趙晶，劉詩(shī)偉，楊雨欣，羅佳，謝婧，廉文靜

（天津農(nóng)學(xué)院基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)院，天津 300384）

氨芐西林是一種應(yīng)用廣泛的β-內(nèi)酰胺類抗生素，常用于家畜養(yǎng)殖中預(yù)防和治療細(xì)菌感染，以加快家畜生長(zhǎng)發(fā)育，提高產(chǎn)量［1-2］。在家禽養(yǎng)殖中濫用氨芐西林可能會(huì)導(dǎo)致其在動(dòng)物源食品中的殘留，對(duì)人類健康造成危害［3］。因此，實(shí)現(xiàn)食品中氨芐西林殘留高效、靈敏測(cè)定對(duì)保護(hù)人類健康非常重要。

分子印跡技術(shù)是合成對(duì)目標(biāo)分析物具有特異性識(shí)別作用的分子印跡聚合物（MIP）的分子識(shí)別技術(shù)［4-6］。MIP具有穩(wěn)定性好、選擇性高及可預(yù)定性等優(yōu)點(diǎn)，在電化學(xué)檢測(cè)方面，將MIP良好的特異選擇性與簡(jiǎn)便、快速的電化學(xué)檢測(cè)方法結(jié)合構(gòu)建分子印跡電化學(xué)傳感器已廣泛應(yīng)用于分析化學(xué)及其它研究領(lǐng)域［7-8］。其中，電流型分子印跡電化學(xué)傳感器是應(yīng)用最廣泛、研究最成熟的一種電化學(xué)傳感器，然而，洗脫后有限的特異性識(shí)別位點(diǎn)數(shù)量以及較差的導(dǎo)電性大大限制了電流型分子印跡電化學(xué)傳感器的檢測(cè)靈敏度［9］。因此，利用簡(jiǎn)單高效的方法提高電流型分子印跡電化學(xué)傳感器的檢測(cè)靈敏度，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分析物的快遞、靈敏測(cè)定具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。

近年來(lái)，一些具有優(yōu)良特性的納米材料常被用作電極修飾材料，以提高分子印跡電化學(xué)傳感器的檢測(cè)靈敏度［10-12］。石墨烯作為一種新型的碳納米材料，由于其優(yōu)良的導(dǎo)電性，較大的比表面積和非凡的機(jī)械性能［13-15］，在電化學(xué)傳感領(lǐng)域引起了很大的關(guān)注，使其成為一種應(yīng)用廣泛的電極修飾材料。同時(shí)，具有導(dǎo)電性好、生物相容性好、比表面積大等性質(zhì)的金納米粒子（AuNPs）也被廣泛應(yīng)用于電化學(xué)傳感器的構(gòu)建［16-17］。但石墨烯和AuNPs通常利用化學(xué)還原法還原氧化石墨烯（GO）及氯金酸制備，制備過(guò)程較復(fù)雜，且需加入強(qiáng)還原劑，帶來(lái)污染［18］。利用電化學(xué)沉積法，在合適的電位下，可在常溫常壓條件下一步實(shí)現(xiàn)氯金酸和GO的還原，直接在電極表面沉積AuNPs-rGO復(fù)合材料，具有制備過(guò)程高效、可控等優(yōu)點(diǎn)。由于石墨烯和AuNPs的協(xié)同信號(hào)放大作用，AuNPs-rGO復(fù)合材料比單一納米材料具有更好的電化學(xué)性能。

本文利用簡(jiǎn)單、高效、可控的電沉積法在玻碳電極（GCE）表面制備AuNPs-rGO復(fù)合材料，并以氨芐西林為目標(biāo)分子，鄰苯二胺為功能單體，在AuNPsrGO/GCE表面電聚合制備分子印跡聚合物，構(gòu)建氨芐西林電化學(xué)傳感器。研究AuNPs-rGO復(fù)合材料的電化學(xué)性質(zhì)以及氨芐西林電化學(xué)傳感器的性能參數(shù)，以評(píng)估電沉積法制備AuNPs-rGO復(fù)合材料的制備工藝及其在電化學(xué)傳感器中的應(yīng)用價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 儀器與試劑

儀器：CHI 660E型電化學(xué)工作站；三電極系統(tǒng)：以GCE電極為工作電極，以鉑絲電極和飽和甘汞電極分別為對(duì)電極和參比電極；KH5200B型超聲波清洗儀。

