吳鑒今 黃 通 沈 旭 何天嘯 曲樂豐

頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊(carotid atherosclerotic plaque, CAP)的穩(wěn)定性減弱時(shí)，可發(fā)生脫落，引起遠(yuǎn)端顱內(nèi)動(dòng)脈阻塞，造成缺血性腦卒中。約30%～50%缺血性腦卒中由斑塊脫落誘發(fā)，因此CAP穩(wěn)定性的早期評(píng)估和有效控制意義重大[1]。近期研究[2]結(jié)果顯示，全身或局部持續(xù)感染引起的炎癥反應(yīng)可能與動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展及斑塊穩(wěn)定性減弱有關(guān)。2002年，Epstein[3]提出病原微生物負(fù)荷(pathogen burden, PB)的概念，即假設(shè)體內(nèi)感染的病原微生物種類、數(shù)目與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生相關(guān)；從多種病原微生物的整體視角探討感染在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展中的作用。人類軟骨糖蛋白-39(YKL-40)是一種新型炎癥標(biāo)志物，為肝素和殼質(zhì)酶結(jié)合的植物凝集素，可通過促進(jìn)細(xì)胞黏附、血管平滑肌遷移和小血管形成，影響CAP的形成與發(fā)展。目前，尚缺乏PB和YKL-40與CAP穩(wěn)定性的相關(guān)性研究。2013年起，本團(tuán)隊(duì)已著手建立CAP的臨床生物樣本庫(kù)，收集病原微生物感染與CAP穩(wěn)定性的相關(guān)數(shù)據(jù)。目前，樣本庫(kù)在不斷豐富中，且長(zhǎng)期隨訪納入的樣本隊(duì)列。本研究通過回顧性分析前期收集CAP患者臨床資料，旨在探索血清學(xué)和斑塊組織學(xué)PB值及YKL-40等炎癥因子與CAP穩(wěn)定性之間的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集海軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院血管外科自2013年4月—2015年3月門診收治的經(jīng)頸動(dòng)脈血管超聲明確診斷為CAP，并收錄于CAP臨床生物樣本庫(kù)的232例患者資料，其中男130例、女102例，中位年齡67歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡范圍40～85歲；②依據(jù)美國(guó)2011年多學(xué)科聯(lián)合制訂的顱外頸動(dòng)脈與椎動(dòng)脈治療指南，頸動(dòng)脈血管超聲檢查明確診斷為CAP；③患者及其家屬均知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并炎癥性疾病(如感染、自身免疫性疾病等)；②合并嚴(yán)重的肝臟或腎臟疾??；③惡性腫瘤；④意識(shí)不清或無法交流；⑤頸動(dòng)脈閉塞。根據(jù)《頸動(dòng)脈狹窄診治指南》[1]的內(nèi)容，收集符合手術(shù)指征且接受頸動(dòng)脈內(nèi)膜斑塊切除術(shù)的58例患者的頸動(dòng)脈斑塊組織學(xué)資料。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核、批準(zhǔn)(倫理號(hào)：2016SL017)。

1.2 方法

1.2.1 頸動(dòng)脈情況評(píng)估及患者分組 由具有3年及以上臨床經(jīng)驗(yàn)的同一位超聲科醫(yī)師完成相關(guān)檢查。依據(jù)世界超聲醫(yī)學(xué)與生物學(xué)聯(lián)合會(huì)制訂的共識(shí)[4]，對(duì)斑塊致頸動(dòng)脈狹窄程度進(jìn)行評(píng)估，分為輕度狹窄(狹窄程度<50%)組(89例)、中度狹窄(狹窄程度50%～69%)組(71例)和重度狹窄(70%～99%)組(72例)。依據(jù)美國(guó)心臟協(xié)會(huì)(American Heart Association，AHA)分型[5]和《中國(guó)健康體檢人群頸動(dòng)脈超聲檢查規(guī)范》[6]對(duì)斑塊的形態(tài)學(xué)、內(nèi)部回聲情況、表面纖維帽的完整性等進(jìn)行綜合分析，以評(píng)估斑塊的穩(wěn)定性，將患者分為血清學(xué)穩(wěn)定斑塊組(128例)和不穩(wěn)定斑塊組(104例)；同時(shí)，對(duì)接受頸動(dòng)脈內(nèi)膜斑塊切除術(shù)的58例患者，按照超聲和術(shù)后病理學(xué)檢查結(jié)果，分為組織學(xué)不穩(wěn)定斑塊組(21例)和穩(wěn)定斑塊組(37例)。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 一般資料 患者的年齡、性別、BMI、合并癥(高血壓病、糖尿病、冠心病)、吸煙史，LDL-C、TC、TG、高密度脂蛋白(HDL)水平。

