)越延遲，不適合應(yīng)用于大批量育苗工作中。

圖5 不同貯藏條件下牛至種子出苗天數(shù)變化Fig.5 Variation of emergence days of O.vulgare ssp.vulgare under different storage conditions

4 討論

4.1 弱光照有可能加快牛至種子萌發(fā)

光照強(qiáng)度對(duì)種子萌發(fā)具有重要影響，合適的光照環(huán)境是一些植物種子萌發(fā)、幼苗建植的關(guān)鍵［19］。不同植物種子萌發(fā)對(duì)光照有不同的需求。趙富王等研究了光照對(duì)陜北退耕地植物種子萌發(fā)的影響，發(fā)現(xiàn)香青蘭、鐵桿蒿、益母草、菊葉委陵菜和敗醬在光照條件下種子萌發(fā)率顯著高于黑暗條件下，而狗尾草則為相反情況，白羊草、大針茅、杠柳和紫丁香的種子萌發(fā)率在兩種條件下無(wú)顯著差異［20］。趙明等通過對(duì)六種草地植物的研究發(fā)現(xiàn)，防風(fēng)、角蒿和黃金菊的種子萌發(fā)率不受光照強(qiáng)度影響，而反枝莧、大果琉璃草和紫菀種子喜弱光或中等光照［21］。郭霏等研究表明沙蔥有光休眠現(xiàn)象，為需暗種子［22］。本試驗(yàn)中，黑暗和光照條件下牛至種子的發(fā)芽率沒有顯著差異，而在光照強(qiáng)度1 500 lx以下時(shí)出現(xiàn)出苗時(shí)間短的現(xiàn)象，說明較弱光照可能會(huì)加快牛至種子萌發(fā)，其生理原因還有待進(jìn)一步研究。

4.2 土壤含水量過高牛至種子種苗存在霉變腐爛風(fēng)險(xiǎn)

水分是植物種子萌發(fā)的必要條件。一般來(lái)說種子萌發(fā)時(shí)的含水量明顯高于貯藏期間的含水量，也高于種子成熟期的含水量，足量的水分使胚內(nèi)的蛋白質(zhì)等大分子及細(xì)胞器活化，促進(jìn)種子萌動(dòng)［23］。土壤含水率過低會(huì)使種子受到水分脅迫，吸水量不足，萌發(fā)率降低，萌發(fā)時(shí)間延長(zhǎng)［24］。過高的土壤含水量會(huì)造成積水環(huán)境，長(zhǎng)時(shí)間浸泡會(huì)導(dǎo)致種子無(wú)氧呼吸，霉菌感染，使其腐爛從而降低出苗率［25-26］。我們?cè)谠囼?yàn)過程中發(fā)現(xiàn)土壤含水率50%～60%時(shí)，由于培養(yǎng)皿封閉環(huán)境的積水浸泡，培養(yǎng)皿內(nèi)發(fā)霉現(xiàn)象較其他處理明顯，發(fā)霉可能是由于種子消毒、土壤滅菌不徹底或?qū)嶒?yàn)操作過程造成，因此在實(shí)際生產(chǎn)中過高的土壤含水率就增加了種子的霉變風(fēng)險(xiǎn)。此外還發(fā)現(xiàn)有萌發(fā)的幼苗被浸泡腐爛的現(xiàn)象，也會(huì)造成牛至種苗損失，因此在生產(chǎn)育苗時(shí)應(yīng)注意排水、通風(fēng)，防止土壤積水。

4.3 貯藏對(duì)牛至種子萌發(fā)影響較大

未貯藏的新鮮牛至種子育苗效果最好（圖4-圖5），隨著貯藏時(shí)間的增加，其發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)及發(fā)芽指數(shù)總體呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，因此盡量使用最近采集的種子來(lái)進(jìn)行育苗、直播等。貯藏溫度是影響種子壽命的關(guān)鍵因素之一，一般來(lái)說，貯藏溫度高、呼吸作用強(qiáng)不利于種子生活力的保持，低溫貯藏時(shí)種子的呼吸作用較弱，內(nèi)部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗較慢，能使種子壽命延長(zhǎng)［27-28］，但是也有一些研究顯示有常溫貯藏效果優(yōu)于低溫貯藏的情況［29］。本試驗(yàn)中，牛至種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)在各貯藏條件下，均呈現(xiàn)波狀分布（圖4）。在貯藏0～660 d范圍內(nèi)，貯藏120 d前后均出現(xiàn)出苗時(shí)間延長(zhǎng)，發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)低谷，可能是因?yàn)榉N子在貯藏前期有一定量的活躍有機(jī)成分，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸消耗或轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定有機(jī)成分，影響了發(fā)芽。貯藏120 d以后，隨著細(xì)胞的活動(dòng)，部分穩(wěn)定有機(jī)成分少量活化，一定程度上促進(jìn)了發(fā)芽。因此，牛至種子可能存在輕度的后熟現(xiàn)象，生理驗(yàn)證有待進(jìn)一步研究。

本研究通過探索不同溫度、光照強(qiáng)度、土壤含水率及不同貯藏方式、時(shí)間對(duì)牛至種子萌發(fā)的影響，發(fā)現(xiàn)牛至種子無(wú)明顯休眠現(xiàn)象，最適萌發(fā)溫度為25℃，需要40%～50%左右的土壤含水率，光照強(qiáng)度不是影響萌發(fā)的主導(dǎo)因素，4℃沙藏和-20℃沙藏在1年內(nèi)比室溫干藏和室溫沙藏效果好，之后效果下降。因此在牛至實(shí)際生產(chǎn)育苗中，要注意選擇適宜的氣溫及水分條件，播種盡量使用新采集的種子，其發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)及發(fā)芽指數(shù)都較高，出苗時(shí)間短，出苗效果好，如剩余種子需要貯藏，可根據(jù)計(jì)劃貯藏時(shí)間綜合考量貯藏成本和生產(chǎn)需要來(lái)選擇適合的貯藏方式。