試劑：主要包括氨芐西林，氯金酸，鄰苯二胺，鐵氰化鉀，無(wú)水甲醇，冰醋酸，醋酸鈉，鐵氰化鉀，亞鐵氰化鉀，氯化鉀等，以上試劑均為分析純；GO采用Hummers法自制；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 AuNPs-rGO/GCE電極制備

將GO分散到蒸餾水中，超聲震蕩1 h，得到1 mg·mL-1GO分散液。用移液器移取10 μL GO分散液到Al2O3粉拋光處理后的GCE電極表面，置于紅外燈下烘干。以GO/GCE電極為工作電極構(gòu)建三電極系統(tǒng)，置于1 mmol·L-1氯金酸溶液中，-1.0 V恒電位沉積250 s，得到AuNPs-rGO/GCE電極。

1.3 氨芐西林分子印跡電化學(xué)傳感器構(gòu)建

以AuNPs-rGO/GCE電極為工作電極構(gòu)建三電極系統(tǒng)，置于含5 mmol·L-1氨芐西林和10 mmol·L-1鄰苯二胺的pH 5.2的0.1 mol·L-1醋酸鹽緩沖液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，掃描電位為0～0.8 V，掃速為0.05 V·s-1，電聚合30圈得到氨芐西林MIP/AuNPsrGO/GCE電極。在室溫晾干后，將MIP/AuNPsrGO/GCE電極置于20 mL甲醇/乙酸（9∶1，V/V）溶液中磁力攪拌15 min洗脫掉氨芐西林，用蒸餾水沖洗后室溫晾干便得到洗脫后的MIP/AuNPs-rGO/GCE電極，該電極對(duì)氨芐西林具有特異識(shí)別作用。將洗脫后的MIP/AuNPs-rGO/GCE電極浸入到不同濃度的氨芐西林溶液中20 min，室溫干燥得到重結(jié)合后的MIP/AuNPs-rGO/GCE電極。非印跡聚合物（NIP）采用相同步驟在相同條件下制備，只是在制備過(guò)程中不加入模板分子氨芐西林。

作為對(duì)照組，直接在拋光后的裸GCE電極表面電聚合氨芐西林MIP膜，得到氨芐西林MIP/GCE電極，除未在GCE電極表面電沉積AuNPs-rGO復(fù)合材料外，其余實(shí)驗(yàn)條件與制備氨芐西林MIP/AuNPsrGO/GCE電極相同，以研究AuNPs-rGO復(fù)合材料對(duì)氨芐西林檢測(cè)靈敏度的提高作用。

1.4 測(cè)試與表征

循環(huán)伏安曲線和電化學(xué)阻抗譜均利用CHI 660E型電化學(xué)工作站測(cè)定。循環(huán)伏安曲線測(cè)定以5 mmol·L-1K3Fe（CN）6溶液（含0.1 mol·L-1KCl）為探針，掃描電位為-0.2～0.6 V，掃速為0.1 V·s-1；電化 學(xué) 阻 抗 譜 測(cè) 定 在5 mmol·L-1K3Fe（CN）6和K4Fe（CN）6（1∶1，含0.1 mol·L-1NaCl）混合溶液中測(cè)定，頻率范圍為0.1～105Hz，電壓為0.17 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 電沉積AuNPs-rGO復(fù)合材料條件優(yōu)化

