顏廷宇，余奇東，林全女，程福建，朱建新，楊江帆

1. 福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院（福州 350000）；2. 茶學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（福州 350000）

茶葉是中國南方最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，其內(nèi)含物質(zhì)豐富，化學(xué)成分是由93.0%～96.5%的有機(jī)物和3.5%～7.0%的無機(jī)物組成，是一種天然的保健產(chǎn)品，具有抗氧化[1]、抗腫瘤[2]、降脂[3]、降糖[4-5]、降壓[6]、抗動脈粥樣硬化[7]、抗病毒[8-9]、抑菌[9-11]等多種保健和藥理作用，可用于開發(fā)保健食品、抗心血管病和抗腫瘤藥品、抗齲牙膏、天然食用色素、食品抗氧化劑以及環(huán)境凈化劑等，具有廣泛的應(yīng)用前景。

組學(xué)技術(shù)能夠獲得一個生命體、組織或器官、單細(xì)胞的全部遺傳信息、轉(zhuǎn)錄信息、蛋白及代謝產(chǎn)物，主要包括基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、脂類組學(xué)等。隨著組學(xué)技術(shù)快速在茶葉領(lǐng)域發(fā)展，多組學(xué)研究時代已經(jīng)成為當(dāng)今茶葉領(lǐng)域的又一主流和熱門研究。蘇小琴等[12]通過組學(xué)技術(shù)對茶葉的栽培育種、種質(zhì)資源特性、生理生化、加工及貯藏方向進(jìn)行講述，認(rèn)為多組學(xué)分析將會成為今后茶葉品質(zhì)機(jī)理探索的強(qiáng)大科研工具。虞昕磊等[13]講述代謝組學(xué)分析茶葉品質(zhì)形成的應(yīng)用，通過講述代謝組學(xué)技術(shù)在茶葉品質(zhì)形成及調(diào)控、基因功能注釋、栽培選育、揭示代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)理等方面應(yīng)用，認(rèn)為代謝組學(xué)在茶葉領(lǐng)域取得了重大突破。程曉梅等[14]通過對蛋白組學(xué)在茶葉抗逆性、突變體等研究方面進(jìn)行綜述，認(rèn)為植物蛋白組學(xué)發(fā)展迅速并取得了優(yōu)質(zhì)成果，對于茶葉蛋白組學(xué)的研究發(fā)展相對較慢。但隨著新技術(shù)和理論的出現(xiàn)，茶葉蛋白組學(xué)研究會更加廣泛和深入。前人多是從茶葉相關(guān)問題角度以及研究方向出發(fā)，講述組學(xué)在茶葉領(lǐng)域的應(yīng)用研究，然而對于從組學(xué)相關(guān)技術(shù)角度對茶葉研究講述得較少，相關(guān)領(lǐng)域期刊重點(diǎn)均是在茶葉各領(lǐng)域，如栽培育種、抗逆脅迫、種質(zhì)資源特性等。文章從各組學(xué)技術(shù)對茶葉科學(xué)領(lǐng)域研究進(jìn)展進(jìn)行討論。

1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在茶葉研究中的應(yīng)用進(jìn)展

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是從RNA水平研究基因表達(dá)的情況，從整體水平上研究細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄的情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的學(xué)科[15]。轉(zhuǎn)錄組受外部環(huán)境和內(nèi)部因素共同控制，形成在不同發(fā)展階段差異的基因表達(dá)情況[16-17]。轉(zhuǎn)錄組研究方法有高通量測序（high-throughput sequencing）、基因表達(dá)序列分析（serial analysis of gene expression，SAGE）、互補(bǔ)DNA擴(kuò)增片段長度多態(tài)性技術(shù)（cDNA-AFLP）、表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tag，EST）等。目前，轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在茶葉研究中非常普遍，轉(zhuǎn)錄組學(xué)在茶葉抗性機(jī)理、品種資源以及次級代謝產(chǎn)物生物合成調(diào)控機(jī)制等方面得到了應(yīng)用，并取得了重要成果[18]。

1.1 高通量測序技術(shù)

