范文艷，郝君玉，陳虹秀，劉光偉

1 河南中醫(yī)藥大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院，鄭州 450000；2 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 脾胃肝膽科，鄭州 450000

肝纖維化是指由各種致病因子所致的肝內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)過度沉積，最終導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)功能紊亂的病理過程[1]。肝星狀細(xì)胞(HSC)的激活在肝纖維化過程中起核心作用[2]。當(dāng)刺激因素持續(xù)存在時(shí)，肝纖維化進(jìn)一步可發(fā)展為肝硬化，甚至肝癌，因此，逆轉(zhuǎn)肝纖維化對慢性肝病的預(yù)后有重要意義，然而，目前并無特效的治療方法可應(yīng)用于臨床。祖國傳統(tǒng)醫(yī)藥的應(yīng)用已有數(shù)千年的歷史，其成分的復(fù)雜性決定了中藥應(yīng)用的廣泛性，使其作為抗肝纖維化的潛在候選藥物成為可能。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的重要分子機(jī)制，本文總結(jié)了與肝纖維化相關(guān)的信號通路，并探討中藥活性成分靶向信號通路的抗肝纖維化機(jī)制，以期尋求臨床抗肝纖維化治療的新靶點(diǎn)及候選藥物。

1 肝纖維化相關(guān)信號通路

1.1 Wnt/β-catenin信號通路 Wnt/β-catenin通路是一組進(jìn)化保守的信號通路，對胚胎發(fā)生和成體組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定至關(guān)重要[3]。當(dāng)細(xì)胞接收到Wnt信號時(shí)，Wnt在胞膜上與Frizzled和脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6結(jié)合，使胞漿磷蛋白被激活，活化的胞漿磷蛋白抑制糖原合酶激酶-3，阻止β-catenin的磷酸化與降解，因此，β-catenin在胞漿中積累并被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，與轉(zhuǎn)錄因子T淋巴細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子結(jié)合，刺激靶基因的表達(dá)[4]。Wnt通路參與纖維化的發(fā)生發(fā)展過程。Jiang等[5]在活化的HSC中發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路中的多個(gè)配體、受體和調(diào)節(jié)蛋白以及Wnt靶基因高度上調(diào)。而Wnt抑制因子-1可顯著抑制TGFβ1誘導(dǎo)的HSC的活化，下調(diào)活化HSC-T6細(xì)胞β-catenin的表達(dá)，從而延緩肝纖維化的進(jìn)展[6]。

1.2 TGFβ/Smad信號通路 TGFβ1被認(rèn)為是一種有效且顯著的纖維化細(xì)胞因子，在肝纖維化過程中以自分泌和旁分泌方式調(diào)節(jié)HSC的功能，而由TGFβ介導(dǎo)Smad通路是肝纖維化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[7]。TGFβ信號由一對跨膜絲氨酸-蘇氨酸激酶受體TβRⅠ和TβRⅡ介導(dǎo)，當(dāng)TGFβ與TβRⅡ結(jié)合時(shí)，TGFβ信號被啟動，隨后TβRⅡ招募并激活TβRⅠ，使其在羧基末端序列SSXS處磷酸化SMAD蛋白，磷酸化的Smad形成異聚體復(fù)合物進(jìn)入胞核，與靶基因的啟動子或增強(qiáng)子結(jié)合，并與轉(zhuǎn)錄共激活子和共抑制子相互作用，以誘導(dǎo)細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄程序[8]。當(dāng)shRNA介導(dǎo)TGFβRⅠ基因敲除時(shí)，HSC-T6細(xì)胞的激活和增殖受到抑制，纖維化ECM成分的合成/分泌水平降低[9]，表明阻斷TGFβ/Smad信號傳導(dǎo)通路可能成為肝纖維化的治療策略。