1.3.2 血清學(xué)病原微生物及炎癥因子資料 患者禁食≥8 h，晨起空腹采血。檢測(cè)的血清學(xué)病原微生物抗體，包括EB病毒抗體(EBV IgG)、單純皰疹病毒1抗體(HSV1 IgG)、單純皰疹病毒2抗體(HSV2 IgG)、巨細(xì)胞病毒抗體(CMV IgG)、幽門螺桿菌抗體(H.pyloriIgG)、肺炎衣原體抗體(CPN IgG)。血液標(biāo)本交付檢驗(yàn)科檢測(cè)，如上述抗體水平超過Muliskan MK3酶標(biāo)儀[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]檢測(cè)數(shù)值的正常上限，則以陽(yáng)性表示。PB值的計(jì)算方法為所有陽(yáng)性抗體數(shù)目求和，例如某患者EBV IgG、H.pyloriIgG和CPN IgG陽(yáng)性，即PB值記為“3”。血清學(xué)炎癥因子包括超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)和YKL-40，采用免疫散射比濁法檢測(cè)標(biāo)本hs-CRP表達(dá)水平，應(yīng)用Human YKL-40/CHI3L1 ELISA LanpaiBio?[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]試劑盒檢測(cè)YKL-40表達(dá)水平，結(jié)果以絕對(duì)值表示。

1.3.3 組織學(xué)病原微生物及炎癥因子資料 頸動(dòng)脈內(nèi)膜斑塊切除術(shù)后30 min內(nèi)進(jìn)行斑塊的組織修整、編號(hào)和保存，以10%甲醛溶液行組織固定，并行免疫組織化學(xué)染色。檢測(cè)組織斑塊中是否存在EBV IgG、H.pyloriIgG、CMV IgG、CPN IgG的陽(yáng)性表達(dá)。組織學(xué)PB值的計(jì)算方法同血清學(xué)PB值。應(yīng)用IMAGE-PRO PLUS軟件分析組織學(xué)hs-CRP和YKL-40的表達(dá)情況，計(jì)算染色陽(yáng)性面積百分比。

2 結(jié) 果

2.1 血清學(xué)PB值及炎癥因子水平與頸動(dòng)脈狹窄程度的關(guān)系 輕度、中度、重度狹窄組間患者的年齡、BMI值，以及男性性別、各合并癥、有吸煙史的占比的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。中度和重度狹窄組的TC水平均較輕度狹窄組顯著增高(P值均<0.001)，重度狹窄組的TG較輕度和中度狹窄組顯著增高(P=0.001、0.004)，重度狹窄組的HDL較中度狹窄組顯著降低(P<0.05)。3組間血清學(xué)炎癥因子水平、各病原微生物抗體的陽(yáng)性率和PB值的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。見表1。

2.2 血清學(xué)PB及炎癥因子與CAP穩(wěn)定性的關(guān)系

2.2.1 一般資料、血清學(xué)PB值及炎癥因子比較 血清學(xué)穩(wěn)定斑塊組與不穩(wěn)定斑塊組一般資料比較的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。血清學(xué)不穩(wěn)定斑塊組HSV1 IgG陽(yáng)性率、H.pyloriIgG陽(yáng)性率、CPN IgG陽(yáng)性率、PB值及YKL-40水平均顯著高于穩(wěn)定斑塊組(P值均<0.01)；兩組hs-CRP水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表1 不同狹窄程度的CAP患者的臨床資料及血清學(xué)標(biāo)志物的比較