高通量測序技術(shù)是一次對幾十萬到幾百萬的DNA分子進(jìn)行序列測定[19]。在茶葉科學(xué)領(lǐng)域，高通量測序技術(shù)多用于分析茶葉mRNAs和microRNAs的表達(dá)譜[20-21]，從而探究茶葉種質(zhì)資源特性[22]、土壤菌落[23]、遺傳多樣性[24]、抗逆脅迫等[25-26]。隨著高通量測序技術(shù)的迅速成熟，轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究進(jìn)入了一個新時代。研究者將高通量測序技術(shù)應(yīng)用于研究轉(zhuǎn)錄本在組織和細(xì)胞中的種類和表達(dá)，轉(zhuǎn)錄組測序這一術(shù)語也逐漸被廣泛使用[27]。陳林波等[28]通過高通量測序篩選調(diào)控“紫娟”花青素合成相關(guān)miRNA，通過差異表達(dá)分析，篩選出可能參與調(diào)控花青素合成的4個miRNA，包括miR828a、miR845c、novel14和novel87，其預(yù)測的靶基因包括轉(zhuǎn)錄因子基因MYB4、MYB23、MYB26、MYB82、bHLH74以及4-香豆酰輔酶A鏈接酶等基因。該研究結(jié)果為進(jìn)一步開展茶樹花青素生物合成的調(diào)控機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)，同時證明高通量技術(shù)非常適合用于茶葉中有效成分的篩選。

1.2 基因表達(dá)序列分析

基因表達(dá)序列分析可以利用9個核苷酸長度的序列標(biāo)簽代表特定的mRNA轉(zhuǎn)錄物，并對所有表達(dá)基因水平進(jìn)行定性和定量分析，對檢測低豐度表達(dá)的基因高度敏感[29]。它適用于發(fā)現(xiàn)生物體中尚未被測序到基因組中的新基因，也可為識別難以檢測的開放閱讀框和新基因提供證據(jù)。因此，這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用將有助于茶葉功能基因[30]、抗逆脅迫[31]、種質(zhì)資源特性[32]等研究。近年來發(fā)展的方法可以同時分析兩個或多個試驗(yàn)樣本之間表達(dá)差異的所有基因[33-34]。陳暄等[35]通過3’/5’RACE獲得低溫誘導(dǎo)后特異表達(dá)的差異片段cDNA全長序列。所得序列全長981 bp，其開放閱讀框編碼275個氨基酸。該基因與白菜、煙草、擬南芥中的CBF基因編碼的氨基酸序列分別有74%，57%和57%的同源性。用RT-PCR方法分析低溫處理過程中CBF基因的表達(dá)情況，結(jié)果表明，CBF在低溫誘導(dǎo)4 h開始表達(dá)，8 h左右達(dá)到高峰，隨后下降，但仍維持較高水平。結(jié)果表明，CBF可能在茶樹抗寒分子機(jī)制的形成過程中發(fā)揮重要的作用。

1.3 cDNA-AFLP

cDNA-AFLP是一種結(jié)合mRNA和AFLP差異顯示技術(shù)的分子標(biāo)記，具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，如假陽性低、重復(fù)性好、多態(tài)性高、多功能性好、不需要基因組信息、對基因差異表達(dá)和轉(zhuǎn)錄信息反應(yīng)準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)[36]。cDNA-AFLP是一種被用于植物轉(zhuǎn)錄階段受生物脅迫所導(dǎo)致的基因表達(dá)。Gupta等[37]通過使用cDNA-AFLP方法鑒定茶葉因干旱脅迫而特異表達(dá)基因。聚類分析揭示了兩種類型的聚類：Ⅰ型將耐性和易感品種分開，而Ⅱ型則將樣品的時間點(diǎn)分開，這可以分為早期和晚期響應(yīng)。

