魏文焯，梁振華，吳 艷，劉靜波，皮勁松，張 昊

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，動物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430064；2.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，綿陽 621010)

外泌體是由細(xì)胞內(nèi)多囊泡體分泌的富含生物活性物質(zhì)的細(xì)胞外囊泡，其主要形成機(jī)制為分泌細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)陷形成早期核內(nèi)體，早期核內(nèi)體經(jīng)體內(nèi)分選復(fù)合物調(diào)控形成多囊泡體，多囊泡體與細(xì)胞膜融合形成外泌體[1-2]。外泌體中的生物活性物質(zhì)主要包括核酸(mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA)、蛋白質(zhì)以及脂質(zhì)等物質(zhì)[3]，且外泌體不含線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)[4]。外泌體主要在細(xì)胞通訊、疾病診斷及機(jī)體免疫應(yīng)答等方面發(fā)揮作用，已成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[5-6]。目前，外泌體的相關(guān)研究主要集中在模式動物和人類疾病方面，而與動物腸道健康相關(guān)的外泌體研究較少。為此，作者梳理了腸細(xì)胞源、非腸細(xì)胞源外泌體對畜禽腸道健康的影響以及外泌體的研究方法，以期為后續(xù)研究提供參考。

1 腸細(xì)胞源外泌體對畜禽腸道健康的影響

腸道細(xì)胞包括上皮細(xì)胞、潘氏細(xì)胞、巨噬細(xì)胞與淋巴細(xì)胞等，它們直接暴露于微生物、外來抗原與消化道內(nèi)容物中，使維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)成為一個復(fù)雜且具有挑戰(zhàn)性的過程。腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡，就會引發(fā)腸道炎癥等疾病，從而對機(jī)體造成損傷。腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的平衡依賴于細(xì)胞外因子、細(xì)胞外囊泡和腸道屏障防御之間的共同作用[7]。細(xì)胞外囊泡主要包括外泌體、微粒、凋亡小體和癌小體，它們不僅負(fù)責(zé)細(xì)胞間的通訊工作，同時也是細(xì)胞與機(jī)體之間的通訊器[8]。因此，腸道菌群與腸道細(xì)胞之間的細(xì)胞外囊泡通過相互溝通，共同維護(hù)腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，對機(jī)體健康至關(guān)重要[9]。

1.1 腸上皮細(xì)胞源外泌體對畜禽腸道健康的影響

小腸上皮細(xì)胞是腸道的重要組成部分，在腸道免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，盡管它們不是專業(yè)的抗原呈遞細(xì)胞，但它們具有主要組織相容性復(fù)合體(histocompatibility complex，MHC)Ⅰ和Ⅱ[10]。有研究表明，小腸上皮細(xì)胞可分泌外泌體，且外泌體與親代細(xì)胞含有相同的免疫調(diào)節(jié)分子與MHCⅠ和MHCⅡ。小腸上皮細(xì)胞分泌的外泌體通常從細(xì)胞的頂部或基底外側(cè)釋放，可攜帶A33抗原，A33抗原被認(rèn)為是小腸上皮細(xì)胞外泌體的標(biāo)志物[10]。外泌體可與樹突狀細(xì)胞相互作用，通過免疫調(diào)節(jié)信號刺激具有耐受性的樹突狀細(xì)胞、調(diào)節(jié)T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞成熟。Ayyar等[11]研究表明，小腸上皮細(xì)胞外泌體通過分泌膜聯(lián)蛋白A1、整合素、細(xì)胞因子和趨化因子幫助維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)，誘導(dǎo)耐受性免疫反應(yīng)，還可分泌髓過氧化物酶來保護(hù)腸道免疫屏障免受細(xì)菌入侵，髓過氧化物酶會產(chǎn)生抗細(xì)菌的氧化應(yīng)激。綜上所述，腸上皮細(xì)胞源外泌體可攜帶生物活性物質(zhì)或與樹突狀細(xì)胞相互作用等方式維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。