與輕度狹窄組比較：①P<0.001。與中度狹窄組比較：②P<0.05

表2 不同斑塊穩(wěn)定性的CAP患者的臨床資料及血清學(xué)標(biāo)志物的比較

2.2.2 血清學(xué)標(biāo)志物與CAP穩(wěn)定性的相關(guān)性分析 Spearman 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，HSV1 IgG陽(yáng)性、H.pyloriIgG陽(yáng)性、CPN IgG陽(yáng)性、PB值、YKL-40水平與CAP穩(wěn)定性均呈正相關(guān)(P值均<0.01)；其中，血清學(xué)PB值和YKL-40水平與CAP穩(wěn)定性的相關(guān)性較強(qiáng)(r=0.436、0.823)。見表3。

2.2.3 CAP穩(wěn)定性的血清學(xué)多因素分析 校正混雜因素后，以CAP穩(wěn)定性作為因變量進(jìn)行二元有序logistic回歸分析結(jié)果示， 不穩(wěn)定斑塊組血清學(xué)PB值和YKL-40水平增高均為CAP不穩(wěn)定的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見表4。

表3 血清學(xué)標(biāo)志物與CAP穩(wěn)定性的相關(guān)性分析

表4 CAP穩(wěn)定性的血清學(xué)指標(biāo)的logistic回歸分析

2.3 組織學(xué)PB值及炎癥因子與CAP穩(wěn)定性的相關(guān)性

2.3.1 一般資料、組織學(xué)PB值及炎癥因子比較 組織學(xué)不穩(wěn)定斑塊組和穩(wěn)定斑塊組的一般資料比較的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。組織學(xué)不穩(wěn)定斑塊組H.pyloriIgG陽(yáng)性率、CPN IgG陽(yáng)性率、PB值均顯著高于穩(wěn)定斑塊組,hs-CRP和YKL-40染色陽(yáng)性面積均顯著大于穩(wěn)定斑塊組(P值均<0.05或0.001)。見表5和圖1、2。

表5 不同斑塊穩(wěn)定性CAP患者臨床資料及組織學(xué)標(biāo)志物比較

A 穩(wěn)定斑塊組 B 不穩(wěn)定斑塊組圖1 CAP的hs-CRP免疫組織化學(xué)染色(脂質(zhì)池右側(cè)細(xì)胞呈棕黃色陽(yáng)性反應(yīng))示意圖(×200)

A 穩(wěn)定斑塊組 B 不穩(wěn)定斑塊組圖2 CAP的YKL-40免疫組織化學(xué)染色(斑塊基底部細(xì)胞呈棕黃色陽(yáng)性反應(yīng))示意圖(×200)

2.3.2 組織學(xué)標(biāo)志物與CAP穩(wěn)定性的相關(guān)

性分析 Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，H.pyloriIgG陽(yáng)性率、CPN IgG陽(yáng)性率、PB值、hs-CRP和YKL-40陽(yáng)性染色面積與CAP穩(wěn)定性呈正相關(guān)(P值均<0.05)；其中，組織學(xué)hs-CRP和YKL-40陽(yáng)性染色面積與CAP穩(wěn)定性的相關(guān)性較強(qiáng)(r=0.509、 0.809)。見表6。

表6 組織學(xué)標(biāo)志物與CAP穩(wěn)定性的相關(guān)性分析

2.3.3 CAP穩(wěn)定性的組織學(xué)多因素分析 校正混雜因素后，以CAP穩(wěn)定性作為因變量進(jìn)行二元有序logistic回歸分析結(jié)果示，不穩(wěn)定斑塊組組織學(xué)YKL-40陽(yáng)性染色面積為CAP不穩(wěn)定的獨(dú)立影響因素。見表7。

