黃旭升, 周雅莉, 史先飛, 高 宇, 董書言, 李潤植, 王計(jì)平

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所, 太谷 030801）

紫蘇[Perilla frutescens（L.）Britt.] 別名桂荏、紅蘇、香蘇、赤蘇、紅紫蘇等, 是唇形科紫蘇屬一年生草本植物[1], 原產(chǎn)于亞洲東部, 在我國已有2 000多年的栽培歷史[2]。紫蘇對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性非常強(qiáng), 對(duì)土壤條件要求不高, 在砂土、壤土和黏土均能良好地生長, 在我國各地廣泛種植[3]。作為一種新型的多用途的經(jīng)濟(jì)作物, 紫蘇種質(zhì)資源豐富, 也是國家衛(wèi)生部首批頒布的既是藥品又是食品的60種藥食植物之一[4]。紫蘇含有特殊的營養(yǎng)成分和豐富的活性物質(zhì), 具有多種應(yīng)用價(jià)值, 其研究與應(yīng)用越來越引起國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。紫蘇籽出油率高達(dá)46%～58%, 其中不飽和脂肪酸[油酸（C18:1, 約17.1%）、亞油酸（C18:2, 約15.7%）和亞麻酸（C18:3, 約60.7%）] 含量占總油脂含量的90%左右[5-6]。α-亞麻酸（ALA, 18:3Δ9, 12, 13）是一類健康有益型高值脂肪酸, 是人體維持生命不可或缺的必需脂肪酸[7]。目前市場上主要油料作物[如大豆（Glycine max）、油菜（Brassica napus）、玉米（Zea mays）、花生（Arachis hypogaea）和向日葵（Helianthusa nnuus）] 種子中α-亞麻酸含量均低于總油脂含量的10%[8], 因此, 優(yōu)質(zhì)的紫蘇籽油能夠作為人類膳食中α-亞麻酸的理想來源。

植物脂肪酸的代謝過程有著高度的復(fù)雜性, 目前已克隆獲得了一些相關(guān)的關(guān)鍵酶基因[9-10], 但通過分子生物學(xué)手段改造單個(gè)酶基因以提高植物脂肪酸含量的困難較大[11]。研究發(fā)現(xiàn), 一些轉(zhuǎn)錄因子如LEC1（LEAFYCOTYLEDON1）、WRI1（WRINKLED1）和FUS3（FUSCA3）等可調(diào)控植物油脂合成途徑中關(guān)鍵酶基因的表達(dá), 進(jìn)而影響植物油脂含量[12]。WRI1是一類植物特異轉(zhuǎn)錄因子, 屬于AP2/EREBP（APETALA2/ethylene-responsive element binding protein）轉(zhuǎn)錄因子超家族中的AP2亞家族, 包含2個(gè)高度保守的AP2結(jié)構(gòu)域[13]。Focks和Benning[14]于1998年首次在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中發(fā)現(xiàn)了WRI1轉(zhuǎn)錄因子。Cernac和Benning[15]于2004年發(fā)現(xiàn), 擬南芥WRI1缺失突變體和過表達(dá)AtWRI1植株種子中含油量分別降低約80%和提高約20%。Ma等[16]將油棕（Elaeis guineensis）WRI1轉(zhuǎn)入擬南芥WRI1缺失突變體中, 發(fā)現(xiàn)突變體表型得到恢復(fù), 說明油棕WRI1具有和擬南芥WRI1相似的功能。在甘藍(lán)型油菜中過表達(dá)BnWRI1, 發(fā)現(xiàn)其種子含油量升高18%～38%, 葉片含油量升高28%～63%[17]。Yang等[18]將蓖麻（Ricinus communis）WRI1轉(zhuǎn)入煙草中, 發(fā)現(xiàn)煙草細(xì)胞油脂含量升高。