1.2 腸道免疫細(xì)胞源外泌體對畜禽腸道健康的影響

腸道是機(jī)體的消化器官，也是機(jī)體重要的免疫器官，處于機(jī)體免疫防御的最前線。腸道內(nèi)有多種免疫細(xì)胞，其中包括樹突狀細(xì)胞、腸道T細(xì)胞與先天淋巴樣細(xì)胞等[12]。據(jù)報(bào)道，腸道內(nèi)多種免疫細(xì)胞均可分泌外泌體，在維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中扮演重要角色[13]。樹突狀細(xì)胞是腸道免疫系統(tǒng)的專職抗原呈遞細(xì)胞，可在感知抗原時啟動免疫反應(yīng)，根據(jù)親本樹突狀細(xì)胞的階段和成熟，樹突狀細(xì)胞衍生的外泌體可能具有免疫刺激/抑制作用[14]。中性粒細(xì)胞源外泌體含有miR-23a、miR-155和髓過氧化物酶，被腸上皮細(xì)胞吸收后可誘導(dǎo)雙鏈斷裂并減緩結(jié)腸上皮的傷口愈合[15]。此外，Ayyar等[11]研究發(fā)現(xiàn)，腸道免疫細(xì)胞源的外泌體通過誘導(dǎo)免疫耐受和觸發(fā)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞激活而抑制T輔助細(xì)胞來促進(jìn)抗炎反應(yīng)，經(jīng)外泌體處理的免疫細(xì)胞可進(jìn)一步分泌外泌體，從而促進(jìn)抗炎反應(yīng)。綜上所述，腸道免疫細(xì)胞源外泌體可通過分泌miRNA、髓過氧化物酶或激活調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等途徑減緩腸道炎癥反應(yīng)。

2 非腸源外泌體對畜禽腸道健康的影響

腸源外泌體主要通過細(xì)胞間的旁分泌，在腸細(xì)胞內(nèi)部發(fā)揮作用。而非腸源外泌體主要通過外源添加等方式影響腸道細(xì)胞間通訊與相關(guān)基因表達(dá)。

2.1 外泌體與腸道菌群

腸道內(nèi)微生物菌群構(gòu)成機(jī)體腸道的微生物屏障。正常情況下，腸道微生態(tài)處于平衡狀態(tài)，抵抗病原菌的黏附、定植和入侵，而腸道微生物穩(wěn)態(tài)打破會造成各種疾病發(fā)生，影響機(jī)體健康。外泌體是一種內(nèi)源性的調(diào)節(jié)物質(zhì)，可影響腸道菌群的組成與生長。Zhou等[14]研究表明，對C57BL/6型小鼠分別飼喂牛乳外泌體缺乏飼糧(exosome-and RNA-depleted，ERD)與牛乳外泌體充足飼糧(exosome-and RNA-sufficient，ERS)后，發(fā)現(xiàn)牛乳外泌體改變了小鼠盲腸中的微生物群落，喂食ERD與ERS的小鼠盲腸中，微生物菌群中3個門、7個科和52個操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)出現(xiàn)顯著差異。其中，15和47周齡飼喂ERS的小鼠腸道中軟壁菌門的豐度是飼喂ERD小鼠的3倍，7和47周齡飼喂ERS的小鼠腸道中毛螺菌科的4個OTUs豐度高于飼喂ERD小鼠的2倍。Teng等[16]研究發(fā)現(xiàn)，植物來源的外泌體納米顆粒可以被被腸道微生物群吸收，并含有改變微生物組成和宿主本身的RNA。此外，Yu等[17]用牛乳外泌體與大腸桿菌、乳酸菌混合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌與乳酸菌的生產(chǎn)速率得到了顯著提高。上述研究表明，外源外泌體可參與腸道菌群與機(jī)體間的相互作用，并改變機(jī)體腸道菌群的組成與豐度。