表7 CAP穩(wěn)定性的組織學(xué)指標(biāo)logistic回歸分析

3 討 論

據(jù)2021年發(fā)布的全球疾病負(fù)擔(dān)(global burden of disease, GBD)研究[7]統(tǒng)計(jì)，腦卒中是造成我國(guó)老年人壽命年損失的第1位病因，且發(fā)病率以每年8.7%的速率上升。流行病學(xué)研究[5]顯示，約30%～50%的缺血性卒中由不穩(wěn)定CAP脫落導(dǎo)致顱內(nèi)栓塞引起。不穩(wěn)定斑塊又被稱為“易損斑塊”,其最主要的病理特征為含較大的壞死核心，表面附以較薄的纖維帽(厚度<65 μm)，伴單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)及炎癥活動(dòng)，血管內(nèi)皮損傷及表面血小板聚集，斑塊內(nèi)破裂出血合并繼發(fā)性血栓形成和狹窄。研究[2]顯示，除高血壓、高脂血癥、吸煙、糖尿病、高同型半胱氨酸血癥等傳統(tǒng)高危因素外，急、慢性感染及其相關(guān)的炎癥反應(yīng)也是影響動(dòng)脈粥樣硬化及其斑塊穩(wěn)定性的重要因素。常見的病原微生物包括H.pylori、CPN、EBV、HSV-1、HSV-2和CMV。近年來，口腔和胃腸道病原微生物區(qū)系也成了研究熱點(diǎn)[8]。北曼哈頓研究(Northern Manhattan study, NOMAS)和福岡動(dòng)脈粥樣硬化試驗(yàn)(Fukuoka Harasanshin atherosclerosis trial, FHAT)等大型臨床試驗(yàn)證實(shí)，在其他高危因素基本相同的情況下，H.pylori感染與缺血性腦卒中的發(fā)生密切相關(guān)；也有研究者在發(fā)生腦卒中患者的頸動(dòng)脈和顱內(nèi)動(dòng)脈壁上檢測(cè)到CPN，提示其與頸動(dòng)脈粥樣硬化和缺血性腦卒中可能相關(guān)[9]。

關(guān)于感染影響CAP穩(wěn)定性的潛在機(jī)制如下。①直接影響。病原微生物以間歇性、隱匿性或頓挫性的方式直接感染血管內(nèi)皮細(xì)胞，或先感染血液中的單核細(xì)胞再進(jìn)入血管壁后轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞，促進(jìn)各種炎癥反應(yīng)的發(fā)生，降低斑塊穩(wěn)定性。表現(xiàn)為短暫性菌血癥后易損斑塊破裂，從而發(fā)生臨床事件。Smeeth等[10]對(duì)19 063例首次發(fā)作腦卒中患者的調(diào)查研究結(jié)果顯示，在診斷為呼吸道感染或尿路感染后的第1天內(nèi)，患者新發(fā)腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)最高，而在病程的隨后幾周風(fēng)險(xiǎn)逐步降低。②間接影響。感染誘導(dǎo)的訓(xùn)練性免疫(trained immunity)反應(yīng)亦是CAP形成的重要機(jī)制之一，單核或巨噬細(xì)胞在受到病原體或其產(chǎn)物的短暫刺激后，可促使機(jī)體形成一種全身性、持久性的過度激活狀態(tài)，增加CAP進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)[11]。

人體內(nèi)可同時(shí)存在多種病原微生物的感染，或在感染后發(fā)生免疫炎癥反應(yīng)，因此急需一項(xiàng)指標(biāo)，從整體角度評(píng)估感染對(duì)CAP的影響及其預(yù)后。PB概念的提出，為探討感染和炎癥反應(yīng)對(duì)CAP穩(wěn)定性的影響作用提供了新的視角。既往研究[12-13]發(fā)現(xiàn)，冠狀動(dòng)脈斑塊的組織學(xué)PB值越高，斑塊穩(wěn)定性越差，發(fā)生ACS的風(fēng)險(xiǎn)越高，而血清學(xué)和組織學(xué)PB值與CAP穩(wěn)定性的相關(guān)性尚存爭(zhēng)議。此外，不同地域人群常見的病原微生物感染的種類和比例存在較大差異。例如，中國(guó)人群的病原微生物感染以H.pylori為主，現(xiàn)癥感染率高達(dá)64%，顯著高于歐美國(guó)家[14]。經(jīng)筆者臨床實(shí)踐和分析發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)眾多CAP患者的臨床特點(diǎn)與國(guó)外報(bào)道的結(jié)果存在一定差異，主要表現(xiàn)：部分患者無傳統(tǒng)動(dòng)脈粥樣硬化的高危因素，但癥狀性、閉塞性、多支多處合并性病變的比例卻更高[15]，因此亟待探究中國(guó)人群PB值與CAP穩(wěn)定性之間的相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，不穩(wěn)定斑塊組血清學(xué)HSV1、H.pylori和CPN的IgG陽(yáng)性率，以及組織學(xué)H.pylori和CPN 的IgG陽(yáng)性率顯著增高，且血清學(xué)PB值與CAP穩(wěn)定性獨(dú)立相關(guān)。本研究初步證實(shí)了中國(guó)人群病原微生物感染與CAP穩(wěn)定性之間的相關(guān)性，并發(fā)現(xiàn)H.pyloriIgG陽(yáng)性也與CAP穩(wěn)定性顯著相關(guān)，揭示了中國(guó)人群CAP病變特點(diǎn)不同于國(guó)外的可能原因。未來臨床遇到無傳統(tǒng)高危因素的CAP患者，可行血清學(xué)病原微生物抗體檢測(cè)并計(jì)算PB值，若PB值較高，則需警惕斑塊存在不穩(wěn)定風(fēng)險(xiǎn)并予以預(yù)防性治療。