1.3 核因子-κB(NF-κB)信號通路 NF-κB是一個(gè)二聚體轉(zhuǎn)錄因子家族，越來越多的證據(jù)表明，NF-κB在HSC激活中起作用，表現(xiàn)為靜止的HSC缺乏NF-κB，而激活的HSC表現(xiàn)出與NF-κB調(diào)節(jié)基因組成性表達(dá)相關(guān)的NF-κB[10]。標(biāo)準(zhǔn)NF-κB途徑可在各種刺激下激活，包括促炎細(xì)胞因子和病原體相關(guān)分子模式，其與腫瘤壞死因子受體、Toll樣受體或IL-1受體等不同受體結(jié)合，導(dǎo)致IκB激酶復(fù)合物激活，催化NF-κB抑制劑(IκB)的磷酸化、多泛素化和降解，隨后NF-κB被釋放并發(fā)生核易位，作用于相應(yīng)的靶基因[11-12]。研究[13]發(fā)現(xiàn)，IκB激酶抑制劑柳氮磺胺吡啶干預(yù)纖維化大鼠可顯著改善纖維化病理評分，并降低α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、金屬蛋白酶組織抑制劑-1(tissue inhibitors of metallo proteinases-1，TIMP-1)和Ⅰ型膠原的表達(dá)。因此，調(diào)控NF-κB信號通路可能有益于肝纖維化的治療。

1.4 Hedgehog(Hh)信號通路 Hh蛋白是廣泛存在于多個(gè)物種的分泌糖蛋白，Hh信號通路在肝臟炎性及纖維性病變中扮演重要角色。一項(xiàng)針對非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)患者肝活檢的分析結(jié)果[14]顯示，肝損傷(即肝細(xì)胞氣球樣變、門靜脈炎癥和肝纖維化)的嚴(yán)重程度與該疾病中Hh通路的活性水平平行。Hh信號通路通過配體與12通道跨膜蛋白受體Patched1(PTCH1)和Patched2(PTCH2)結(jié)合激活細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)，存在于胞漿中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子GLI2和GLI3被激活后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，誘導(dǎo)Hh靶基因的轉(zhuǎn)錄[15]。Syn等[16]誘導(dǎo)NAFLD小鼠模型發(fā)現(xiàn)，與野生型(WT)小鼠相比，Ptc+/-(Hh信號沉默受損)小鼠表現(xiàn)出持續(xù)的Hh靶基因過度誘導(dǎo)和更多的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、肌成纖維細(xì)胞聚集和纖維化。上述研究提示，Hh途徑抑制劑的抑制及Hh靶基因高表達(dá)參與了肝纖維化損傷過程。

1.5 其他參與肝纖維化的信號通路 絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，MAPK家族包括4個(gè)亞族：ERK、p38、JNK和ERK5，分別介導(dǎo)了不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，被證實(shí)在肝纖維化中起促進(jìn)作用[17]。通過對瘦素的研究[18]發(fā)現(xiàn)，ERK途徑、p38途徑和JNK途徑均參與了HSC的活化，是瘦素促肝纖維化的主要分子機(jī)制。JAK/STAT通路中的STAT蛋白是多種促纖維化信號的整合因子，STAT基因敲除可抑制成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞，并減少膠原生成，表現(xiàn)出有效的抗纖維化作用[19]。PI3K/Akt信號通路也參與了肝纖維化的發(fā)病，高活性的磷酯酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)使促纖維化介質(zhì)增加，包括TGFβ和結(jié)締組織生長因子，誘導(dǎo)HSC的活化及ECM的沉積，選擇性抑制PI3K、阻斷下游信號分子則產(chǎn)生與之相反的效果[20]，因此，PI3K/Akt信號通路的激活驅(qū)動了肝纖維化進(jìn)程。

2 中藥活性成分的抗肝纖維化機(jī)制

提取于中草藥的某些活性成分如，酚類、萜類、生物堿類、皂苷類、黃酮類和多糖類化合物，通過靶向肝纖維化相關(guān)信號通路，產(chǎn)生抗炎、調(diào)控HSC活化及凋亡、抑制肝組織膠原沉積的作用，表現(xiàn)出巨大的抗肝纖維化潛力。

2.1 酚類

2.1.1 姜黃素(curcumin，Cur) Cur是一種酚類化合物，主要存在于姜科植物的根莖中[21]，研究[22]表明，Cur可預(yù)防服用肝毒素硫代乙酰胺的大鼠發(fā)生肝硬化，主要與Cur能減少活性氧、趨化因子和促纖維化分子的產(chǎn)生有關(guān)。王國泰等[23]通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)與動物實(shí)驗(yàn)均證明了Cur能夠顯著抑制HSC纖維相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制活化狀態(tài)下HSC的增殖，且具有劑量依賴性，并發(fā)現(xiàn)Cur的抗纖維化作用可能是通過抑制Smad2磷酸化從而阻止其入核，影響TGFβ/Smad2信號通路下游纖維蛋白基因編碼和翻譯實(shí)現(xiàn)的。