2.2 外泌體與腸道干細(xì)胞的增殖凋亡

外界環(huán)境的刺激可使動物發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致腸道上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，但腸上皮細(xì)胞凋亡失衡會導(dǎo)致腸道通透性和屏障功能障礙增加，導(dǎo)致多種急慢性腸道疾病[18]。因此，促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的增殖分化，對維持腸道屏障功能的完整性具有重要作用。外泌體中含有多種生物活性物質(zhì)，可使腸道干細(xì)胞的增殖分化能力顯著提高。研究表明，腸肌成纖維細(xì)胞來源的外泌體中的miR-125a/b可通過靶向骨髓細(xì)胞白血病1基因(myeloid cell leukemia-1，MCL1)的3′-UTR區(qū)域，調(diào)節(jié)大鼠腸上皮細(xì)胞的增殖[19]。在缺氧條件下，牦牛乳源外泌體顯著促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞中氧敏感脯氨酸羥化酶-1(prolyl hydroxylase，PHD1)的表達(dá)，降低缺氧誘導(dǎo)因子-α及其下游靶血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)，并降低p53蛋白的含量，從而促進(jìn)缺氧狀態(tài)下小腸上皮細(xì)胞的增殖[20]。Zhou等[21]研究發(fā)現(xiàn)，人乳源外泌體可促進(jìn)腸道發(fā)育，其機(jī)制可能為外泌體中的circRNA競爭性結(jié)合miRNA，調(diào)控VEGF信號通路，從而促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的增殖與遷移。趙偉[22]在研究腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常時發(fā)現(xiàn)，大鼠腸神經(jīng)嵴干細(xì)胞源的外泌體可抑制大鼠腸神經(jīng)嵴干細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，機(jī)制可能為外泌體中circCDR1as的表達(dá)下調(diào)，從而抑制大鼠腸神經(jīng)嵴干細(xì)胞增殖與遷移，提示外泌體circRNA在維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中扮演重要角色。Xie等[23]通過構(gòu)建小鼠腸道損傷模型，在體內(nèi)體外均證明豬乳源外泌體可抑制脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的小鼠腸道上皮細(xì)胞凋亡，提高腸道緊密連接蛋白的表達(dá)，降低TLR4/NF-κB信號通路激活，緩解小鼠的腸道損傷。Chen等[24]研究表明，豬乳源外泌體可顯著促進(jìn)尾型同源盒轉(zhuǎn)錄因子2(CDX2)、胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R)和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá)，抑制參與腸道增殖的p53基因表達(dá)，并顯著提高小鼠腸道組織的絨毛高度、隱窩深度和絨毛長度與隱窩深度的比值。此外，Melnik等[25]研究發(fā)現(xiàn)，外泌體中miR-21可調(diào)控mTOR1通路，促進(jìn)腸道干細(xì)胞的增殖。綜上所述，外泌體中豐富的生物活性物質(zhì)可以調(diào)控機(jī)體中相關(guān)基因與蛋白質(zhì)的表達(dá)，抑制腸道上皮細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)腸道干細(xì)胞的增殖，保護(hù)腸道屏障功能的完整性。