為了得到導(dǎo)電性能好、穩(wěn)定、均勻的AuNPsrGO復(fù)合材料，對(duì)兩種常用的電沉積方法進(jìn)行優(yōu)化。分別采用I-T曲線法和循環(huán)伏安法制備AuNPs-rGO復(fù)合材料，首先在GCE電極表面修飾10 μL 1 mg·mL-1GO分散液，并置于紅外燈下烘干得到GO/GCE電極，以GO/GCE電極為工作電極構(gòu)建三電極系統(tǒng)，置于1 mmol·L-1氯金酸溶液中進(jìn)行電沉積。分別對(duì)兩種沉積方法的電位和時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化后，確定I-T曲線法沉積電位為-1.0 V，沉積時(shí)間為250 s，掃速為0.1 V·s-1，循環(huán)伏安法電位掃描范圍為-1.0～0 V，掃描圈數(shù)為15圈，掃速為0.1 V·s-1。在K3Fe（CN）6探針溶液中采用循環(huán)伏安法分別測(cè)定預(yù)處理后的GCE電極、GO/GCE電極以及兩種電沉積方法制備的AuNPs-rGO/GCE的電化學(xué)性質(zhì)。如圖1所示，K3［Fe（CN）6］探針在裸GCE電極表面有可逆的氧化還原峰（曲線a），說(shuō)明GCE電極預(yù)處理效果很好。GO/GCE電極的電流響應(yīng)比裸GCE電極略?。ㄇ€b），這是因?yàn)镚O的導(dǎo)電性能較差。采用循環(huán)伏安法（曲線c）和I-T曲線法（曲線d）制備的AuNPs-rGO/GCE電極的電流響應(yīng)均明顯比GCE電極大，說(shuō)明制備的AuNPs-rGO復(fù)合材料可有效促進(jìn)K3［Fe（CN）6］探針的電子傳遞。如曲線d所示，采用I-T曲線法電沉積制備的AuNPs-rGO/GCE電極的電流響應(yīng)更大。

進(jìn)一步采用電化學(xué)阻抗譜對(duì)兩種電沉積方法制備的AuNPs-rGO/GCE電極的電化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行表征。如圖2所示，曲線a～d分別為裸GCE電極，GO/GCE電極，利用循環(huán)伏安法制備的AuNPs-rGO/GCE電極，利用I-T曲線法制備的AuNPs-rGO/GCE電極的電化學(xué)阻抗譜，可知，電化學(xué)阻抗譜測(cè)定結(jié)果均與循環(huán)伏安測(cè)定結(jié)果（圖1）一致，采用I-T曲線法電沉積制備的AuNPs-rGO/GCE電極的電化學(xué)阻抗譜表現(xiàn)出最小的半圓直徑（曲線d），同樣說(shuō)明采用I-T曲線法電沉積制備的AuNPs-rGO/GCE電極促進(jìn)電子傳遞作用最強(qiáng)，且I-T曲線法電沉積過(guò)程僅需要250 s，用時(shí)更短，因此選用I-T曲線法電沉積AuNPsrGO復(fù)合材料。

圖1 不同電極的循環(huán)伏安曲線Fig.1 Cyclic voltammetry curves of different electrodes

圖2 不同電極的電化學(xué)阻抗譜Fig.2 Electrochemical impedance spectroscopy curves of different electrodes

2.2 傳感器構(gòu)建條件優(yōu)化

采用電化學(xué)聚合方法，以常用電聚合單體鄰苯二胺為功能單體，以氨芐西林為模板分子，在AuNPs-rGO/GCE電極表面制備氨芐西林MIP膜，為得到更好的氨芐西林檢測(cè)效果，分別對(duì)功能單體與模板分子比例，電聚合圈數(shù)，洗脫劑及洗脫時(shí)間，重結(jié)合時(shí)間等實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化選擇。同時(shí)參照以鄰苯二胺為功能單體電聚合制備MIP的文獻(xiàn)報(bào)道常用參數(shù)［19-20］，確定電化學(xué)聚合條件如下：以AuNPsrGO/GCE電極為工作電極構(gòu)建三電極系統(tǒng)，置于含有5 mmol·L-1氨 芐 西 林 和10 mmol·L-1鄰 苯 二 胺 的pH 5.2的0.1 mol·L-1醋酸鹽緩沖液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，在0～0.8 V，以0.05 V·s-1掃描速率，電聚合30圈后在AuNPs-rGO/GCE電極表面得到氨芐西林MIP膜，即MIP/AuNPs-rGO/GCE電極。洗脫劑為甲醇/乙酸（9∶1，V/V），洗脫時(shí)間為15 min，重結(jié)合時(shí)間為20 min。電聚合過(guò)程循環(huán)伏安曲線如圖3所示，電聚合第一圈時(shí)，在0.6 V左右得到鄰苯二胺單體的不可逆氧化峰，隨著聚合圈數(shù)逐漸增加，該氧化峰電流逐漸降低，當(dāng)聚合圈數(shù)增加到30圈時(shí)，該氧化峰完全消失。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明包埋有模板分子氨芐西林的聚鄰苯二胺薄膜已成功聚合在AuNPsrGO/GCE電極表面，并且阻礙了鄰苯二胺單體進(jìn)一步到達(dá)電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)。