1.4 表達(dá)序列標(biāo)簽

表達(dá)序列標(biāo)簽是對組織或細(xì)胞基因組進(jìn)行大規(guī)模cDNA克隆和測序獲得的表達(dá)序列標(biāo)簽。EST表示某一特定時間在組織或細(xì)胞中表達(dá)的基因。表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)量的迅速增加已成為分子標(biāo)記開發(fā)的重要資源[38]。在茶葉科學(xué)研究中一般采用cDNA文庫和EST測序技術(shù)對茶葉分子生物學(xué)進(jìn)行探索，包括EST-SSR/STR標(biāo)記開發(fā)應(yīng)用，抗性脅迫基因和次生代謝基因克隆與表達(dá)等，加快對茶葉生長代謝的探索和認(rèn)識，并取得了一些重要進(jìn)展，對研究抗逆性的分子機(jī)制具有積極意義。Taniguch等[39]通過構(gòu)建7個來自不同器官的cDNA文庫，并利用文庫生成ESTs，獲得17 458條EST序列，組裝成5 262條非基因序列。利用100對EST-SSR引物對茶葉進(jìn)行了擴(kuò)增和多態(tài)性分析。71對引物成功擴(kuò)增出EST-SSR，70個EST-SSR位點(diǎn)表現(xiàn)出多態(tài)性。EST加強(qiáng)茶樹等茶屬植物重要性狀和分子遺傳學(xué)的研究。

2 蛋白組學(xué)技術(shù)在茶葉研究中的應(yīng)用進(jìn)展

蛋白質(zhì)組學(xué)是生物研究中發(fā)展最快的領(lǐng)域之一，通過蛋白組學(xué)的研究，能快速分離鑒定與控制植物重要農(nóng)藝性狀的蛋白質(zhì)，運(yùn)用逆向遺傳學(xué)方法鑒定基因功能，再利用基因工程手段將優(yōu)良的農(nóng)藝性狀基因轉(zhuǎn)化農(nóng)作物，以進(jìn)一步提高作物產(chǎn)量、品質(zhì)和抗逆性[40]。

2.1 雙向凝膠電泳（two-dimensional gel electrophoresis，2DE）

2DE是最經(jīng)典、最成熟的蛋白質(zhì)組分離技術(shù)[41-42]，根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量，對凝膠進(jìn)行等電點(diǎn)聚集和電泳，以純化和區(qū)分復(fù)雜的蛋白質(zhì)組成。Chien等[43]通過2-DE和Nano-LC/MS/MS結(jié)合IGAE和SVM-FS的雙層特征選擇機(jī)制去識別烏龍茶原產(chǎn)地標(biāo)記的特征蛋白。準(zhǔn)確率高達(dá)為95.5%。該方法可為進(jìn)一步研究茶葉蛋白質(zhì)組學(xué)奠定技術(shù)基礎(chǔ)，也為其他經(jīng)濟(jì)作物中蛋白質(zhì)的分離鑒定提供科學(xué)依據(jù)。

2.2 雙向熒光差異電泳（two-dimensional difference gel electrophoresis，2D-DIGE）

雙向熒光差異電泳是基于雙向凝膠電泳和多重?zé)晒夥治龅姆椒?，特點(diǎn)是：每個蛋白質(zhì)點(diǎn)都有自己的內(nèi)部標(biāo)記，每個蛋白質(zhì)點(diǎn)的自動校準(zhǔn)很好地消除了樣本中的假陽性。雙向熒光差異電泳技術(shù)統(tǒng)計(jì)可靠性在95%以上。李勤等[44]運(yùn)用雙向電泳等方法研究葉綠體蛋白表達(dá)差異研究階段白化過程，探討茶葉白化的分子機(jī)制，將差異表達(dá)蛋白質(zhì)凝膠酶水解，經(jīng)酶法水解肽提取、真空濃縮、質(zhì)譜檢測等處理鑒定，樣品綠體在前期、白化期和復(fù)綠期共鑒定其中差異表達(dá)蛋白59個，質(zhì)譜鑒定蛋白22個。試驗(yàn)最終表明白化現(xiàn)象與生理功能相關(guān)。

3 代謝組學(xué)技術(shù)在茶葉研究中的應(yīng)用進(jìn)展

代謝組學(xué)在基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的基礎(chǔ)上，對某一生物體內(nèi)在特定時期所產(chǎn)生的低分子量物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析[45-46]。根據(jù)對象不同，代謝組學(xué)可分為靶向代謝組學(xué)和非靶向代謝組學(xué)[47]，反映生物體系受外界脅迫或基因變異的代謝產(chǎn)物變化情況，從而揭示其生命活動規(guī)律與調(diào)節(jié)機(jī)制。目前，代謝組學(xué)在茶葉研究中的應(yīng)用集中于研究農(nóng)藥殘留、加工工藝、環(huán)境脅迫以及地域差異等[48-49]。代謝組學(xué)中使用的分析工具包括核磁共振技術(shù)（NMR）、液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）與氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）等[50]。