2.1.2 白藜蘆醇(resveratrol，RSV) RSV是廣泛存在于種子植物中的多酚類化合物，具有多種藥理作用[24]。M1型巨噬細(xì)胞通過分泌炎性因子、促纖維化因子等參與肝纖維化進(jìn)展，RSV通過抑制肝纖維化小鼠M1型巨噬細(xì)胞內(nèi)NF-κB通路的活性，或促進(jìn)M1型向M2型巨噬細(xì)胞極化，來延緩肝纖維化進(jìn)程[25]。此外，RSV還能夠抑制Hh通路中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子(Shh、Smo、Patched、Gli1mRNA)及下游靶基因(CyclinD1、CyclinD2、Bcl-2等)的表達(dá)，促進(jìn)HSC凋亡，抑制上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化[26]。這提示RSV主要通過NF-κB及Hh信號通路發(fā)揮抗肝纖維化作用。

2.1.3 丹酚酸(salvianolic acid，Sal)A、B Sal A、Sal B主要為唇形科植物丹參的水溶性成分，均有抗肝纖維化的功效。Sal A及Wnt通道阻滯劑均能明顯降低肝組織中α-SMA、TIMP-1、Ⅰ型和Ⅲ型膠原水平，且兩者均使β-catenin表達(dá)減少[27]，表明Sal A同Wnt通道阻滯劑具有類似的作用，即通過影響Wnt/β-catenin通路產(chǎn)生抗肝纖維化的效應(yīng)。在肝纖維化大鼠模型中，Sal A抑制了胞質(zhì)NF-κB與IκBα解離，阻斷了NF-κB的核轉(zhuǎn)移及靶基因轉(zhuǎn)錄，從基因水平上抑制炎癥因子與HSC激活標(biāo)志物的表達(dá)，防止了膠原的增生及沉積[28]。Sal B則能通過上調(diào)抗纖維化-腫瘤的pSmad3C表達(dá)，抑制促纖維化-腫瘤信號pSmad3L，在肝纖維化-肝癌的漫長進(jìn)程中起關(guān)鍵作用[29]。綜上，Wnt/β-catenin、NF-κB和TGFβ/Smad信號通路是Sal A、Sal B抗肝纖維化的主要作用機(jī)制。

2.2 萜類

2.2.1 青蒿琥酯(artesunate，ART) ART是青蒿素的水溶性衍生物，近年來，除抗瘧作用外，ART的抗纖維化作用被廣泛研究[30]。在NAFLD中，ART通過下調(diào)肝組織中NF-κB、TNFα的表達(dá)而起到抗炎作用，從而減少肝細(xì)胞的損傷，改善了肝組織纖維化的病理改變[31]。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)[32]顯示，ART作用于HSC后，可抑制miR-154對β-catenin的活化作用，抑制β-catenin靶基因轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)HSC凋亡，還可通過抑制ERK信號通路傳導(dǎo)來抑制膠原合成，對血吸蟲性肝纖維化產(chǎn)生保護(hù)作用[33]。以上研究提示，ART的抗肝纖維化功效與NF-κB、Wnt/β-catenin及MAPK信號通路密切相關(guān)。

2.2.2 熊果酸(ursolic acid，UA) UA是天然五環(huán)三萜類化合物，其抗肝纖維化功效主要表現(xiàn)為上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)、下調(diào)TIMP-1的表達(dá)，促進(jìn)ECM降解，其機(jī)制與抑制PI3K/Akt及p38MAPK通路的活化有關(guān)[34]。隨后張揚(yáng)武等[35]發(fā)現(xiàn)，UA能使HSC細(xì)胞中過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptors-γ，PPARγ)基因和蛋白表達(dá)上調(diào)，抑制HSC細(xì)胞的增殖，且具有劑量-效應(yīng)關(guān)系。PPARγ作為一種配體激活轉(zhuǎn)錄因子，可阻斷TGFβ1信號，抑制Smad磷酸化及靶基因轉(zhuǎn)錄，減少ECM合成，UA通過上調(diào)PPARγ的表達(dá)，阻斷TGFβ1/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)成為其抗纖維化的機(jī)制之一。