2.3 外泌體與腸道炎癥

炎癥是生物組織受到某種刺激如外傷、感染等損傷因子的刺激所發(fā)生的一種以防御反應(yīng)為主的基本病理過程，涉及到多種類型的免疫和非免疫細(xì)胞的參與[26]?，F(xiàn)階段研究表明，外泌體對腸道炎癥具有顯著的抑制作用。Deng等[27]利用M2巨噬細(xì)胞源的外泌體，成功驗(yàn)證了外泌體中miR-590-3p可抑制腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β和白細(xì)胞介素-6的誘導(dǎo)，并通過靶向大腫瘤抑制激酶1(large tumor suppressor kinase 1，LATS1)激活YAP/β-catenin調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄來減少小鼠炎癥信號并促進(jìn)小鼠腸上皮細(xì)胞再生。炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一種特發(fā)性慢性疾病，其特點(diǎn)為腸道黏膜反應(yīng)異常、腸道上皮細(xì)胞紊亂與腸道微生物環(huán)境破壞等[28]。Liu等[29]研究發(fā)現(xiàn)，人骨髓間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞源的外泌體(mesenchymal stromal cells exosomes，MSC-Exos)可顯著減輕各種IBD模型的結(jié)腸炎，保持腸道屏障的完整性。其機(jī)制可能為MSC-Exos作用于結(jié)腸巨噬細(xì)胞，而MSC-Exos處理的小鼠與未處理的小鼠相比，來自結(jié)腸的巨噬細(xì)胞對炎癥再刺激具有明顯的抵抗力。Wang等[30]利用小鼠構(gòu)建了葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate，DSS)誘導(dǎo)的IBD模型，發(fā)現(xiàn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體(hucMSC-exosomes，hucMSC-Ex)可通過抑制miR-326的類泛素化修飾在小鼠IBD模型中緩解DSS誘導(dǎo)的IBD。此外，Miyake等[31]利用小鼠構(gòu)建了壞死性小腸結(jié)腸炎(necrotizing enterocolitis，NEC)模型，在體內(nèi)與體外均驗(yàn)證了人乳源外泌體可減輕LPS誘導(dǎo)的NEC。在體外，驗(yàn)證了人乳源外泌體可減輕缺氧與LPS處理所誘發(fā)的腸道炎癥；在體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)人乳源外泌體可顯著改善NEC誘導(dǎo)的腸道黏膜損傷、腸道炎癥反應(yīng)與腸道黏液的產(chǎn)生。綜上所述，外泌體可通過調(diào)控體內(nèi)基因、蛋白質(zhì)與炎癥因子的表達(dá)，從而抑制相關(guān)炎癥信號通路，達(dá)到緩解動物腸道炎癥的目的，其中某些miRNA在外泌體緩解腸道炎癥的過程中扮演重要角色，未來可能成為治療動物腸道炎癥的切入點(diǎn)。

3 外泌體的研究方法

3.1 外泌體的分離方法

隨著外泌體相關(guān)研究的深入，其生物學(xué)功能的潛在應(yīng)用價值被不斷挖掘。外泌體的分離過程對外泌體的研究至關(guān)重要，然而外泌體的異質(zhì)性卻加大了分離外泌體的難度。此外，目前大多數(shù)的分離技術(shù)都無法將具有相似生物物理特性的脂蛋白和非內(nèi)體途徑的細(xì)胞外囊泡完全分離出外泌體，導(dǎo)致外泌體純度低。因此,如何高效分離純化外泌體，是外泌體相關(guān)研究的關(guān)鍵。目前常用的分離方法共有5種，分別為超速離心法、密度梯度離心法、聚合物沉淀法、尺寸排阻色譜法與磁珠免疫法。

3.1.1 超速離心法 超速離心法是目前應(yīng)用最廣泛的分離技術(shù)之一，超速離心法主要是根據(jù)原始溶液中各組分的大小和密度差異提取所需組分，適用于沉降系數(shù)差異較大的大劑量樣品組分的分離[32]。超速離心法主要分為3步：①低速離心去除死亡細(xì)胞與組織碎片：以300×g離心10 min，取上清；②中速離心去除大尺寸的細(xì)胞外囊泡：以2 000×g離心10 min，取上清；③高速離心分離外泌體：10 000×g離心30 min，取上清，100 000×g，在4 ℃下持續(xù)離心90 min，去掉上清，留下的沉淀PBS重懸后，再次以100 000×g離心90 min。超速離心法所提取的外泌體數(shù)量多，但耗時長，回收率不穩(wěn)定，且純度較低。因此，超速離心法多與密度梯度離心法聯(lián)合使用。Gu等[33]研究外泌體對造血功能的影響時利用超速離心法成功從細(xì)胞懸液中分離出外泌體。

3.1.2 密度梯度離心法 密度梯度離心法通常與超速離心法聯(lián)用，以提高外泌體的純度。在超速離心力作用下，使蔗糖溶液形成從低到高連續(xù)分布的密度階層，是一種區(qū)帶分離法。通過密度梯度離心，樣品中的外泌體將在1.13～1.19 g/mL的密度范圍富集[34]。 密度梯度離心法所提取的外泌體純度高，但蔗糖溶液的高黏度會降低外泌體的沉降速度，導(dǎo)致沉降時間延長。Liu等[35]利用密度梯度離心法與超速離心法結(jié)合，成功提取小鼠脂肪源外泌體。

