王振軍，羅國良，程悅寧，馮二凱，劉利芳，郭 利，于清平，朱先鵬，鄧旭明，王建鋒*

(1.吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130122；3.通化縣農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊(duì)，吉林 通化 134100；4.柳河縣農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊(duì)，吉林 柳河 135300)

近年，貉源細(xì)小病毒(RDPV)在我國主要貉養(yǎng)殖地區(qū)(東北三省、河北、山東)普遍流行，尤以夏季(6-7月份)仔貉分窩時(shí)最為嚴(yán)重，病貉主要表現(xiàn) 為嚴(yán)重的腹瀉、脫水、消瘦等胃腸炎癥狀，嚴(yán)重者以死亡告終[1]。該病發(fā)病及死亡率均較高，對我國貉養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失。因RDPV感染貉主要表現(xiàn)為腸炎癥狀，故稱該病為RDPV性腸炎。

RDPV性腸炎是由RDPV引起的一種急性、烈性、高度接觸性傳染病。該病1982年由NEUVONEN等[2]首次報(bào)道犬細(xì)小病毒(CPV)感染貉，此后國外和我國黑龍江地區(qū)也偶見相關(guān)報(bào)道[3-4]，起初普遍認(rèn)為是CPV跨種傳播感染貉[5-7]，直到1988年由夏咸柱等[8]從病貉中分離出RDPV才確認(rèn)RDPV在我國的流行。長期以來，國內(nèi)外科研人員對RDPV性腸炎的報(bào)道及相關(guān)研究相對較少，但近年來，尤其2015年之后，RDPV性腸炎有區(qū)域性集中暴發(fā)的趨勢，對我國貉養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失，這引起了科研人員對RDPV的再次關(guān)注[9-10]。

RDPV為細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬成員，是單鏈DNA病毒[11]。其基因結(jié)構(gòu)與細(xì)小病毒屬其他成員結(jié)構(gòu)類似，與CPV、水貂細(xì)小病毒(MEV)、貓細(xì)小病毒(FPV)有較高的同源性，甚至與犬細(xì)小病毒滅活苗和水貂細(xì)小病毒滅活苗存在一定交叉保護(hù)[12]。本研究從疑似RDPV感染的貉腸道及其內(nèi)容物中成功分離1株病毒，進(jìn)一步對分離得到的病毒進(jìn)行PCR鑒定、病毒分離培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察、豬紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)、基于VP2基因建立的系統(tǒng)發(fā)生樹分析、同源性分析、動物回歸試驗(yàn)等方法的鑒定并對其VP2基因組進(jìn)行了克隆測序分析[13-14]，以期了解河北地區(qū)RDPV性腸炎的流行趨勢，為進(jìn)一步研發(fā)RDPV性腸炎疫苗及相關(guān)診斷試劑提供資源和參考。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)材料病料樣品取自河北某貉養(yǎng)殖場的發(fā)病貉，采集病貉的腸道及其內(nèi)容物用于RDPV的分離、培養(yǎng)和鑒定。F81貓腎細(xì)胞購自上海細(xì)胞庫，傳代后保存于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所。

M.M培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清由長春西諾生物科技有限公司提供；ExTaq DNA聚合酶、dNTP、pMD18-T載體均購自寶生物工程(大連)有限公司；DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司；DNA Marker購自北京全式金生物科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純，購自國藥化學(xué)試劑。

10只2～12月齡的健康試驗(yàn)貉，抗RDPV HI抗體效價(jià)≤1∶8，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所毛皮動物試驗(yàn)基地。

1.2 病料樣品處理取腸道及內(nèi)容物加入MEM充分研磨后制成10%的懸液，研磨過程中反復(fù)凍融3次，加入等體積氯仿混勻，靜置30 min。經(jīng)10 000 r/min 4℃離心30 min取上清，通過0.22 μm的濾膜過濾。加入每毫升1 000 U雙抗4℃過夜，-70℃保存。