圖3 電聚合氨芐西林分子印跡聚合物循環(huán)伏安圖Fig.3 Cyclic voltammetry curves of ampicillin molecularly imprinted polymer by electropolymerization

2.3 傳感器構(gòu)建過(guò)程電化學(xué)表征

采用K3［Fe（CN）6］作為電活性探針，通過(guò)循環(huán)伏安法對(duì)氨芐西林分子印跡電化學(xué)傳感器的構(gòu)建過(guò)程進(jìn)行表征，以驗(yàn)證傳感器構(gòu)建效果。如圖4曲線A所示，K3［Fe（CN）6］探針在裸GCE電極表面有可逆的氧化還原峰。當(dāng)在GCE電極表面電沉積AuNPs-rGO復(fù)合材料后，AuNPs-rGO/GCE電極 的電流響應(yīng)明顯增大（圖4，曲線B），這是因?yàn)橐徊诫姵练e法制備的AuNPs-rGO復(fù)合材料具有導(dǎo)電性能好、比表面積大等優(yōu)點(diǎn)，促進(jìn)了K3［Fe（CN）6］探針的電化學(xué)傳遞過(guò)程。如圖4曲線C所示，當(dāng)在AuNPsrGO/GCE電極表面電聚合一層MIP薄膜后，得到的MIP薄膜電極的電流響應(yīng)明顯降低，這是因?yàn)殡姌O表面的MIP薄膜較緊密，阻礙了K3［Fe（CN）6］探針?lè)肿哟┻^(guò)薄膜到達(dá)電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)。當(dāng)用洗脫劑洗脫掉氨芐西林后，K3［Fe（CN）6］的氧化還原峰電流明顯增大（圖4，曲線D），這是因?yàn)橄疵摰裟０宸肿雍?，MIP薄膜中暴露出氨芐西林的特異性識(shí)別位點(diǎn)，多孔結(jié)構(gòu)的MIP薄膜有利于K3［Fe（CN）6］探針?lè)肿哟┻^(guò)到達(dá)電極表面發(fā)生電子轉(zhuǎn)移。如圖4曲線E所示，當(dāng)洗脫后的MIP/AuNPsrGO/GCE電極重結(jié)合0.1 mmol·L-1氨芐西林后，電極的電流響應(yīng)明顯降低。這是因?yàn)橹亟Y(jié)合氨芐西林后，MIP薄膜中氨芐西林的特異性識(shí)別位點(diǎn)被占據(jù)，降低了MIP薄膜的孔隙度和滲透率，并且電流響應(yīng)降低的程度與重結(jié)合的氨芐西林濃度有關(guān)。從圖4檢測(cè)結(jié)果表明，該MIP薄膜可以用來(lái)識(shí)別氨芐西林，可以利用洗脫后及重結(jié)合氨芐西林后的循環(huán)伏安響應(yīng)差值對(duì)溶液中的氨芐西林進(jìn)行定量分析。

圖4 K3［Fe（CN）6］在不同電極上的循環(huán)伏安曲線Fig.4 Cyclic voltammetry curves of K3［Fe（CN）6］at different electrodes

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

配制濃度范圍為1×10-9～5×10-3mol·L-1的氨芐西林標(biāo)準(zhǔn)溶液，并將洗脫后的MIP/AuNPs-rGO/GCE電極置于不同濃度的氨芐西林標(biāo)準(zhǔn)溶液中，重結(jié)合20 min后自然晾干。以重結(jié)合氨芐西林標(biāo)準(zhǔn)溶液后的電化學(xué)傳感器為工作電極，在K3［Fe（CN）6］探針溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安測(cè)定后記錄K3［Fe（CN）6］的氧化峰電流Ipa，以K3［Fe（CN）6］探針在洗脫后的MIP/AuNPs-rGO/GCE電極上的氧化峰電流為背景電流I0，記錄氨芐西林標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度c與ΔIpa（I0-Ipa）的關(guān)系，并繪制如圖5a所示的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到傳感器的線性方程為：ΔIpa（μA）=1.1214（μA）+1.4461c（μmol·L-1）（r=0.997），線 性 范 圍 為3.00×10-9～7.00×10-6mol·L-1，靈敏度為1.4461 μA/（μmol·L-1），最低檢出限為1.26×10-9mol·L-1（S/N=3）。隨著氨芐西林濃度逐漸增大，NIP傳感器的ΔIpa均約為0，這是因?yàn)镹IP傳感器沒(méi)有氨芐西林的特異性識(shí)別位點(diǎn)，不能選擇性識(shí)別氨芐西林。