目前, 已從多種植物中克隆得到WRI1轉(zhuǎn)錄因子, 它們均在植物油脂合成代謝途徑中發(fā)揮著重要作用, 但紫蘇WRI1的功能和作用機(jī)制尚不清楚。本研究從紫蘇基因組中鑒定得到WRI1, 并克隆獲得其完整編碼序列（coding sequence, CDS）, 通過生物信息學(xué)分析工具預(yù)測WRI1轉(zhuǎn)錄因子的序列特征、理化性質(zhì)及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系等, 應(yīng)用半定量PCR（semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, sqRT-PCR）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR）技術(shù)分析WRI1在紫蘇不同組織的時(shí)空表達(dá)特征及其在低溫脅迫下的表達(dá)模式, 為進(jìn)一步探究紫蘇WRI1在低溫脅迫響應(yīng)和油脂代謝中的生物學(xué)功能及在其他植物油脂品質(zhì)改良中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

本試驗(yàn)選擇含油量較高的紫蘇優(yōu)選品種‘晉紫蘇1號(hào)’為材料, 將其種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)田。試驗(yàn)取材為‘晉紫蘇1號(hào)’的根、莖、葉、花以及開花后10、20、30和40 d的種子, 液氮速凍后立即存于-80 ℃超低溫冰箱。

選擇籽粒飽滿的 ‘晉紫蘇1號(hào)’種子, 自來水沖洗20 min后用0.01%的升汞溶液浸泡8 min（期間搖晃2～3次）, 無菌水沖洗3～4次后置于放有雙層發(fā)芽紙的培養(yǎng)皿中, 放于光照培養(yǎng)箱中萌發(fā), 25℃光暗交替（光照：黑暗=16 h∶8 h）, 相對(duì)濕度為60%, 光照為15 000 lx, 期間保持發(fā)芽床濕潤。待生長至含有兩片真葉時(shí), 篩選并保留長勢一致、狀態(tài)良好的幼苗, 轉(zhuǎn)移至霍格蘭營養(yǎng)液[Ca(NO3)2·4H2O 945.0 mg/L, KNO3607.0 mg/L, NH4H2PO4115.0 mg/L, MgSO4·7H2O 493.0 mg/L][19]中繼續(xù)生長, 待幼苗長至6片真葉時(shí)對(duì)其進(jìn)行4℃低溫脅迫處理。分別取脅迫0、3、6、9、12、24、48 h的幼苗, 液氮速凍后放于-80℃超低溫冰箱備用。

1.2 紫蘇PfWRI1的鑒定

從GenBank中下載紫蘇基因組序列、CDS序列、全基因組蛋白序列和GFF注釋文件, 將全基因組蛋白質(zhì)序列建立本地?cái)?shù)據(jù)庫。從擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫TAIR（https://www.arabidopsis.org /）中查找AtWRI1, 得到其CDS序列, 以AtWRI1蛋白質(zhì)序列（NP_001030857.1）為探針, 使用BioEdit軟件進(jìn)行本地BLAST同源檢索, 通過SMART在線軟件（http://smart.embl-heidel-berg.de/）和CDD數(shù)據(jù)庫（Conserved Domains Datebase, http://ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/Wrpsb.cgi）進(jìn)一步篩選包含2個(gè)AP2保守結(jié)構(gòu)域的蛋白序列, 得到紫蘇WRI1。

1.3 紫蘇總RNA的提取、cDNA的合成及PfWRI1基因CDS克隆

使用艾德萊公司的EASY spin植物RNA快速提取試劑盒RN09（北京艾德萊生物科技有限公司）提取紫蘇不同組織和低溫脅迫下各樣品的總RNA。用BioDrop蛋白核酸濃度分析儀和瓊脂糖凝膠電泳檢測各樣品總RNA的量。使用GenStar（北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司）的反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。根據(jù)鑒定得到的PfWRI1序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物（表1）。以紫蘇不同組織的cDNA混樣為模板, 使用novoprotein（蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司）的Pfu DNA Polymerase高保真酶通過擴(kuò)增獲得PfWRI1基因的CDS區(qū)域。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃ 1 min 30 s；94℃ 30 s, 60℃ 30 s, 72℃ 2 min, 30次循環(huán)；72℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PfWRI1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物, 目的片段經(jīng)割膠回收和純化后連接到克隆載體pMD18-T上, 將重組質(zhì)粒pMD18-T-PfWRI1轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)中。通過菌落PCR篩選得到陽性克隆, 送安徽通用生物公司進(jìn)行測序驗(yàn)證。

