韓孟奎，李 晉，楊小華

1 蘇州大學附屬第一醫(yī)院 普通外科，江蘇 蘇州 215031；2 蘇州市第五人民醫(yī)院 檢驗中心，江蘇 蘇州 215131

肝細胞癌(HCC)是我國最常見的惡性腫瘤之一，占原發(fā)性肝癌的75%～85%[1]。在肝癌早期階段，肝切除或肝移植是標準治療手段，術(shù)后5年生存率可達70%；而對于多數(shù)失去手術(shù)機會的晚期患者，盡管采取局部消融、放療和分子靶向治療等非手術(shù)療法，肝癌的5年總體生存率僅為18%[2]。近年來，隨著對腫瘤免疫微環(huán)境(tumor immune microenvironment，TIME)研究的不斷深入，腫瘤免疫治療相關(guān)研究和臨床實驗取得較大進展，HCC晚期患者的非手術(shù)治療有了更多選擇。TIME主要由免疫細胞、基質(zhì)細胞、細胞因子和物理成分等組成，其中T淋巴細胞作為主要的免疫細胞，在TIME調(diào)控中發(fā)揮腫瘤清除、細胞因子分泌等多重效應(yīng)[3]。本文對參與肝癌TIME中T淋巴細胞功能調(diào)控的關(guān)鍵免疫細胞和信號通路的研究現(xiàn)狀及進展進行綜述，為進一步研究TIME免疫調(diào)控反應(yīng)對HCC發(fā)生發(fā)展的作用以及未來肝癌免疫治療策略提供理論依據(jù)。

1 TIME中主要T淋巴細胞亞型及作用機制

T淋巴細胞作為TIME中的關(guān)鍵免疫細胞，其中CD8+T、CD4+T、調(diào)節(jié)性T淋巴細胞(Treg)等亞群在肝癌發(fā)生發(fā)展、免疫治療等領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。CD8+T淋巴細胞是腫瘤研究領(lǐng)域最受關(guān)注的T淋巴細胞亞群。研究[4]表明，HCC腫瘤組織中CD8+T淋巴細胞可分化為細胞毒性T淋巴細胞，繼而產(chǎn)生細胞因子和細胞毒性酶(穿孔素、顆粒酶B)從而清除癌細胞并可發(fā)展為記憶T淋巴細胞。也有研究[5-6]指出腫瘤組織中高浸潤CD8+T淋巴細胞提示HCC患者高復(fù)發(fā)率和預(yù)后不良，其機制可能是在長期抑制性TIME的背景下，腫瘤特異性CD8+T淋巴細胞容易進入“T淋巴細胞耗竭”階段，表現(xiàn)為淋巴細胞活化基因3(lymphocyte activation gene-3，LAG-3)、細胞毒性T淋巴細胞蛋白4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)、T淋巴細胞免疫球蛋白3(T cell immunoglobulin-3，TIM-3)等細胞表面抑制性受體表達增加，細胞因子如IL-2、TNFα、IFNγ的產(chǎn)生和腫瘤殺傷能力受損。綜上可知，浸潤的CD8+T淋巴細胞能夠通過增強機體抗腫瘤免疫功能，緩解或控制腫瘤的進程，與HCC良好的預(yù)后相關(guān)。

除CD8+T淋巴細胞外，CD4+T淋巴細胞也被證明在控制腫瘤進展中發(fā)揮重要作用。研究[7]表明，在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的小鼠模型中，誘導(dǎo)CD4+T淋巴細胞凋亡可以促進HCC的發(fā)生。首先，CD4+T淋巴細胞能通過分泌細胞因子和激活CD8+T淋巴細胞從而發(fā)揮免疫功能。同時，幼稚CD4+T淋巴細胞可在特定細胞因子誘導(dǎo)下表達T-bet、GATA-3和Bcl6等轉(zhuǎn)錄因子，進而分化為Th1、Th2、Th9、Th17、Th22、Tfh等多種亞群[8]。此外，在抗腫瘤反應(yīng)中也可檢測到具有細胞毒性的CD4+T淋巴細胞，提示這些細胞可能在體內(nèi)表現(xiàn)出與CD8+T淋巴細胞互補的功能，共同發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[9]。綜上所述，腫瘤組織中CD4+T浸潤減少或功能受損能夠引起CD8+T淋巴細胞功能受損并與HCC預(yù)后不佳相關(guān)。