1.3 病料樣品PCR鑒定取處理的病料懸液用DNA提取試劑盒提取其基因組，根據(jù)康洪濤等[15]設(shè)計(jì)RDPV檢測引物進(jìn)行PCR檢測，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.4 病毒分離、培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)將處理好的病料樣品按2%的比例同步接種于生長良好的F81細(xì)胞，設(shè)立正常細(xì)胞對照，置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)并逐日觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，當(dāng)80%細(xì)胞出現(xiàn)CPE時(shí)收獲接毒細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng)3～6代，保存在-70℃以下；取第6代病毒細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融數(shù)次后經(jīng)4℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液經(jīng)0.5%磷鎢酸負(fù)染后進(jìn)行電鏡觀察病毒形態(tài)。

1.5 豬紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)取第1～6代病毒培養(yǎng)物進(jìn)行豬紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)鑒定分離毒株的血凝特性。

1.6 病毒理化性質(zhì)測定選取第6代病毒培養(yǎng)物，分別對其進(jìn)行乙醚敏感性試驗(yàn)、耐酸性試驗(yàn)、耐熱性試驗(yàn)同時(shí)設(shè)立對照組，以測定其理化性質(zhì)。具體操作如下：取病毒液1.6 mL，加乙醚0.4 mL，振蕩10 min，置于2～8℃冰箱24 h。次日去除水相并使乙醚完全揮發(fā)，測定乙醚處理前和處理后病毒含量變化，判定病毒對乙醚的敏感性；取病毒液2 mL，先用酸將其pH調(diào)至3.0，在37℃作用1 h后，再用碳酸氫鈉將pH調(diào)至7.2，然后測定每毫升病毒含量的變化，判定病毒對酸的耐受性；取病毒液2 mL，56℃水浴1 h，測定每毫升病毒含量的變化，判定病毒對熱的耐受性。

1.7 病毒核酸的提取及VP2基因的擴(kuò)增通過DNA提取試劑盒提取病毒DNA，根據(jù)GenBank中已登錄的RPDV序列，設(shè)計(jì)合成其VP2序列引物：RDPV-F：5′-GCCGGTGCAGGACAAGTA-3′；RDPV-R：5′-CAACCCACACCATAACAACA-3′。利用設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增病毒的VP2序列，預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長度為1 755 bp。

1.8 病毒VP2基因的遺傳進(jìn)化分析及同源性分析將擴(kuò)增得到的VP2基因進(jìn)行測序后獲得病毒VP2基因序列，利用生物信息學(xué)軟件DNAStar、Mega 5.0分析分離病毒以及GenBank中登錄的其他參考株序列的同源性，構(gòu)建分離病毒VP2基因及參考序列的遺傳進(jìn)化樹并分析其遺傳進(jìn)化關(guān)系。

1.9 動物回歸試驗(yàn)選取10只健康貉并對其進(jìn)行分組，試驗(yàn)組5只，對照組5只。用第6代病毒細(xì)胞培養(yǎng)物對試驗(yàn)貉進(jìn)行人工感染試驗(yàn)，接種途徑為灌服，接種劑量為5 mL(HA效價(jià)210、含5×107TCID50)，對照組接種相應(yīng)體積的正常細(xì)胞培養(yǎng)物，隔離飼養(yǎng)，連續(xù)觀察14 d，逐日對試驗(yàn)貉的精神、食欲、體溫、糞便情況進(jìn)行記錄，同時(shí)采集試驗(yàn)貉的糞便樣品進(jìn)行豬紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)檢測。

2 結(jié)果

2.1 病料樣品PCR鑒定結(jié)果病料樣品經(jīng)RDPV檢測引物PCR鑒定后，結(jié)果顯示，擴(kuò)增出長度近573 bp的特異性條帶，與預(yù)期的目的片段長度一致(圖1)。結(jié)果表明，該病料樣品中含有RDPV。