3.1.3 聚合物沉淀法 聚合物沉淀法通常以聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)為介質(zhì)，通過降低外泌體的溶解度，在離心條件下分離外泌體。聚合物沉淀法早期應(yīng)用于從血清等樣本中收集病毒，現(xiàn)在也被用來沉淀外泌體，其原理可能與競爭性結(jié)合游離水分子有關(guān)[13]。聚合物沉淀法操作簡單，分析時間短，適用于大劑量樣品的處理，但純度和回收率較低，可能產(chǎn)生假陽性，產(chǎn)生的聚合物難以去除，不利于后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)分析。Tassetto等[36]利用聚合物沉淀法與超速離心法結(jié)合，成功提取果蠅血細(xì)胞外泌體，并利用納米顆粒示蹤分析與電子顯微鏡法對外泌體進(jìn)行鑒定。

3.1.4 尺寸排阻色譜法 尺寸排阻色譜(size-exclusion chromatography，SEC)是基于大小而非分子質(zhì)量實(shí)現(xiàn)分離大分子。該技術(shù)應(yīng)用填充多孔聚合物微球的柱子，分子根據(jù)其直徑通過微球，半徑小的分子需要更長的時間才能通過色譜柱的孔隙遷移，而大分子則從色譜柱中更早地洗脫[37]。SEC的提取速度快、操作簡單、成本低廉。所分離出的外泌體結(jié)構(gòu)完整，大小均勻，其生物學(xué)特性不會受到明顯的不利影響，但可能會摻雜其他類似大小的顆粒，導(dǎo)致純度降低。Tóth等[38]利用尺寸排阻色譜法成功從血漿中分離出外泌體。

3.1.5 磁珠免疫法 磁珠免疫法是利用外泌體表面的特異性標(biāo)記物(如CD9、CD63、CD81蛋白)，用配體磁珠與之孵育結(jié)合，即可將外泌體吸附并分離出來[39]。磁珠法具有特異性強(qiáng)、純度高、不影響外泌體形態(tài)完整等優(yōu)點(diǎn)，但磁珠免疫法不適合從大量樣品中提取外泌體，磁珠與抗體較為昂貴，保存條件苛刻，難以廣泛普及。

3.2 外泌體的鑒定方法

3.2.1 電子顯微鏡法 電子顯微鏡法是利用掃描電鏡或透射電鏡，觀察不同大小的外泌體的形態(tài)和結(jié)構(gòu)[40]。掃描電鏡是用能量為1～30 kV間的電子束，以光柵狀掃描方式照射到被分析試樣的表面上，利用入射電子和試樣表面物質(zhì)相互作用所產(chǎn)生的二次電子和背散射電子成像，獲得試樣表面微觀組織結(jié)構(gòu)和形貌的高分辨率信息。透射電鏡是把經(jīng)加速和聚集的電子束投射到非常薄的樣品上，電子與樣品中的原子碰撞而改變方向，從而產(chǎn)生立體角散射，形成明暗不同的影像。電鏡法可直接觀察外泌體的形態(tài)與結(jié)構(gòu)，用于鑒別不同類型、不同大小的外泌體，但樣品的處理與制備較為復(fù)雜。Chen等[41]研究種利用電子顯微鏡法對所分離的外泌體進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，觀察發(fā)現(xiàn)分離的外泌體均為盤狀和杯狀結(jié)構(gòu)的橢圓形小泡，直徑為30～150 nm。