作為一類調(diào)節(jié)自身免疫反應(yīng)的T淋巴細胞亞群，Treg在HCC腫瘤免疫過程中發(fā)揮重要作用。Huang等[10]的Meta分析證明在HCC患者中，高Treg浸潤組的1、3、5年生存率比低Treg浸潤組要差。首先，Treg作為免疫抑制和抗炎細胞，可以抑制各種細胞因子(如IL-6、IL-17)對T淋巴細胞的作用[11]。其次，Treg還能通過高表達相關(guān)免疫抑制分子(LAG-3、TIM-3等)抑制效應(yīng)T淋巴細胞抗腫瘤功能[12]。當前研究表明，高Treg浸潤與HCC預(yù)后不良相關(guān)，Treg對肝癌預(yù)后調(diào)節(jié)的具體機制還有待進一步研究。

2 TIME中影響T淋巴細胞功能的關(guān)鍵免疫細胞及作用機制

樹突狀細胞(DC)作為抗原遞呈細胞，因能夠在攝取、加工和處理腫瘤抗原后特異性激活T淋巴細胞，普遍認為與HCC患者預(yù)后良好相關(guān)。然而，有研究表明CD14+CTLA-4+DC可以產(chǎn)生IL-10和吲哚胺2，3雙加氧酶(indoleamine2,3-dioxygenase，IDO)，從而抑制CD4+T淋巴細胞免疫反應(yīng)[13]，并誘導(dǎo)Treg在腫瘤區(qū)域的增殖分化進而促進HCC進展[14]。同時，Treg可誘導(dǎo)DC表達IDO，進而抑制T淋巴細胞反應(yīng)并促進免疫耐受[15]。此外，有研究[16]證實CD4+、CD8+T淋巴細胞表面的抑制受體如程序性死亡受體-1(programmed cell death protein-1，PD-1)、TIM-3、CTLA-4在腫瘤組織中的表達高于非腫瘤組織和外周血，這些抑制受體能與DC抑制配體結(jié)合，誘導(dǎo)CD4+T淋巴細胞功能異?；蛞种艭D8+T淋巴細胞的細胞毒性反應(yīng)(圖1)。因此，由于對效應(yīng)T淋巴細胞的抑制功能增加，DC也被證明與HCC患者的不良結(jié)局相關(guān)。

巨噬細胞是肝組織中重要免疫細胞，在肝癌TIME中發(fā)揮作用的主要為M1(IFNγ、脂多糖誘導(dǎo))和M2(IL-4、IL-13誘導(dǎo))兩種亞型。一方面，Yu等[17]研究表明，TIME中 M1巨噬細胞能夠通過釋放一氧化氮(nitric oxide，NO)，增加抗腫瘤因子IL-12、TNFα、IFNγ的產(chǎn)生；同時，極化的M1巨噬細胞下調(diào)免疫抑制因子IL-10和TGFβ的表達，促進CD8+T淋巴細胞和CD4+Th1細胞的招募和激活，促進抗腫瘤反應(yīng)[17]。另一方面，由趨化因子CCL2/CCR2R軸誘導(dǎo)的M2巨噬細胞可通過分泌各種抑制因子和趨化因子如IL-6、巨噬細胞炎性蛋白-1(macrophage inflammatory protein 1，MIP-1)、巨噬細胞炎性蛋白-2(macrophage inflammatory protein 2，MIP-2)抑制CD8+T淋巴細胞增殖進而促進腫瘤進展[18]。也有研究[19]表明，M2巨噬細胞可以通過上調(diào)miR-21-5p表達，激活YAP/β-catenin通路促進CD8+T淋巴細胞表面抑制性受體(PD-1、TIM-3)表達和減少抗腫瘤因子(IFNγ、IL-2、TNFα)產(chǎn)生抑制抗腫瘤反應(yīng)。同時，M2巨噬細胞也可分泌IL-10或在缺氧情況下通過ERK/NF-κB通路促進Treg在腫瘤部位積累[20]。Peranzoni等[21]研究表明巨噬細胞還可以形成相對靜態(tài)的細胞網(wǎng)絡(luò)以減少CD8+T淋巴細胞在腫瘤組織浸潤(圖1)。當前研究表明，肝癌TIME中浸潤的主要是促進腫瘤進展的M2巨噬細胞，該種巨噬細胞能夠通過影響T淋巴細胞功能來促進免疫耐受和癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移來維持HCC的發(fā)生和發(fā)展。