近年來，hs-CRP和YKL-40是研究感染及炎癥反應(yīng)與CAP穩(wěn)定性關(guān)系的熱點(diǎn)因子。hs-CRP為經(jīng)肝臟合成的一種非特異性炎癥標(biāo)志物，感染、炎癥、組織損傷或自身免疫反應(yīng)均可引起其水平升高。Gu等[16]的中介分析證實(shí)，血清學(xué)hs-CRP水平可能是缺血性卒中和CAP穩(wěn)定性的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)，但其準(zhǔn)確性和特異性有待進(jìn)一步探討。YKL-40又名幾丁質(zhì)酶3樣1蛋白(chitinase-3-like-1 protein)，是一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為40 000 Da的肝磷脂和殼質(zhì)鏈接的凝集素，屬于哺乳動(dòng)物甲殼質(zhì)酶樣蛋白家族，但無甲殼質(zhì)酶活性。YKL-40作為一種新發(fā)現(xiàn)的炎癥標(biāo)志物，已被初步證實(shí)在巨噬細(xì)胞活化、組織重構(gòu)和血管再生中發(fā)揮一定作用。筆者前期研究[17-18]發(fā)現(xiàn)，H.pylori感染致CAP的模型小鼠的YKL-40水平顯著增高，提示其具有評(píng)估CAP穩(wěn)定性的潛在價(jià)值。Wang等[19]檢測(cè)了1 132例CAP患者血管超聲檢查結(jié)果及血清學(xué)YKL-40水平，發(fā)現(xiàn)YKL-40水平的高低與超聲確定的CAP不穩(wěn)定性顯著相關(guān)。本研究通過多因素分析證實(shí)，血清學(xué)及組織學(xué)YKL-40 水平為影響CAP穩(wěn)定性的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，高表達(dá)患者存在更高的斑塊不穩(wěn)定風(fēng)險(xiǎn)。

本研究尚存一些局限。首先，基于單中心回顧性橫斷面研究設(shè)計(jì)，本研究樣本量有限，其結(jié)論有待多中心、更大樣本量的研究確證。其次，受限于檢測(cè)條件，本研究?jī)H選擇常見病原微生物，沒有檢測(cè)更多種類的病原微生物感染情況，故數(shù)據(jù)的全面性有待完善。最后，本研究?jī)H檢測(cè)了相關(guān)病原微生物的血清學(xué)和組織學(xué)抗體水平，沒有檢測(cè)核酸表達(dá)情況，因此僅獲得了既往感染的間接證據(jù)，尚未獲得當(dāng)前感染的直接證據(jù)。

綜上，本研究從血清學(xué)和斑塊組織學(xué)角度初步闡明了PB值及炎癥因子與國(guó)人CAP穩(wěn)定性之間的相關(guān)性，血清學(xué)PB值、血清學(xué)及組織學(xué)YKL-40水平是影響CAP穩(wěn)定性的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。因此，PB和YKL-40有望成為預(yù)測(cè)、評(píng)估CAP穩(wěn)定性的潛在靶標(biāo)。