2.3 生物堿類

2.3.1 川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMPZ) TMPZ的化學(xué)名為四甲基吡嗪，主要來源于傘形科植物川芎的根莖、姜科植物郁金的根莖等。研究[36]顯示，20～40 mol/L范圍內(nèi)的TMPZ可呈濃度依賴性地抑制HSC DNA復(fù)制，抑制HSC的活力，使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期以抑制HSC的增殖，并通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白誘導(dǎo)活化的HSC凋亡。TMPZ還通過下調(diào)促炎因子IL-6、IL-1β，上調(diào)抗炎因子IL-10的表達(dá)，抑制JAK2/STAT3信號通路的激活發(fā)揮作用[37]。最新研究[38]表明，TMPZ作用于miR-145靶向抑制Smad3，使肝纖維化小鼠血清中透明質(zhì)酸、層粘連蛋白含量減少，產(chǎn)生抗肝纖維化效應(yīng)。

2.3.2 苦參素(oxymatrine，OMT) OMT是從豆科槐屬植物苦參中提取的一種天然生物堿，主要含有氧化苦參堿和少量氧化槐果堿，對肝纖維化有一定的治療效果[39]。氧化苦參堿通過抑制HSC中脂滴降解以提供能量的過程，并上調(diào)自噬相關(guān)蛋白Atg12、Atg5和LC3-Ⅱ表達(dá)水平來促進(jìn)細(xì)胞自噬，減少HSC的活化[40]。鮑磊等[41]使用基質(zhì)膠誘導(dǎo)靜息態(tài)HSC時(shí)發(fā)現(xiàn)，OMT可抑制高糖環(huán)境下HSC的活性，避免HSC二次激活造成的更嚴(yán)重的肝損傷及肝纖維化，而這種作用可能是OMT通過調(diào)節(jié)Wnt/Jnk信號通路實(shí)現(xiàn)的。

2.4 皂苷類

2.4.1 薯蕷皂苷(dioscin，DIO) DIO是存在于薯蕷科植物中的甾體皂苷元，研究[42]表明，DIO可抑制p38MAPK的磷酸化，抑制膽管結(jié)扎(BDL)和二甲基亞硝胺大鼠模型肝組織中HSC的激活，降低Ⅰ型、Ⅲ型膠原α1、α-SMA和纖維連接蛋白的水平，減輕肝纖維化程度。盧世云等[43]在DIO干預(yù)CCl4誘導(dǎo)肝纖維化小鼠模型中復(fù)制了這一發(fā)現(xiàn)，但有趣的是，PI3K、Akt蛋白的表達(dá)在DIO干預(yù)后顯著降低，表明PI3K/Akt通路也參與其中。因此，DIO可能通過p38MAPK與PI3K/Akt兩條信號通路發(fā)揮抗纖維化作用。

2.4.2 三七總皂苷(panax notoginseng saponins，PNS) PNS是從中藥三七中提取的有效成分，包含多種單體皂苷，如：人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1等。PNS通過上調(diào)肝組織中抗凋亡基因Bcl-2、下調(diào)凋亡基因Bax的表達(dá)，抑制損傷刺激后肝細(xì)胞過氧化凋亡，從而使匯管區(qū)結(jié)締組織減少，肝纖維化進(jìn)程逆轉(zhuǎn)[44]。最新研究[45]顯示，PNS的抗肝纖維化作用除抑制肝細(xì)胞凋亡外，還可能與減少TGFβ1信號和關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Smad3的表達(dá)、調(diào)控TGFβ1/Smad通路轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。因此，PNS或可作為抗肝纖維化的有效補(bǔ)充藥物。

2.5 黃酮類

2.5.1 槲皮素(quercetin，QUE) QUE是一種天然黃酮類化合物，廣泛存在于紫花地丁、仙鶴草、車前子、三七等中草藥中。QUE能降低核NF-κB的活化并增加胞漿NF-κB的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)p38MAPK的水平，使肝組織中膠原蛋白沉積及炎性細(xì)胞浸潤減少[46]。此外，QUE能有效降低CCl4誘導(dǎo)的膠原產(chǎn)生及聚集、降低羥脯氨酸含量，并且肝組織中Wnt和β-catenin蛋白表達(dá)水平隨QUE劑量的增加而下降[47]，提示QUE的保肝及抗纖維化作用與Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。