髓樣抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSC)被稱為腫瘤調(diào)節(jié)的關(guān)鍵免疫細胞，在HCC腫瘤免疫過程中能夠表現(xiàn)出抑制T淋巴細胞功能和促進腫瘤發(fā)生的能力。首先，癌細胞能夠產(chǎn)生大量活性氧導(dǎo)致補體C3分泌，誘導(dǎo)MDSC通過P38/MAPK途徑產(chǎn)生IL-10抑制CD8+T淋巴細胞的增殖和激活[22]。其次，MDSC可以通過PD-1/PD-L1通路、精氨酸酶-Ⅰ(Arginase-1)的表達來抑制CD8+T淋巴細胞的功能或誘導(dǎo)T淋巴細胞凋亡[22-23]。除上述致瘤活性外，MDSC還能通過IL-10、TGFβ、TNFγ誘導(dǎo)腫瘤組織中Treg的分化從而促進腫瘤發(fā)生和發(fā)展[24](圖1)。上述研究表明，MDSC在HCC中起到促進腫瘤進展的作用，充分研究MDSC-T淋巴細胞免疫抑制軸或許能為HCC靶向治療提供創(chuàng)新途徑。

B淋巴細胞作為TIME細胞成分之一，在HCC進展中的作用仍有待進一步探究。有研究[25]指出腫瘤邊緣區(qū)域CD20+B淋巴細胞的增加與HCC的良好預(yù)后相關(guān)。根據(jù)Shi等[26]的研究，浸潤B淋巴細胞可以產(chǎn)生IFNγ和IL-12p40來刺激CD8+T淋巴細胞發(fā)揮腫瘤直接殺傷作用，同時促進Th1免疫反應(yīng)而產(chǎn)生強大的抗腫瘤活性。Garnelo等[27]研究發(fā)現(xiàn)在B淋巴細胞耗盡時，CD8+T淋巴細胞上的PD-1表達上調(diào)，這表明CD8+T淋巴細胞的激活受到CD20+B淋巴細胞的調(diào)節(jié)。也有研究[28-29]表明，調(diào)節(jié)性B淋巴細胞(regulatory B cell，Breg)可通過分泌TGFβ和IL-10限制Th1和Th2的發(fā)育并促進Treg分化來負向調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，并導(dǎo)致CD4+T淋巴細胞耗竭和CD8+T淋巴細胞免疫功能受損(圖1)。多數(shù)研究顯示，B淋巴細胞對于不同亞群T淋巴細胞的調(diào)節(jié)作用主要取決于HCC TIME的變化階段，因而還需進一步深入研究相關(guān)調(diào)節(jié)機制。

圖1 HCC免疫微環(huán)境中T淋巴細胞及其相關(guān)免疫細胞的調(diào)控作用及分子機制

3 TIME中影響T淋巴細胞功能的關(guān)鍵信號通路及調(diào)控機制

Wnt/β-catenin通常位于細胞連接處和細胞質(zhì)中，該通路突變在HCC中頻繁發(fā)生。首先，趨化因子CCL5在β-catenin信號驅(qū)動中表達上調(diào)導(dǎo)致HCC TIME中DC和特異性CD8+T淋巴細胞水平顯著提高，而CCL5下調(diào)能夠引起該信號通路的免疫抑制[30]。Wnt/β-Catenin信號通路激活會擾亂CD8+T淋巴細胞的作用，誘導(dǎo)TIME中耗竭CD4+或CD8+T淋巴細胞數(shù)量增加，有助于建立腫瘤免疫抑制[31]。同時，β-catenin信號通路還可以通過上調(diào)T淋巴細胞表面抑制性受體PD-1的表達進而抑制CD8+T淋巴細胞毒性和浸潤水平[19]。Zhu等[32]研究表明，抑制Wnt/β-catenin途徑激活能夠促進HCC腫瘤組織招募更多的CD8+T淋巴細胞，顯著改善PD-1阻斷治療效果?？傊琖nt/β-catenin信號通路能夠在HCC進展中頻繁激活，并通過調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)T淋巴細胞功能來促進腫瘤進展。