3.1 核磁共振技術(shù)

核磁共振技術(shù)作為結(jié)構(gòu)分析的手段，已被廣泛應(yīng)用于化學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)等多個領(lǐng)域，NMR技術(shù)能夠在不破壞樣本的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確分析，但是不夠靈敏[51]。如果樣品為固體或半固體，測試前將樣品攪碎，加入緩沖液中提取，若樣品為液體，則樣品不需要復(fù)雜的預(yù)處理。提取后可檢出含氘代水的磷酸鹽緩沖液[52-53]。由于對樣品破壞性小，適用于復(fù)雜體系，是代謝組學(xué)研究過程中比較常見的方法[54]。在NMR共振研究中，最常用的有核磁共振氫譜（1H-NMR）、核磁共振碳譜（13C-NMR）、核磁共振氮譜（15N-NMR）、核磁共振磷譜（31P-NMR）。Mozumder等[55]的多元統(tǒng)計(jì)分析與1H-NMR分析表明，不同茶樹齡的鮮茶葉代謝差異明顯。茶氨酸、谷氨酰胺、兒茶素、沒食子兒茶素等多種茶葉代謝產(chǎn)物隨茶樹年齡的變化而變化，茶氨酸代謝在嫩茶樹和老茶樹之間存在差異。

3.2 液相色譜-質(zhì)譜

液相色譜-質(zhì)譜具有準(zhǔn)確度高、分離范圍廣、速度快的特點(diǎn)，可運(yùn)用到生物學(xué)[56]、中藥學(xué)[57]、化學(xué)[58]、臨床醫(yī)學(xué)[59]等學(xué)科之中。Zhou等[60]為了研究大葉黃茶在加工過程中的化學(xué)變化，采用高效液相色譜和LC-MS對各工序的樣品進(jìn)行了定量分析和定性分析?；贚C-MS的非靶向和靶向代謝組學(xué)分析表明，烘焙后的茶葉樣品與烘焙前相比有明顯的差異，表兒茶素和游離氨基酸的含量顯著降低，而兒茶素的含量顯著增加。Ge等[61]采用5-（diisopropylamino）amylamine（DIAAA）derivatization-UHPLC-Q-TOF/MS法對普洱茶中酚酸進(jìn)行了定性定量研究，揭示了發(fā)酵對普洱茶酚酸的影響及其潛在效應(yīng)。試驗(yàn)測定了33種酚酸，其中大部分為首次在普洱茶中檢出。熟普和生普的主要成分分別為沒食子酸和茶皂素。試驗(yàn)表明在普洱茶發(fā)酵過程中，大部分酚酸酯含量下降。液相色譜-質(zhì)譜在茶葉生化成分的定性定量、指紋圖譜以及農(nóng)藥殘留等方面的研究中得到廣泛應(yīng)用。

3.3 氣相色譜-質(zhì)譜

氣相色譜-質(zhì)譜具有分析范圍廣、準(zhǔn)確性高、速度快、對化學(xué)物的破壞性小、不需復(fù)雜操作和復(fù)雜經(jīng)驗(yàn)、適合對有機(jī)物質(zhì)和生物性物質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)[62]。現(xiàn)階段從茶葉原葉以及成品茶中已分離鑒定的茶葉芳香物質(zhì)有700余種，包括醛、醇、酮、酯、酸和含氮類等10余大類化合物。氣相色譜-質(zhì)譜常用于產(chǎn)地鑒別、指紋圖譜、農(nóng)藥殘留以及品質(zhì)鑒定等方面[63]。Wang等[64]通過SBSE/GC-MS對龍井茶中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行了提取和分析。分析鑒定出來151種揮發(fā)性化合物，醇、烷烴、醛和酯四大類化學(xué)物質(zhì)占揮發(fā)性化合物總量的54%。香葉醇是龍井茶中含量最豐富的揮發(fā)性化合物，其次是己醛和β-紫羅蘭酮。通過氣相色譜-嗅覺儀分析、氣味活性值計(jì)算和香氣重組初步試驗(yàn)，鑒定出龍井茶的主要香氣成分，包括2-甲基丁醛等14種揮發(fā)性化合物。龍立梅等[65]采用頂空固相微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜對信陽毛尖茶41份樣品進(jìn)行研究，建立了7個不同等級茶葉香氣成分的GC-MS指紋圖譜。根據(jù)所選取的23種特征香氣成分，通過判別分析，將樣品分為4組和3組。采用6種不同程度反映茶葉品級差異的指紋相似度計(jì)算方法，改進(jìn)后的指紋相似度計(jì)算方法是其中最好的。