為研究電沉積制備的AuNPs-rGO復(fù)合材料對(duì)氨芐西林檢測(cè)靈敏度的影響，用同樣的方法直接在裸GCE電極表面電聚合氨芐西林MIP膜，得到氨芐西林MIP/GCE電極，用于1×10-9～5×10-3mol·L-1氨芐西林標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定，得到如圖5b所示的標(biāo)準(zhǔn)曲線，傳感器的線性方程為：ΔIpa（μA）=1.12054（μA）+0.18391c（μmol·L-1）（r=0.993），線 性 范 圍 為7×10-8～5×10-5mol·L-1，檢測(cè)靈敏度為0.18391 μA/（μmol·L-1），檢出限為6.35×10-8mol·L-1（S/N=3）。由此可知，在GCE電極表面電沉積AuNPs-rGO復(fù)合材料可有效提高傳感器的檢測(cè)靈敏度。

圖5 三種傳感器的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Calibration curves of three sensors

2.5 傳感器的選擇性研究

為研究該分子印跡電化學(xué)傳感器對(duì)氨芐西林的特異選擇性，選擇氨芐西林的兩種結(jié)構(gòu)類似物阿莫西林和頭孢氨芐作為干擾物。利用洗脫后的MIP/AuNPs-rGO/GCE電極分別對(duì)3.00×10-6mol·L-1氨芐西林及3.00×10-5mol·L-1阿莫西林和頭孢氨芐進(jìn)行測(cè)定，如圖6所示，該分子印跡電化學(xué)傳感器對(duì)氨芐西林的電流響應(yīng)ΔIpa明顯比其它兩種干擾物質(zhì)的電流響應(yīng)高，說(shuō)明該傳感器對(duì)氨芐西林具有很高的選擇性。這是因?yàn)橄疵摵蟮腗IP薄膜電極產(chǎn)生的立體孔穴的大小和形狀都與氨芐西林匹配，它們之間的特異性相互作用發(fā)揮了重要的作用。

圖6 傳感器的選擇性Fig.6 The selectivity of the sensor

2.6 傳感器的再現(xiàn)性及穩(wěn)定性研究

為研究該傳感器的再現(xiàn)性，在相同實(shí)驗(yàn)條件下用相同方法制備3個(gè)氨芐西林分子印跡電化學(xué)傳感器，并用它們檢測(cè)3.00×10-6mol·L-1氨芐西林，經(jīng)過(guò)反復(fù)洗脫和檢測(cè)三次后，得到的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.9%，說(shuō)明該傳感器具有良好的再現(xiàn)性。

傳感器的儲(chǔ)存穩(wěn)定性是評(píng)估其實(shí)際應(yīng)用性的一個(gè)重要參數(shù)。將制備的3個(gè)傳感器室溫放置兩周后，用它們檢測(cè)3.00×10-6mol·L-1氨芐西林，發(fā)現(xiàn)該傳感器的電流響應(yīng)約為其初始電流響應(yīng)的92%，說(shuō)明該傳感器有很好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。

3 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)電沉積條件優(yōu)化，在GCE電極表面一步電沉積制備AuNPs-rGO復(fù)合材料，電沉積過(guò)程簡(jiǎn)單、可控、高效，制得的AuNPs-rGO/GCE電極具有良好的電化學(xué)性質(zhì)、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。將AuNPs-rGO復(fù)合材料的優(yōu)良性質(zhì)與具有特異選擇性的MIP相結(jié)合，構(gòu)建檢測(cè)靈敏度高、選擇性好、穩(wěn)定性強(qiáng)的氨芐西林電化學(xué)傳感器。該傳感器的檢測(cè)靈敏度是利用裸GCE電極構(gòu)建的傳感器檢測(cè)靈敏度的7.86倍，說(shuō)明一步電沉積法制備AuNPs-rGO復(fù)合材料在電化學(xué)傳感器構(gòu)建方面具有較高的應(yīng)用價(jià)值。