TGFβ通路是一個由細胞膜到細胞核的經(jīng)典信號傳導(dǎo)過程，在HCC中，TGFβ通路能通過T淋巴細胞來調(diào)節(jié)腫瘤的進展。首先，TGFβ能夠通過調(diào)節(jié)TBET、STAT4兩種轉(zhuǎn)錄因子的表達，抑制幼稚T淋巴細胞向Th1分化或通過激活SMAD依賴途徑來介導(dǎo)Treg的分化形成促進腫瘤進展[33]。其次，TGFβ能夠通過由Smad蛋白家族中Smad3、Smad4與輔助因子TOB1共同介導(dǎo)的路徑抑制CD4+T淋巴細胞增殖；或使T淋巴細胞線粒體中Smad蛋白磷酸化，通過調(diào)節(jié)能量代謝抑制T淋巴細胞增殖和免疫功能[34-35]。此外，TGFβ還能夠通過Smad3選擇性地增強PD-1基因轉(zhuǎn)錄，上調(diào)PD-1在CD8+T淋巴細胞上的表達，誘導(dǎo)CD8+T淋巴細胞耗竭促進HCC進展[36]。另一方面，TGFβ能夠通過腫瘤相關(guān)成纖維細胞(cancer associated fibroblasts，CAF)抑制Treg在腫瘤微環(huán)境浸潤[37]。TGFβ還能夠上調(diào)αE和β7亞單位在HCC腫瘤組織中的表達，促進記憶CD8+T淋巴細胞在腫瘤組織中駐留，增強腫瘤免疫功能。研究表明，TGFβ信號通路廣泛參與T淋巴細胞的功能調(diào)節(jié)，并在HCC中主要發(fā)揮促進腫瘤進展的作用。

另外，其他相關(guān)信號通路，包括JAK/STAT、VEGF等在HCC TIME中也發(fā)揮著重要作用。研究[38]表明，約60%的肝癌組織樣本中可以檢測到磷酸化的STAT3，且多與預(yù)后不良有關(guān)。一方面，HCC腫瘤細胞和CAF分泌的IL-6可以與DC上的IL-6R結(jié)合，啟動STAT3通路的下游磷酸化級聯(lián)反應(yīng)，以抑制T淋巴細胞增殖并增加Treg的產(chǎn)生[39]。另一方面，IL-12可以通過STAT4信號通路增加抗凋亡基因的表達并能夠減少促凋亡基因在T淋巴細胞中的表達[40]。HCC腫瘤組織缺氧可以誘導(dǎo)VEGF產(chǎn)生，該通路不僅可以通過誘導(dǎo)免疫抑制受體(PD-1、TIM-3)的表達來介導(dǎo)CD8+T淋巴細胞耗竭，還可通過誘導(dǎo)Fas配體的表達降低CD8+T淋巴細胞毒性并引起細胞耗竭[41]。

TIME中與T淋巴細胞相關(guān)的信號通路在HCC發(fā)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用，所涉及機制仍然有待進一步研究。

4 基于T淋巴細胞的免疫療法在HCC中的應(yīng)用

免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint inhibitors，ICI)作為新型的腫瘤治療模式，能夠顯著改善腫瘤患者的臨床預(yù)后。目前正在廣泛研究的HCC相關(guān)免疫檢查點有PD-1、CTLA-4、LAG3和TIM-3等。一項納入262例患者的研究[42]評估了尼伏倫布(PD-1單抗)在晚期HCC患者中的效果，結(jié)果顯示尼伏倫布具有良好的安全性和有效性[客觀緩解率(objective response rate，ORR)=20%]。Agdashian等[43]研究發(fā)現(xiàn)，CTLA-4阻斷劑tremelimumab可以引起腫瘤特異性T淋巴細胞的激活以及促進CD8+T淋巴細胞腫瘤浸潤。盡管當前單一ICI療法在HCC治療中取得一定的成果，但其有效率(10%～20%)仍不能令人滿意[44]。因此，有研究[45]將CTLA-4抑制劑與PD-1抑制劑相結(jié)合用于治療HCC患者，數(shù)據(jù)表明ICI聯(lián)合治療有可能在免疫治療中實現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)，增強抗腫瘤反應(yīng)。