表1 引物信息Tab. 1 Primers used in this study

1.4 紫蘇PfWRI1基因序列特征及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系 分析

通過在線軟件GSDS（Gene Structure Display Server, http://gsds.gao-lab.org/index.php）分析紫蘇Pf-WRI1基因的外顯子和內(nèi)含子分布情況。使用在線軟件 ProParam （http://web.expasy.org/protparam/）和Plant-mPLoc（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plantmulti/）預(yù)測PfWRI1編碼蛋白的分子量、氨基酸數(shù)、理論等電點(diǎn)等基本理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位。利用

SPOMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）和SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）網(wǎng)站對(duì)PfWRI1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。運(yùn)用 Jalview軟件對(duì)紫蘇PfWRI1和其他已報(bào)道物種的WRI1蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析, 使用MEGA11通過鄰接法（neighbor-joining, NJ）構(gòu)建WRI1蛋白序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹, 自舉檢驗(yàn)值（Bootstrap）設(shè)定為1 000, 其余參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)。應(yīng)用在線網(wǎng)站STRING （http://string-db.org/cgi/input.pl）構(gòu)建紫蘇PfWRI1蛋白的互作網(wǎng)絡(luò), 以擬南芥作為參照植物, 通過選擇數(shù)據(jù)庫中與紫蘇PfWRI1序列相似且得分最高的蛋白質(zhì)構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 紫蘇PfWRI1基因表達(dá)特性分析

根據(jù)PfWRI1基因編碼序列設(shè)計(jì)序列特異性引物, 目的基因PfWRI1和內(nèi)參基因Actin2的引物序列見表1。以紫蘇不同組織（根、莖、葉、花及開花后10、20、30和40 d的種子）的cDNA為模板, 進(jìn)行sqRT-PCR和qRT-PCR擴(kuò)增, 分析PfWRI1基因的時(shí)空表達(dá)特性。以低溫脅迫處理不同時(shí)間紫蘇幼苗的cDNA為模板, 選擇冷脅迫相關(guān)的Marker 基因DREB1A[20]作為陽性對(duì)照, 分別對(duì)PfDREB1A和PfWRI1進(jìn)行qRT-PCR分析（引物序列見表1）, 以探究PfWRI1基因在紫蘇幼苗中響應(yīng)低溫脅迫的分子機(jī)制。按照2×E-Taq PCR Master Mix（杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司）試劑盒進(jìn)行sqRT-PCR, 反應(yīng)體系為：2×E-Taq PCR Master Mix 5.0 μL, cDNA模板0.5 μL, 正向引物0.2 μL, 反向引物 0.2 μL, ddH2O 4.1 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s, 60℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 25次循環(huán)；72℃終延伸5 min。

以各樣品的cDNA為模板, 使用TB Green?Premix Ex Taq? II（Tli RNaseH Plus）試劑盒[TaKaRa, 寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司] , 在Bio-Rad CFX 96 TM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增, 分析PfWRI1在紫蘇不同組織和低溫脅迫下的表達(dá)量。每個(gè)樣品設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)。反應(yīng)體系為：TB Green-Premix Ex Taq 5.0 μL, cDNA 0.5 μL, 正向引物0.2 μL, 反向引物0.2 μL, ddH2O補(bǔ)足至10.0 μL。采用三步法進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增, 反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 2 min；95℃ 20 s, 60℃ 20 s, 72℃ 20 s, 40次循環(huán)。使用Excel和DPS處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫蘇PfWRI1的鑒定與基因結(jié)構(gòu)分析