3.2.2 納米顆粒示蹤分析 納米顆粒示蹤分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)是一種快速發(fā)展的熱門光學(xué)粒子跟蹤技術(shù)，用于實(shí)時監(jiān)測粒子的粒徑分布和濃度[42]。其方法為將收集的外泌體樣品用PBS稀釋后，用注射器注入納米顆粒示蹤分析儀，激光照射外泌體中的粒子，通過粒子散射光并進(jìn)行布朗運(yùn)動，可以記錄每個粒子的運(yùn)動軌跡，并可以確定粒子的擴(kuò)散率和平均速度，利用相應(yīng)的計(jì)算公式即可算出樣品的濃度與流體力學(xué)直徑[4]。該方法樣品制備簡單，檢測速度快且準(zhǔn)確，但所測外泌體直徑大小的下限為70 nm。研究表明，腸源外泌體直徑主要集中在60～150 nm范圍內(nèi)[43]，可結(jié)合蛋白質(zhì)印跡法或電鏡法檢測直徑較小的腸源外泌體。Chen等[41]利用NTA鑒定滑膜組織外泌體時發(fā)現(xiàn)，外泌體主峰值均在100～120 nm，且濃度均>1×1010/mL。

3.2.3 Western blotting法 外泌體表面有許多特異性蛋白，利用相應(yīng)的蛋白抗體與之結(jié)合，進(jìn)行SDS-PAGE分離、轉(zhuǎn)膜，進(jìn)行顯影檢測外泌體特異蛋白的表達(dá)量[44]。Western blotting法特異性高，操作技術(shù)成熟，在鑒定不同細(xì)胞來源的外泌體時，需要不同的蛋白抗體，腸源外泌體表面抗原與標(biāo)志物主要有A33抗原、膜聯(lián)蛋白A1與CD63等[11]。Chen等[41]通過Western blotting方法檢測外泌體生物標(biāo)志物蛋白CD9、CD63和Flotillin-1時發(fā)現(xiàn)，3種外泌體標(biāo)志蛋白均在檢測樣品中高度表達(dá)。

3.2.4 流式細(xì)胞術(shù) 利用外泌體表面特異性標(biāo)志物相應(yīng)的抗體進(jìn)行標(biāo)記，通過流式細(xì)胞儀檢測其陽性表達(dá)，也可對外泌體進(jìn)行驗(yàn)證[45]。如染色后的外泌體溶液加入分支聚乙烯亞胺，37 ℃孵育15 min，之后超速離心去除分支聚乙烯亞胺，然后加入金納米顆粒，輕柔重懸后置于培養(yǎng)箱中60 min，加入別藻藍(lán)蛋白DNA染料，室溫孵育15 min后用流式細(xì)胞儀檢測，APC陽性的顆粒即為所需檢測的外泌體。此法檢測速度快，可分析外泌體的大小與體積，所需樣品濃度低，但不能分辨較小的外泌體。Teresa等[46]利用流式細(xì)胞術(shù)鑒定間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞源外泌體時發(fā)現(xiàn)，樣品表面標(biāo)志性蛋白CD90、CD34與CD63等均有表達(dá)。

3.3 外泌體研究的生物信息學(xué)工具

3.3.1 EVmiRNA數(shù)據(jù)庫 EVmiRNA數(shù)據(jù)庫(http:∥bioinfo.life.hust.edu.cn/EVmiRNA)是一個專用于細(xì)胞外囊泡的miRNA數(shù)據(jù)庫，里面包括miRNA表達(dá)譜、miRNA相關(guān)藥物、miRNA調(diào)控途徑、miRNA功能以及相關(guān)出版物。收錄了17種器官或疾病中的462個細(xì)胞外囊泡miRNA測序樣本及miRNA表達(dá)圖譜。EVmiRNA提供了3個功能模塊：①不同來源(如血液、母乳等)的miRNA表達(dá)譜和樣本信息；②在不同細(xì)胞外囊泡中特異表達(dá)的miRNA，有助于生物標(biāo)志物的識別；③miRNA注釋，包括miRNA在EV中的表達(dá)，miRNA途徑的調(diào)控，以及miRNA的功能和出版物[47]。Zhang等[48]利用EVmiRNA數(shù)據(jù)庫對比B細(xì)胞源外泌體與K562白血病的外泌體中差異表達(dá)的miRNA，結(jié)果表明B細(xì)胞源外泌體中差異表達(dá)的miRNA數(shù)量為287個，K562白血病的外泌體中差異表達(dá)的miRNA為176個。