過繼細胞轉(zhuǎn)移療法(adoptive cell transfer-based therapies，ACT)由于能夠提供持續(xù)抗腫瘤能力，在HCC免疫療法的研究中引起高度關(guān)注。目前基于ACT的HCC治療主要包括細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞療法(cytokine-induced killer，CIK)和嵌合抗原受體修飾T細胞療法[46]。在一項評估由IL-2和CD3抗體孵育的CIK細胞作為HCC輔助治療有效性的試驗[47]中，CIK細胞治療能夠延長患者無復(fù)發(fā)生存時間，免疫治療組相比對照組為44.0 vs 30.0個月。Szoor等[48]發(fā)現(xiàn)，在小鼠肝癌異種移植模型中，GPC3-CAR-T淋巴細胞能夠有效地抑制高度表達GPC3+的腫瘤細胞生長，顯示出強大的抗腫瘤活性。以下為已注冊的采用CAR-T療法對HCC患者進行臨床實驗的項目編號：NCT02723942、NCT02395250、NCT03084380、NCT02541370、NCT03899415(ClinicalTrials.gov)。

腫瘤疫苗是利用腫瘤自身相關(guān)抗原，如AFP、GPC3、人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶等刺激免疫系統(tǒng)，促進幼稚T淋巴細胞增殖和抗原特異性T淋巴細胞產(chǎn)生，進而有效誘導(dǎo)機體對HCC產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)。Li等[49]使用腺相關(guān)病毒載體將AFP轉(zhuǎn)移到DC細胞中刺激產(chǎn)生DC衍生外泌體，這些外泌體不僅能夠促進幼稚T淋巴細胞增殖和抗原特異性T淋巴細胞產(chǎn)生，還可以有效誘導(dǎo)機體對HCC的特異性免疫反應(yīng)。一項以評價GPC3衍生的多肽疫苗療效的二期試驗[50]顯示，對比只接受手術(shù)的患者，同時接受疫苗接種和手術(shù)的HCC患者術(shù)后1年復(fù)發(fā)率下降15%，5年和8年生存率分別提高了10%和30%。

值得注意的是，盡管基于T淋巴細胞的腫瘤免疫療法提高了HCC治療的反應(yīng)率，但仍有多數(shù)患者未能從這種有前景的治療中受益。因此，迫切需要發(fā)現(xiàn)新的HCC免疫治療靶點，以提高腫瘤免疫治療效果。

5 總結(jié)與展望

綜上所述，在多種信號通路及B淋巴細胞、DC等細胞調(diào)節(jié)下，T淋巴細胞作為TIME中主要成分，對于HCC免疫耐受的形成有重要作用。隨著對TIME在HCC發(fā)生機制及治療作用中的研究不斷深入，理解與腫瘤免疫相關(guān)的T淋巴細胞亞群及其分子機制將有利于開發(fā)出新的治療策略，提高HCC患者免疫治療的有效性和安全性。但目前關(guān)于HCC TIME的研究尚未完全明晰：首先，多數(shù)已報道的數(shù)據(jù)主要聚焦于HCC外周血中T淋巴細胞亞型及相關(guān)功能，而TIME中T淋巴細胞功能由腫瘤細胞、免疫細胞、細胞外基質(zhì)和細胞因子等多種因素共同影響，因此尚缺乏對肝癌組織原位免疫細胞相互作用的機制研究。其次，肝臟是一個相對免疫豁免的器官，T淋巴細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)是腫瘤監(jiān)測和清除的核心，如何增強T淋巴細胞對肝癌細胞的特異性免疫反應(yīng)仍然有待進一步研究。最后，由于現(xiàn)有免疫療法對于癌細胞殺傷的局限性和單一性，以致HCC仍存在復(fù)發(fā)和進化的可能，目前基于T淋巴細胞的免疫療法所獲得的臨床療效仍十分有限。因此，更加深入地了解肝癌TIME，增進對不同亞群T淋巴細胞功能的認識，將對于闡明HCC免疫調(diào)控機制和研發(fā)更有效的治療手段具有重要意義。

利益沖突說明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：韓孟奎負責文獻資料收集分析，論文撰寫；李晉負責論文修改，對文章的知識性內(nèi)容做出批評性審閱；楊小華負責指導(dǎo)撰寫論文并最后定稿。