以擬南芥AtWRI1的蛋白質(zhì)序列為檢索序列, 在紫蘇基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行本地BLAST檢索, 運(yùn)用SMART和CDD數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步篩選鑒定含2個(gè)AP2保守結(jié)構(gòu)域的蛋白序列, 去除冗余序列, 最終得到1個(gè)紫蘇WRI1, 命名為PfWRI1。對(duì)PfWRI1蛋白序列進(jìn)行分析（圖1）, 結(jié)果顯示：PfWRI1屬于AP2超家族中的成員, 其包含的2個(gè)AP2保守結(jié)構(gòu)域分別位于第66～132和166～228位氨基酸。使用在線數(shù)據(jù)庫GSDS對(duì)紫蘇、擬南芥和芝麻（Sesamum indicum）的WRI1基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析（圖2）發(fā)現(xiàn),PfWRI1基因含有6個(gè)內(nèi)含子和7個(gè)外顯子, 與擬南芥和芝麻的WRI1結(jié)構(gòu)相比, 內(nèi)含子和外顯子的分布基本一致。

2.2 紫蘇PfWRI1基因CDS克隆

以紫蘇根、莖、葉、花和不同發(fā)育時(shí)期種子的cDNA混樣為模板, 使用Pfu DNA Polymerase高保真酶擴(kuò)增得到PfWRI1基因的CDS序列, 將目的片段連接到pMD18-T載體上, 得到重組質(zhì)粒pMD18-TPfWRI1, 將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)中。通過菌落PCR擴(kuò)增得到長度為1 164 bp的條帶（圖3）, 經(jīng)測序驗(yàn)證該序列未發(fā)生突變, 說明通過克隆成功分離得到PfWRI1基因。

2.3 紫蘇PfWRI1基因編碼蛋白基本理化性質(zhì)、 亞細(xì)胞定位及蛋白結(jié)構(gòu)分析

通過在線網(wǎng)站ProParam對(duì)紫蘇PfWRI1編碼蛋白的基本理化性質(zhì)進(jìn)行分析（表2）, 結(jié)果顯示：Pf-WRI1轉(zhuǎn)錄因子相對(duì)分子質(zhì)量為43.58 kD, 共編碼氨基酸387個(gè), 理論等電點(diǎn)為8.18, 預(yù)測其為堿性蛋白。平均親水性指數(shù)（GRAVY）為-0.701, 屬于親水性蛋白, 不穩(wěn)定指數(shù)為57.63, 屬于不穩(wěn)定蛋白。

表2 PfWRI1蛋白的理化性質(zhì)Tab. 2 Physicochemical properties of PfWRI1 protein

使用在線網(wǎng)站SPOMA對(duì)PfWRI1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測（表3）, 結(jié)果顯示, 紫蘇PfWRI1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)包含4種元件, 其中α-螺旋占30.23%, 延伸鏈占8.79%, β-轉(zhuǎn)角占4.13%, 無規(guī)則卷曲占56.85%, 可推測α-螺旋和無規(guī)則卷曲為PfWRI1蛋白的主要結(jié)構(gòu)元件。通過Plant-mPLoc數(shù)據(jù)庫預(yù)測PfWRI1蛋白的亞細(xì)胞定位（表3）, 結(jié)果表明PfWRI1蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞核中。

表3 PfWRI1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu) Tab. 3 The secondary structure of PfWRI1 protein

利用SWISS-MODEL預(yù)測PfWRI1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu), 并進(jìn)行同源建模（圖4）。使用7et5.1.A蛋白為模板蛋白對(duì)紫蘇PfWRI1進(jìn)行同源建模分析, 結(jié)果表明：該模板蛋白與PfWRI1蛋白序列的相似度為35%, 覆蓋度為23%, 保守序列范圍在第65～158位氨基酸；X射線衍射顯示紫蘇PfWRI1蛋白和7et5.1.A蛋白都包含一條AP2/ERF and B3 domaincontaining transcription repressor TEM1多肽鏈, 且模板蛋白含有一個(gè)SO4配體, 而紫蘇PfWRI1蛋白無SO4配體。