2.2 病毒分離、培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果將處理的病料按照2%的比例同步接種于生長良好的F81細(xì)胞，連續(xù)盲傳3代，傳至第3代72 h后，細(xì)胞出現(xiàn)脫落、拉網(wǎng)、聚集等明顯的CPE，而對照組細(xì)胞生長狀態(tài)正常，未見異常變化(圖2)。繼續(xù)傳至第6代后對其進(jìn)行標(biāo)記并保存在-70℃以下；對病毒進(jìn)行負(fù)染后在電鏡下觀察，可見直徑約25 nm的球狀、無囊膜、無纖突的病毒樣粒子，這與細(xì)小病毒粒子的大小相符(圖3)。結(jié)果表明，分離到的病毒株為細(xì)小病毒。

A.正常F81細(xì)胞；B.病料樣品接種F81細(xì)胞后72 h出現(xiàn)的CPE

圖3 電鏡下的病毒粒子(40 000×)

2.4 豬紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)結(jié)果以第1～6代病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行血凝-血凝抑制試驗(yàn)，結(jié)果顯示，第1～6代病毒的血凝價(jià)分別為1∶512,1∶512,1∶1 024,1∶1 024,1∶1 024和1∶1 024(圖4)。結(jié)果表明，所分離的細(xì)小病毒具有豬紅細(xì)胞凝集特性。

1～6.第1～6代病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物；7～8.正常細(xì)胞對照

2.5 病毒理化性質(zhì)測定結(jié)果第6代毒種培養(yǎng)物經(jīng)乙醚處理、酸處理和56℃高溫處理后，試驗(yàn)組和對照組病毒效價(jià)無明顯差異(表3)。結(jié)果表明，分離的病毒能耐受乙醚、酸和熱處理。

表1 病毒培養(yǎng)物理化特性試驗(yàn)結(jié)果 TCID50/mL

2.6 病毒分子生物學(xué)鑒定、序列分析及同源性比對結(jié)果分離株VP2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果(圖5)，顯示，在1 755 bp處有目的條帶，片段大小符合預(yù)期，進(jìn)一步證實(shí)分離株為RDPV。分離株VP2序列測序后與GenBank中具有代表性的CPV、FPV、MEV以及RDPV等20余株病毒的VP2基因進(jìn)行對比并建立進(jìn)化樹(圖6)，結(jié)果顯示，分離株VP2基因序列與CPV-b2毒株VP2序列相似度較高，位于同一分支上，表明分離株VP2序列與CPV-b2毒株親緣關(guān)系最近；CPV-b2毒株VP2基因序列與RDPV-HLJ11-1、RDPV-LN-10-1、RDPV-HeB-10-1、Abashiri/MEV以及CU-4/FPV毒株VP2基因序列相似性均較高，位于同一分支且在這些序列的上游，表明以上參考株在遺傳關(guān)系上較近，提示RDPV、MEV、FPV均與CPV-b2有關(guān)，但是否是由CPV適應(yīng)不同宿主后形成的新類型仍需更多數(shù)據(jù)的證實(shí)。

M.DL2000 Marker；1.VP2基因擴(kuò)增結(jié)果

圖6 RDPV-HeB17分離株VP2基因序列進(jìn)化樹

與參考毒株VP2序列進(jìn)行同源性比對，結(jié)果顯示，其同源性在98.4%～99.5%之間，其中與CU-4-FPV株同源性最低為98.4%，與CPV-b-2株同源性最高為99.5%。此外，本研究中的分離株與國內(nèi)參考序列對比發(fā)現(xiàn)其同源性要高于國外序列參考株，由此可推測，該分離株在我國可能有相同的起源。

2.7 動物回歸試驗(yàn)結(jié)果對健康試驗(yàn)貉分組后進(jìn)行人工感染試驗(yàn)，結(jié)果顯示，4只試驗(yàn)組貉分別在攻毒后第5和6天開始出現(xiàn)精神不振、食欲減退、腹瀉、便血等嚴(yán)重的腸炎臨床癥狀，但是體溫并無顯著升高；隨著病情發(fā)展出現(xiàn)食欲廢絕、消瘦脫水、個(gè)別病情嚴(yán)重的病貉出現(xiàn)死亡；采集糞便樣品處理后進(jìn)行紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)，結(jié)果顯示對豬紅細(xì)胞血凝(HA)效價(jià)均>1∶128(表2)。對死亡試驗(yàn)貉剖檢可見典型的腸炎癥狀：胃表面蒼白，胃黏膜發(fā)紅,腸系膜淋巴結(jié)腫大，腸黏膜出血，腸內(nèi)有血樣內(nèi)容物,肝脾腫大(圖7)，對照組試驗(yàn)貉無任何臨床癥狀。以上結(jié)果表明，所分離病毒可對試驗(yàn)貉造成再次感染，動物回歸試驗(yàn)成立。將所分離病毒株命名為RDPV-HeB17。