2.5.2 荔枝核總黃酮(total flavone from litchi，TFL) TFL是從荔枝核中提取的黃酮類化合物。TFL干預(yù)CCl4及BDL誘導(dǎo)的2種不同大鼠模型，均可明顯降低肝組織中膠原面積及血清酶學(xué)指標(biāo)，通過抑制NF-κBp65蛋白表達(dá)改善肝纖維化[48]。陳姍等[49]發(fā)現(xiàn)，TFL對HSC細(xì)胞的抑制作用具有量效關(guān)系，在濃度200 mg/L左右抑制率達(dá)最高，用ELISA法及qPCR法檢測出TFL組Smad3、Smad4含量明顯降低，TGFβ1-Smad通路拮抗因子PPARγ表達(dá)上調(diào)，證明了抑制TGFβ1/Smad信號通路是TFL抗肝纖維化的機(jī)制之一。

2.6 多糖類

2.6.1 石斛多糖(dendrobium polysaccharides，DP) DP存在于中藥材石斛的莖中，被證明能有效抑制HSC的激活而影響肝纖維化進(jìn)程[50]。腸-肝軸是腸道和肝臟間的雙向交流通道，腸肝軸的存在使肝臟易受腸道抗原的刺激而誘發(fā)一系列炎癥反應(yīng)，DP可以抑制腸道來源脂多糖對肝臟NF-κB信號通路的激活，從而減少炎癥因子的產(chǎn)生、減少膠原蛋白沉積以防止肝纖維化，還通過增強(qiáng)腸細(xì)胞的緊密連接來降低腸道屏障的通透性，維持腸道穩(wěn)態(tài)，防止腸道抗原向肝臟的募集[51]，在預(yù)防和治療肝纖維化中均有一定作用。

2.6.2 枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharides，LBP) LBP是從枸杞中提取的一種水溶性多糖。研究[52]表明，活化HSC分泌的胰島素樣生長因子-2(insulin-like growth factor-2，IGF-2)可通過與其受體結(jié)合產(chǎn)生促纖維化效應(yīng)，而LBP則能降低肝組織及血液中IGF-2的表達(dá)量，抑制IGF-2生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮。LBP還可逆轉(zhuǎn)CCl4誘導(dǎo)的NF-κB表達(dá)上調(diào)，并與肝組織中的炎癥反應(yīng)、氧化損傷及肝纖維化趨勢相一致[53]，提示LBP可能通過抑制NF-κB信號通路的表達(dá)來減輕模型大鼠肝纖維化。

2.6.3 狗肝菜多糖(dicliptera chinensis polysaccharide，DCP) DCP為爵床科草本植物狗肝菜的主要有效成分，具有保肝及抗纖維化活性。在DCP干預(yù)肝纖維化大鼠模型中，肝細(xì)胞損傷壞死、肝組織膠原纖維沉積程度隨DCP劑量的增加而減輕，MAPK通道相關(guān)蛋白、NF-κBp65蛋白的表達(dá)也有不同水平降低[54-55]，表明DCP可調(diào)控MAPK、NF-κB兩條信號通道，多水平、多環(huán)節(jié)地阻止肝纖維化進(jìn)展。

現(xiàn)將中藥活性成分靶向信號通路抗肝纖維化的機(jī)制進(jìn)行總結(jié)，見表1。

表1 中藥活性成分靶向信號通路抗肝纖維化的機(jī)制總結(jié)

3 總結(jié)與展望

肝纖維化是對肝損傷修復(fù)的代償反應(yīng)，也是肝硬化、肝癌、肝衰竭的危險(xiǎn)因素。肝纖維化病理過程復(fù)雜，多條信號通路參與其中。基于現(xiàn)代藥理學(xué)、基因組學(xué)等現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，中藥活性成分抗肝纖維化的分子機(jī)制及細(xì)胞內(nèi)信號通路的傳導(dǎo)過程被廣泛研究，并取得了良好的成果，具有廣泛的應(yīng)用前景。然而，當(dāng)前的研究大多僅停留在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)水平，中藥有效成分在臨床中仍以中醫(yī)配伍的形式存在，如何將基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果運(yùn)用于臨床，并在大型的臨床試驗(yàn)中驗(yàn)證中藥活性成分的抗纖維化作用，成為當(dāng)前肝纖維化治療中面臨的又一挑戰(zhàn)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：范文艷負(fù)責(zé)文獻(xiàn)檢索，撰寫論文；郝君玉、陳虹秀負(fù)責(zé)資料分析；劉光偉負(fù)責(zé)指導(dǎo)撰寫文章并最終定稿。