2.4 紫蘇PfWRI1轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育分析

使用Jalview軟件對(duì)紫蘇、擬南芥、油菜、蓖麻、油梨（Persea americana）、芝麻、大豆的WRI1蛋白的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)（圖5）, 結(jié)果顯示：7個(gè)物種的WRI1蛋白均包含2個(gè)AP2保守結(jié)構(gòu)域, 即AP2-R1和AP2-R2；AP2-R2結(jié)構(gòu)域高度保守, 而AP2-R1結(jié)構(gòu)域保守性比AP2-R2 較低, 此外, AP2-R2結(jié)構(gòu)域中包含一段由18個(gè)氨基酸（VSKYRGARHHHNGRWEAR）組成的高度保守的序列；除AP2結(jié)構(gòu)域以外的兩端序列的差異性極大, 推斷AP2結(jié)構(gòu)域在WRI1蛋白行使功能時(shí)發(fā)揮重要的保守作用。

利用MEGA11對(duì)紫蘇PfWRI1蛋白序列與擬南芥、油梨和芝麻等14個(gè)物種的WRI1蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖6）。結(jié)果表明：PfWRI1轉(zhuǎn)錄因子與芝麻和油梨的親緣關(guān)系最近, 與燕麥、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）、山杏（Siberian apricot）和大豆的親緣關(guān)系最遠(yuǎn), 與油菜、擬南芥、油棕（Elaeis guineensis）、椰子（Cocos nucifera）的親緣關(guān)系較近。

圖6 各物種WRI1蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 6 Phylogenetic tree of WRI1 proteins from different plant species

2.5 紫蘇PfWRI1相互作用蛋白預(yù)測分析

植物油脂合成積累與逆境脅迫響應(yīng)等生物學(xué)過程通常涉及許多轉(zhuǎn)錄因子, 同一類轉(zhuǎn)錄因子也可能協(xié)同作用, 共同參與油脂合成積累與逆境脅迫響應(yīng)等的調(diào)控。將紫蘇PfWRI1蛋白序列提交到STRING在線數(shù)據(jù)庫中, 以模式植物擬南芥為基礎(chǔ), 檢索可能與PfWRI1蛋白相互作用的蛋白質(zhì), 并構(gòu)建互作網(wǎng)絡(luò)圖（圖7）。結(jié)果顯示, 在擬南芥中鑒定到一些和WRI1蛋白存在相互作用的其他蛋白, 如LEC1、FaTA、FATB、PDAT等, 這表明PfWRI1轉(zhuǎn)錄因子可能參與油脂合成積累的代謝調(diào)控。

圖7 紫蘇PfWRI1蛋白與擬南芥中蛋白的相互作用Fig. 7 Interaction of PfWRI1 protein with other proteins of A. thaliana

2.6 PfWRI1基因在紫蘇不同組織中的表達(dá)特性分析

為探究PfWRI1基因在紫蘇不同組織中的表達(dá)特性, 本研究通過sqRT-PCR和qRT-PCR檢測分析PfWRI1在紫蘇根、莖、葉、花和不同發(fā)育時(shí)期種子中的表達(dá)水平。sqRT-PCR結(jié)果顯示（圖8a）,Pf-WRI1在紫蘇葉和花中的表達(dá)最低, 在發(fā)育種子中的表達(dá)高于其他組織。qRT-PCR檢測結(jié)果進(jìn)一步表明（圖8b）,PfWRI1在紫蘇的各個(gè)組織中均有表達(dá), 在葉中的表達(dá)量最低, 隨著種子的發(fā)育, 表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的表達(dá)模式, 且在種子發(fā)育中后期（開花后30 d）的表達(dá)達(dá)到最高, 與sqRT-PCR檢測結(jié)果基本一致。以葉為對(duì)照,PfWRI1基因在根、莖、花中的表達(dá)量分別是葉中的4.99、4.66、1.60倍, 在種子發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)量分別是葉中的2.29、5.22、6.03、3.72倍。這些結(jié)果預(yù)示著PfWRI1可能在紫蘇油脂合成積累過程中發(fā)揮重要作用。