表2 動物回歸試驗(yàn)結(jié)果(第9天)

圖7 攻毒后照片(糞便、臟器病變)

3 討論

RDPV自20世紀(jì)80年代分離鑒定以來一直鮮有報(bào)道。但隨著我國貉養(yǎng)殖數(shù)量不斷增加，地區(qū)間頻繁引種以及貉養(yǎng)殖環(huán)境治理欠佳，RDPV近年時(shí)有暴發(fā)，多位科研人員對該病均有報(bào)道，使貉養(yǎng)殖業(yè)遭受嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。針對RDPV，目前尚無有效疫苗產(chǎn)品問世，加強(qiáng)RDPV流行病學(xué)及致病機(jī)制的研究及其疫苗的研發(fā)投入對RDPV的防控至關(guān)重要。

本研究對所分離RDPV進(jìn)行PCR鑒定、病毒分離培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察、豬紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)、基于其VP2基因建立系統(tǒng)發(fā)生樹、同源性分析，并以CPV、FPV、MEV以及RDPV進(jìn)行參考，結(jié)果顯示所分離RDPV-HeB17與RDPV-HLJ、RDPV-LN親緣關(guān)系較近，調(diào)查這些毒株的來源可知，這些毒株的地緣關(guān)系也非常近(分別位于河北、黑龍江、遼寧)，根據(jù)對以上地區(qū)貉養(yǎng)殖場的走訪得知，這些地區(qū)之間存在頻繁的引種，這或許對該病的流行起到了促進(jìn)作用。進(jìn)化分析還顯示該分離株與CPV、貓泛白細(xì)胞減少癥病毒(FPV)、水貂腸炎病毒(MEV)也處于同一分支，且CPV處于分支的上游，說明CPV、FPV、MEV、RDPV這些肉食獸細(xì)小病毒親緣關(guān)系較近，這也再次驗(yàn)證了RDPV極有可能是由CPV變異而來，但使用CPV疫苗免疫貉又不能使貉獲得完全保護(hù)，也證實(shí)了通過長時(shí)間的自然選擇和環(huán)境壓力，已經(jīng)逐漸形成了一個(gè)新的適應(yīng)在貉體內(nèi)增長繁殖的細(xì)小病毒。

分離株VP2基因與參考毒株VP2基因序列同源性比對結(jié)果顯示，與CU-4-FPV株同源性最低為98.4%，與CPV-b-2株同源性最高為99.5%。氨基酸對比結(jié)果顯示，分離株VP2蛋白序列與RDPV-HeB10-1、RDPV-LN10-1、RDPV-HLJ11-1相比有3處突變，第27位氨基酸殘基由絲氨酸(S)突變?yōu)樘K氨酸(T)，第297位氨基酸殘基由絲氨酸(S)突變?yōu)楸彼?A)，第562位氨基酸殘基由纈氨酸(V)突變?yōu)榱涟彼?L)。有報(bào)道表明第562位氨基酸突變對RDPV宿主范圍有一定程度影響[10]，但第27位、第297位氨基酸突變對病毒的影響還不清楚，有待進(jìn)一步研究。

本研究從發(fā)病貉腸道及內(nèi)容物中成功分離到1株病毒，并對其進(jìn)行了一系列鑒定，證實(shí)該分離株為RDPV，命名為RDPV-HeB17。該毒株的分離對RDPV的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)，也為其疫苗的研制提供了材料。