3.3.2 exoRBase數(shù)據(jù)庫 exoRBase數(shù)據(jù)庫(http:∥www.exorbase.org/exoRBaseV2/toIndex)是從人血液外泌體的RNA-seq數(shù)據(jù)分析得出的circRNA、lncRNA和mRNA的存儲庫。exoRBase數(shù)據(jù)庫旨在收集和表征人血外泌體中的所有長RNA種類來提供注釋，其中包括表達(dá)水平和可能的原始組織，識別血液外泌體中的分子標(biāo)記，并將觸發(fā)新的循環(huán)生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)以及對人類疾病的功能預(yù)測[49]。

3.3.3 ExoCarta數(shù)據(jù)庫 ExoCarta數(shù)據(jù)庫(http:∥www.exocarta.org/)是外泌體標(biāo)志物綜合數(shù)據(jù)庫，針對外泌體中鑒定出的蛋白質(zhì)和RNA分子，收錄了包括人、大鼠、小鼠、綿羊、豚鼠、果蠅、馬、穴兔、牛在內(nèi)的幾個物種共286個研究結(jié)果。除此之外，ExoCarta數(shù)據(jù)庫的一個典型特點(diǎn)就是具有外泌體蛋白動態(tài)的蛋白與蛋白之間相互關(guān)系網(wǎng)以及生物學(xué)通路[50]。Haraszti等[51]的研究中利用ExoCarta數(shù)據(jù)庫預(yù)測并成功驗(yàn)證外泌體標(biāo)志物CD81與CD9。

3.3.4 Vesiclepedia數(shù)據(jù)庫 Vesiclepedia數(shù)據(jù)庫(http:∥www.microvesicles.org/)是一個EVs分子(脂質(zhì)、核酸和蛋白質(zhì))的數(shù)據(jù)庫，目前包含來自于文獻(xiàn)中發(fā)表的341個獨(dú)立研究的35 264個蛋白，18 718個mRNAs，1 772個miRNAs、342個脂質(zhì)條目，數(shù)據(jù)庫中的細(xì)胞外囊泡包括凋亡小泡、外泌體、微粒體與微囊泡等，還可以根據(jù)物種、囊泡、分子和樣品類型瀏覽和檢索[52]。

3.3.5 exRNA Atlas數(shù)據(jù)庫 exRNA Atlas數(shù)據(jù)庫(https:∥exrna-atlas.org/exat)是細(xì)胞外RNA通訊聯(lián)盟所開發(fā)的數(shù)據(jù)庫，該信息庫包括人類和小鼠生物流體的小分子RNA測序和實(shí)時熒光定量PCR衍生的exRNA圖譜。其中包括了腦脊液、唾液、血清、血漿和尿液來源的5 309例exRNA-seq以及實(shí)時熒光定量PCR數(shù)據(jù)，同時網(wǎng)站還提供了適用于exRNA研究的分析工具[53]。

4 展 望

近年來，由于外泌體具有來源廣泛、含有多種生物活性物質(zhì)及可跨物種使用等優(yōu)點(diǎn)而成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。但當(dāng)前外泌體相關(guān)研究也存在一些問題：①目前外泌體相關(guān)研究主要集中在人疾病方面，有關(guān)外泌體對動物腸道健康的研究較少；②目前研究外泌體所使用的主要是模式動物，而以畜禽作為動物模型的研究較少；③目前外泌體的分離方法基本無法獲得單一的外泌體，所分離的樣品中包含有其他細(xì)胞外囊泡，因此需要改進(jìn)現(xiàn)有的分離方法，以便對外泌體進(jìn)行獨(dú)立研究。

外泌體可在細(xì)胞通訊、機(jī)體免疫應(yīng)答及細(xì)胞分化等過程中發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。鑒于外泌體的重要作用，進(jìn)一步探索外泌體攜帶功能成分在腸屏障功能維持、腸黏膜損傷修復(fù)、腸道疾病中的作用及相關(guān)調(diào)控機(jī)制，可為畜禽腸道健康研究提供新思路，也為畜禽腸源性問題的有效解決提供新方案。