2.7 PfWRI1基因在紫蘇幼苗低溫脅迫下的表達(dá)分析

對(duì)紫蘇幼苗進(jìn)行4℃低溫脅迫處理（圖9a）, 通過qRT-PCR分析PfWRI1基因和低溫脅迫響應(yīng)Marker基因PfDREB1A在低溫脅迫不同時(shí)間的表達(dá)水平。qRT-PCR結(jié)果顯示（圖9b）, 紫蘇幼苗受到低溫脅迫時(shí),PfDREB1A基因的表達(dá)隨脅迫時(shí)間的延長呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢, 脅迫早期階段其表達(dá)急劇升高, 且在低溫脅迫9 h后達(dá)到最高, 表明PfDREB1A基因受到低溫脅迫的誘導(dǎo)。PfWRI1基因在低溫脅迫不同時(shí)間紫蘇幼苗中的表達(dá)呈現(xiàn)先上升后降低、隨后又急劇升高再下降的趨勢, 且在低溫脅迫12 h后,PfWRI1的表達(dá)量達(dá)到最高, 是對(duì)照組（0 h）的7.64倍；低溫脅迫處理3、6、9 h后Pf-WRI1的表達(dá)量較對(duì)照組表達(dá)量都有明顯的提升, 分別是對(duì)照組的1.71、2.38、1.51倍；低溫脅迫處理24、48 h后的表達(dá)量較對(duì)照組相比有所下降, 分別是對(duì)照組的0.86、0.92倍。據(jù)此推測,PfWRI1基因可能參與紫蘇幼苗冷脅迫響應(yīng)。

3 討論

紫蘇是一種新型的藥食同源的油料經(jīng)濟(jì)作物, 開發(fā)應(yīng)用價(jià)值非常廣泛。紫蘇籽油中不飽和脂肪酸含量較高, 尤其是α-亞麻酸, 是目前自然界中發(fā)現(xiàn)的α-亞麻酸含量最高的植物油。α-亞麻酸是一種健康有益型高值脂肪酸, 具有提高人體免疫力、改善睡眠、提高記憶力、增強(qiáng)智力、保護(hù)視力、降低血壓血脂等重要的生理功能[7]。研究表明, WRI1轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控植物（如擬南芥[15]、油棕[16]和蓖麻[18]等）油脂合成積累等生物學(xué)過程。大量試驗(yàn)研究表明, WRI1轉(zhuǎn)錄因子是植物油脂合成積累過程中的關(guān)鍵成員之一, 對(duì)植物種子油脂含量的提高具有重要的作用。如Yang等[21]在擬南芥中將AtWRI1基因進(jìn)行超表達(dá), 發(fā)現(xiàn)其種子含油量增加, 且引起幼苗中三酰甘油的積累。An等[22]在亞麻薺中超表達(dá)AtWRI1基因, 發(fā)現(xiàn)與野生型植株相比, 轉(zhuǎn)基因植株油脂產(chǎn)量提高了14%。Shen等[23]在玉米中過表達(dá)ZmWRI1基因, 發(fā)現(xiàn)玉米種子中含油量增加了46%, 而且種子發(fā)芽和植株生長未受到影響。柴國華等[24]通過RNAi 技術(shù)干擾BnWRI1基因的表達(dá), 發(fā)現(xiàn)油菜種子的含油量降低。但有關(guān)紫蘇WRI1轉(zhuǎn)錄因子的研究鮮見報(bào)道, 特別是WRI1在紫蘇生長發(fā)育、油脂合成積累及非生物脅迫應(yīng)答等過程中的調(diào)控機(jī)制仍不清楚, 因此, 對(duì)紫蘇WRI1轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行研究具有重要意義。