4 脂質(zhì)組學(xué)技術(shù)在茶葉研究中的應(yīng)用進(jìn)展

脂質(zhì)組學(xué)已成為組學(xué)領(lǐng)域的一門新興科學(xué)[66-67]。脂類是生物重要的生物分子，在茶葉細(xì)胞功能中細(xì)胞凋亡、信號傳導(dǎo)、物質(zhì)運(yùn)輸和能量儲存等方面發(fā)揮著重要作用[68-69]。隨著對脂質(zhì)組學(xué)研究的不斷拓展與深入，脂質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)越來越多元化，主要包括NMR、LC-MS、GC-MS、薄層色譜（thin-layer chromatography，TLC）[70]、毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用（capillary electrophoresis-mass spectrometer，CE-MS）[71]、電噴霧電離質(zhì)譜（capillary electrophoresis-mass spectrometer，ESI-MS）[72]、“鳥槍法”（shotgun lipidomics）[73]、基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜（Matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）[74-76]等。脂質(zhì)組學(xué)要比其他組學(xué)起步較晚，最早的脂質(zhì)組學(xué)論文出現(xiàn)在2003年[77]。脂質(zhì)組學(xué)在應(yīng)用方面廣闊，分析方法越來越呈體系[78]。但與其他組學(xué)相比，脂質(zhì)組學(xué)研究不深入，導(dǎo)致研究領(lǐng)域?qū)χ|(zhì)組學(xué)的了解很少。但脂質(zhì)組學(xué)在植物上面的研究卻是有著巨大的潛力，脂質(zhì)組學(xué)的發(fā)展將促進(jìn)生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展。因此，在植物學(xué)以及茶學(xué)領(lǐng)域中開展脂質(zhì)組學(xué)的研究將為茶學(xué)發(fā)展提供一個嶄新的視角。

5 結(jié)語

如今組學(xué)研究已經(jīng)成為茶學(xué)的主流研究方向，其中轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)為基礎(chǔ)的組學(xué)技術(shù)，在茶葉學(xué)科領(lǐng)域多方面開展研究。組學(xué)已成為茶葉研究的強(qiáng)有力工具。茶葉特有次生代謝基因現(xiàn)在成為基因發(fā)現(xiàn)的活躍領(lǐng)域。組學(xué)技術(shù)應(yīng)用雖然可以應(yīng)用在茶葉生長發(fā)育、特色種質(zhì)資源、抗逆脅迫等相關(guān)研究，但是中國領(lǐng)土跨越大、氣候差異明顯、品種資源繁多、茶葉種類各異等，因此今后通過組學(xué)研究解決以上所帶來的茶葉品質(zhì)差異和基因表達(dá)帶有巨大的突破，而近些年茶葉研究結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)和蛋白組學(xué)連用等分析茶葉基因調(diào)節(jié)、特色種質(zhì)資源、抗逆脅迫，并取得了許多成果。多組學(xué)的整合使代謝組之間能夠相互驗(yàn)證，可以深入分析茶葉基因表達(dá)與各種生物系統(tǒng)的代謝機(jī)制之間的關(guān)系。總而言之，茶葉多組學(xué)研究分析必將成為解決茶葉科學(xué)現(xiàn)存問題的強(qiáng)有力工具與研究方向，對進(jìn)一步解決茶葉栽培育種、抗逆脅迫、產(chǎn)地鑒別等發(fā)揮重要作用。組學(xué)技術(shù)發(fā)展極大地推動了茶葉研究進(jìn)程。