以擬南芥AtWRI1轉(zhuǎn)錄因子為索引, 本研究通過BLAST檢索在紫蘇基因組中獲得一個(gè)WRI1轉(zhuǎn)錄因子, 命名為PfWRI1, 通過分子克隆技術(shù)分離得到其完整CDS區(qū), 并對(duì)其序列特征和表達(dá)特性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：紫蘇PfWRI1轉(zhuǎn)錄因子共編碼氨基酸387個(gè), 屬于親水性蛋白；無規(guī)則卷曲和α-螺旋是其二級(jí)結(jié)構(gòu)中的主要結(jié)構(gòu)元件, 這與大豆[25]、花生[26]和沙棘[27]WRI1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)一致；亞細(xì)胞定位預(yù)測分析顯示, PfWRI1蛋白定位于細(xì)胞核中, 與大豆、花生等物種中WRI1的亞細(xì)胞定位結(jié)果基本一致[25-28]；紫蘇和其他物種的WRI1蛋白序列同源性比對(duì)顯示, 這些WRI1蛋白均包含2個(gè)AP2保守結(jié)構(gòu)域, 即AP2-R1和AP2-R2, 推測AP2結(jié)構(gòu)域在WRI1蛋白行使功能時(shí)發(fā)揮重要的保守作用；系統(tǒng)進(jìn)化分析表明, PfWRI1與芝麻和油梨WRI1的親緣關(guān)系最近；蛋白互作網(wǎng)絡(luò)顯示, WRI1蛋白與LEC1、FaTA、FATB和PDAT等油脂相關(guān)蛋白存在互作關(guān)系, 表明PfWRI1轉(zhuǎn)錄因子可能參與調(diào)控油脂合成積累等生物學(xué)過程。

通過sqRT-PCR和qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn),PfWRI1基因在紫蘇根、莖、葉、花和不同發(fā)育時(shí)期的種子中均有表達(dá), 隨著種子的發(fā)育, 表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的表達(dá)模式, 且在種子發(fā)育中后期（開花后30 d）的表達(dá)最高, 與紫蘇種子總脂肪酸和α-亞麻酸快速積累時(shí)期相吻合[29], 表明PfWRI1轉(zhuǎn)錄因子可能在紫蘇種子油脂合成積累過程中發(fā)揮重要作用。這與大豆GmWRI1a的表達(dá)結(jié)果相似[30], 據(jù)此推測它們可能具有相似的生物學(xué)功能。研究表明, 低溫脅迫能夠提高植物質(zhì)膜中脂肪酸的含量, 提高不飽和脂肪酸的指數(shù), 且與植物的抗寒性關(guān)系密切[31-32]。白瑞英等[33]研究發(fā)現(xiàn), 紫蘇幼苗經(jīng)低溫誘導(dǎo)處理后,PfFAD3基因在葉片中的表達(dá)量顯著上調(diào)。Domínguez等[34]研究表明, 番茄在低溫誘導(dǎo)下, 其ω-3FAD基因的表達(dá)明顯升高, 植株抗寒性增加。有研究表明,DREB1A等基因已經(jīng)被證實(shí)是和植物冷脅迫相關(guān)的Marker基因, 且在水稻等耐冷功能研究中上調(diào)表達(dá)[20], 可作為低溫脅迫相關(guān)的陽性對(duì)照來探究相關(guān)基因的耐冷分子機(jī)制。為探究PfWRI1對(duì)低溫脅迫的響應(yīng), 本研究對(duì)紫蘇幼苗進(jìn)行了4℃低溫脅迫處理, 分析了PfDREB1A和PfWRI1在低溫脅迫下的表達(dá)。結(jié)果顯示：PfDREB1A基因的表達(dá)隨脅迫時(shí)間的延長呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢, 脅迫早期階段其表達(dá)急劇升高, 且在低溫脅迫9 h后達(dá)到最高, 表明其響應(yīng)低溫脅迫；而PfWRI1的表達(dá)呈現(xiàn)先上升后降低、隨后又急劇升高再下降的模式, 且在低溫脅迫12 h時(shí)其表達(dá)量達(dá)到峰值, 預(yù)示著PfWRI1可能參與紫蘇幼苗冷脅迫響應(yīng)。

本研究通過克隆成功分離獲得紫蘇PfWRI1轉(zhuǎn)錄因子的完整CDS, 并對(duì)其序列特征和表達(dá)特異性進(jìn)行了分析, 為進(jìn)一步研究PfWRI1在紫蘇油脂合成積累和脅迫響應(yīng)中的分子機(jī)制及功能奠定基礎(chǔ), 以期為利用分子生物學(xué)手段提高紫蘇和其他油料作物的油脂含量、逆境抗性及改善其油脂品質(zhì)提供有益的參考。